专利名称：猪tt病毒1型cjny株基因组的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪TT病毒1型(TTVl) CJNY株(指环病毒属(AnelIovirus))的核苷酸序列，属于生物技术领域。
背景技术：
1997年日本学者Nishizawa等运用代表性差异分析技术(Itepresentational diference allalysis)，从一例非甲——非庚型输血后肝炎患者的血清中克隆到一个 500bp的片段N22。通过分子流行病学研究，证实了 N22与输血后肝炎有高度相关性。由于 该克隆来源于这名姓名为TT的输血后肝炎患者，认为该病毒与肝炎有关，故命名为TT病 毒，因TTV与经输血传播病毒(transfusion transmitted virus, TTV)英语单词的三个字 首字母缩略词巧合，因此，该病毒又称输血传播病毒。TTV是一种无囊膜的单股环状负链的球形DNA病毒，目前归指环病毒属 (Anellovirus)，直径为30nm 32nm。TTV基因组长3. 6kb 3. 8kb，分为编码区和非编码 区(UTR)两部分，非编码区特定区域内核酸序列十分保守，此区域可能与病毒的复制及蛋 白质的表达有关。TTV编码区由6个开放阅读框架(0RF1 0RF6)组成，其中ORFl和0RF2 相对研究得比较清楚，ORFl位于该基因组的589位 2898位核苷酸，编码770个氨基酸， 为病毒的衣壳蛋白，具高度亲水性；0RF2位于107位 712位核苷酸，编码202个氨基酸， 为病毒的非结构蛋白，与病毒复制有关；此外，0FR3编码剪接蛋白，为TTV所必须。TTV在各类人群中感染比例非常高，据各国对不同人群TTV感染的流行病学调查， 欧美等发达国家正常献血者的感染率约33% 76%，亚洲、非洲和南美洲等正常献血者的 感染率为90 % 100 %。TTV的感染率虽然不低，但总的来讲，绝大多数TTV感染者都表现为 无症状的携带者，无明显的肝炎生化改变，肝穿活检亦无明显病理变化。在少数有ALT (谷 丙转氨酶)升高的病例中，TTV也常被较快清除而表现为急性的或一过性的感染。但也有 报道提示TTV感染和暴发型肝炎、肝炎后肝硬化等有一定的关系。TTV感染后能否引起肝脏 炎症反应，目前报道结果各异，存在较大争议。除了人感染TTV以外，已经证实TTV感染宿主很广，包括灵长类动物(黑猩猩、类 人猿和猴)、家畜(猪、牛、羊、犬、猫、鸡)和其它动物(老鼠、兔和骆驼)。TTV主要通过输 血、性接触和粪一口等途径传播，在血液、唾液、粪便和乳汁等分泌物和排泄物中能检测 到病毒。在目前对家养动物的TTV感染研究中，针对猪TTV感染的研究较多。至今为止，在 猪体内有两种明显不同的TTV基因型被证实，分别是基因1型和基因2型(TTV1和TTV2)， 两者基因组长度及其开放阅读框的位置与人的TTV不尽相同。同人类的感染状况相似，猪 的TTV感染率也很高。猪TTV的两种基因型已经在猪血清、血浆、精液、粪便、鼻腔和直肠棉 拭中被检测到。TTV在猪群中广泛传播，同样，粪一口途径被认为是病毒传播的主要途径。由于TTV归类于圆环病毒科(Circoviridae)，而同科病毒猪圆环病毒2型(PCV2) 是目前影响猪群健康的重要传染病——猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的病原，由此引发兽 医界人士的联想，在PCV2引起的断奶后仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等临床病症的过程中，TTV或许参与了协同作用或次要角色。McKeown等认为TTV与猪的其它已知病原共感 染可导致疾病严重化。Krakowka等对2 4日龄的无菌猪接种TTV1，于1周后再分别接种 PCV2和PRRSV，对照组则分别单独接种TTV1、PCV2和PRRSV，结果TTVl和PCV2混合接种组 的仔猪中50%发展为急性PMWS感染，TTVl和PRRSV混合接种组的仔猪死亡率达到23%， 并呈现PRRS的典型病症，而对照组均未产生PRRS或PMWS的临床病变，说明TTVl可能参与 了猪的PCV2和PRRS的感染。虽然TTV在PMWS等疾病的发展中可能扮演了一定角色，但由于上述研究用的是猪 感染TTVl的病料，很难排除掉病料本身是否含有其它病原的可能。因此，对于研究TTVl的 生物学特性，必须有TTVl某一特定毒株的完整核苷酸序列和有效性的全长克隆。
发明内容
技术问题本发明的目的是确定猪TTVl JSNY毒株的完整核苷酸序列。本发明的另一目的是 确定3个基因推导的氨基酸序列。技术方案猪TT病毒1型CJNY株基因组的核苷酸序列，其特征为SEQ ID NO :1，其所编码的 蛋白质，具有序列为=SEQ ID NO :2。所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF2编码区域，其核苷酸序列为SEQ ID NO 3，所编码的蛋白质，具有序列为SEQ ID NO :4。所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF3编码区域，其核苷酸序列为SEQ ID NO 5，所编码的蛋白质，具有序列为SEQ ID NO :6。有益效果具有一种猪TT病毒1型的完整基因组，可用于以该病毒为基础的研究和开发。本发明获得了由SEQ ID NO :1、SEQ ID NO 3和SEQ ID NO 5及其生物学等效物 构成完整的核苷酸序列。这些核苷酸分子编码特定的蛋白质，且选自SEQ ID NO=U SEQ IDNO 3 和 SEQ ID NO :5。编码具有选自 SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 6 及其 生物学等效的氨基酸序列的蛋白质。可用于PCR技术直接测定病毒核酸，用于合成肽或表 达蛋白ELISA检测试剂，构建完整基因组的分子克隆还可用于拯救病毒等。
具体实施例方式考虑到猪TTVl核苷酸序列存在高度变异情况，本发明以目前公开发表的三条猪 TTVl 基因组序列(Sd-TTV31，AB076001 ； lp, AY823990 ； swSTHY-TT27, GQ120664)为基础，首 先通过扩增病毒相对保守的非编码区特定区域核苷酸序列，然后根据获得的核苷酸序列再 设计一对反向引物，用来扩增病毒完整基因组的核苷酸序列。首先，按常规的酚-氯仿法提取猪血清样品DNA，即取300 μ L血清，加入等体积的裂解缓冲液及 ο μ L的蛋白酶K(10mg/mL)，50 V消化2h，加入600 μ L Tris饱和酚， 充分振荡混勻，12，000r/min，离心IOmin ；取上层水相，加入等体积的酚氯仿异戊醇 (25 24 1)混勻后，12，OOOr/min，离心IOmin ；用酚氯仿异戊醇重复抽提一次；取上 层水相，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH 5. 2)和2倍体积预冷的无水乙醇，在_20°C放置Ih 2h以沉淀病毒DNA ；12, OOOr/min，离心lOmin，弃取上清，用70%乙醇洗涤沉淀，自然风干；用无菌三蒸水溶解沉淀，-20°C保存备用。然后，按如下程序分两阶段PCR进行猪TTVl测序第一阶段PCR:引用文献所设计的引物，即上游引物 5' -CGGGTTCAGGAGGCTCAAT-3‘，下游引物5' -GCCATTCGGAACTGCACTTACT-3‘，可扩增出 TTVl 5' UTR的大约300bp的片段。PCR体系包括0. 5 μ M的上、下游引物，0. ImM的dNTPs 和2. 5u Taq DNA聚合酶。在94°C预变性5min后进入以下循环94°C，15s ；54°C,20s ；72°C, 30s。共进行50个循环，72°C再延伸10分钟。在1. 8%的琼脂糖凝胶上电泳PCR扩增产物，切下目的条带，按DNA胶回收试剂盒 说明回收；然后将回收产物与PMD18-T载体于4°C连接过夜；转化TOPO 10感受态细胞；根 据蓝白斑筛选重组子，将重组子进行菌落PCR，将能扩增出与目的片段大小相同的重组质粒 送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。第二阶段PCR 根据第一阶段测出的序列，设计扩增猪TTVl完整基因组的引物，针 对其中一株 CJNY 毒株(http //www. ncbi. nlm. nih. gov/nuccore/256858080)，其上游引物5‘ -TCTGATTGGTCGGGAACTCAAGCCCTCATT-3 ‘，下游引物5‘ -TTTGACTCCTCCTACTTTGCATAAATTAAA-3 ‘，PCR 体系包括 0. 5 μ M 的上、下游引物，0. ImM 的 dNTPs 和 2. 5u TaKaRa LA TaqDNA 聚合酶。在94°C预变性3min后进入以下循环94°C，45s ；60°C,45s ；72°C，3min。共进行40 个循环，72°C再延伸10分钟。在1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳PCR扩增产物，切下目的条带，按DNA胶回收试剂盒 说明回收；然后将回收产物与PMD18-T载体于4°C连接过夜；转化TOPO 10感受态细胞；根 据蓝白斑筛选重组子，将重组子进行菌落PCR，将能扩增出与目的片段大小相同的重组质粒 送宝生物工程(大连)有限公司进行测序。对克隆重复测序3次，得到的序列是一致的。猪TT病毒1型CJNY株的完整基因组总共2879个核苷酸(SEQ ID NO 1)，这是首 次描述国内猪TT病毒1型的完整核苷酸序列。以目前登录的全部三株TTVl基因组序列 (Sd-TTV31, AB076001 ；lp, AY823990 ；swSTHY_TT27，GQ120664)为比对对象，使用 DNAMAN 软 件分析核苷酸和推导氨基酸序列的同源性。GQ120664全长2875个核苷酸，与CJNY株同源 性为86.7% ；AY823990全长2872个核苷酸(其中2719-2732为η)，与CJNY株同源性为 85. 46% ；ΑΒ076001全长2878个核苷酸，与CJNY株同源性为68. 14%。CJNY基因组中至少 存在三个编码区域，ORFl编码区域核苷酸517-1764，编码病毒的衣壳蛋白，415个氨基酸 (SEQ ID NO 2) ；0RF2编码区域核苷酸428-646，编码病毒复制相关的酶，71个氨基酸(SEQ ID NO 4) ；0RF3编码区域核苷酸428-1039，203个氨基酸(SEQ ID NO :6)[第一剪接的氨基 酸在残基72，核苷酸641-643]。在以下方面，SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2与目前已登录GenBank的三株 TTVl(Sd-TTV31, AB076001 ；lp, AY823990 ；swSTHY_TT27，GQ120664)的 ORFl 的核苷酸和氨
基酸序列不同。_密码子氨基酸
_AGC (826-828)SerAACACAACTCTTGGG (838-852)AsnThrThrLeuGlyAAC (856-858)AsnΑΤΑ (1000-1002)lieAGT(1078-1080)SerAGT (1147-1149)SerCTTCAAACA(1411-1419)LeuGlnThrCAA (1426-1428)GlnCCCTCGGGATAT(1432-1443)ProSerGlyTyrAAA (1450-1452)LysTAC (1456-1458)TyrAAC (1462-1464)AsnCCA(1480-1482)ProATG (1510-1512)MetAGCGCT(1576-1581)SerAlaACA(1657-1659)ThrAATGTA (1681-1686)AsnValCTG(1690-1692)LeuAGA (1702-1704)ArgTTC (1708-1710)Phe_SEQ ID NO 2与目前公开发表的三条猪TTVl基因组序列(Sd_TTV31，AB076001 ； lp，AY823990 ；swSTHY-TT27,GQ120664)编码相应634、636、638氨基酸最大的不同在于其氨 基酸数目，由于其1762位的碱基突变，使ORFl编码提前终止，仅有415个氨基酸。猪TTVl的基本生物学特性取决于基因组的特定核苷酸序列，因此，病毒间完整的 差异鉴定必须确定病毒的核苷酸序列，本发明可提供鉴定方法，该方法包括采用PCR方法 检测猪TTVl基因组DNA的核苷酸序列的一部分，以及制备蛋白用于ELISA检测。以本发明所述的TT病毒1型核苷酸序列为基础，用以合成PCR引物，提取测试样 品DNA，随后PCR扩增所选的DNA区域，在凝胶上鉴定扩增产物的大小，并用特异性核苷酸探 针通过杂交或通过测序来验证它们的特异性。以本发明所述的TT病毒1型核苷酸序列为基础，设计并选择出包含一个或多个 不同残基的肽，然后将这些肽偶联于半抗原用于免疫动物(如兔)，以产生特异性多克隆抗 体，用于“捕获ELISA”以检测该病毒节段产生的蛋白质。或根据序列，构建重组ORFl特定 区域的表达载体，用表达的蛋白建立间接ELISA，用于猪TT病毒1型的流行病学及制备单克 隆抗体的研究。具有猪TTVl基因组的完全核苷酸序列的分子克隆，可用于研究难于细胞培养的 病毒的生物学特性。以本发明所述的TT病毒1型核苷酸序列为基础，构建至少含0RF1、0RF2和0RF3在内的基因组克隆，通过转染特定细胞，拯救完整的猪TT病毒1型，也可将确定的突变引入 上述序列的一个或多个节段中，通过定点突变来研究猪TT病毒1型的生物学特性。总之，具有一种猪TT病毒1型的完整基因组，对以该病毒为基础的研究和开发是 有利的。本文将所引用的参考文献全部纳入作为参考。Nishizawa TiOkamoto H，Konishi KiYoshizawa HiMiyakawa YiMayumi M. A novel DNA virus (TTV) associated with elevated transaminase levels in posttransfusion hepatitis of unknown etiology. BiochemBiophys Res Commun. 1997，241(1) :92_7.Yokoyama H，Yasuda J，Okamoto H, Iwakura Y. Pathological changes of renal epithelial cells in micetransgenic for the TT virus ORFl gene. J Gen Virol. 2002, 83 (Pt 1) :141-50.Leary TPiErker JC,Chalmers MLiDesai SMiMushahwar IK. Improved detection systems for TT virusreveal high prevalence in humans， non-human primates and farm animals. J Gen Virol. 1999，80(Pt8) :2115_20·Kekarainen T， Sibila M， Segales J.Prevalence of swine Torque Teno virus in post-weanlng multisystemicwasting syndrome (PMWS)-afected and non-PMWS-affected pigs in Spain. J Gen Virol，2006，87，833-837.McKeown NE, Fenaux M，Halbur PG, Meng XJ. Molecular characterization of porcine TT virus, an orphanvirus，in pigs from six different countries. Vet Microbiol. 2004,104(1-2) :113_7Krakowka S，Ellis JiMacIntosh K，Ringler S S，Rings DM，Catherine Hartunian C，Yan Zhang YiAllan G. Porcine genogroup 1 torque teno virus (Gl-TTV) potentiates both PCV2 and PRRSV infections ingnotobiotic swine. Proceedings of the 20th IPVS Congress,Vollum 2 [C] .Durban :IPVS,2008,99. Kekarainen T, Martinez-GuinoL,Segales J. Swine torque teno virus detection in pig commercial vaccines, enzymes for laboratory use and human drugs containing components of porcine origin. J Gen Virol. 2009,90 (Pt 3) :648_53.Niel CiDiniz-Mendes LiDevalle S. Rolling-circle amplification of Torque teno virus (TTV)completegenomes from human andswine sera and identification of a novel swine TTV genogroup. J Gen Virol,2005,86 1343-7.
权利要求
猪TT病毒1型CJNY株基因组的核苷酸序列，其特征为SEQ ID NO1。
2.权利要求1所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的ORFl编码区域所编码的蛋白质，具 有序列为:SEQ ID NO :2ο
3.权利要求1所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF2编码区域，其核苷酸序列为 SEQ ID NO :3。
4.权利要求3所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF2编码区域所编码的蛋白质，具 有序列为:SEQ ID NO :4ο
5.权利要求1所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF3编码区域，其核苷酸序列为 SEQ ID NO :5。
6.权利要求3所述猪TT病毒1型CJNY株基因组的0RF3编码区域所编码的蛋白质，具 有序列为:SEQ ID NO :6ο
全文摘要
本发明公开了猪TT病毒1型CJNY株的完整核苷酸序列，属生物技术领域。该序列长2879个碱基。与已报道的三株完整基因组序列的TT病毒1型(GQ120664、AY823990和AB076001)的核苷酸同源性为68.1％-86.7％，最大不同在于该序列所编码的病毒核衣壳蛋白仅有415个氨基酸，与其它三株相比大大减少。这些序列可用于特异的检测技术研究与开发，以及通过构建感染性分子克隆用于病毒生物学特性的研究。
文档编号C12N15/34GK101838657SQ20101012778
公开日2010年9月22日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者何孔旺, 俞正玉, 倪艳秀, 吕立新, 周俊明, 周萍, 张雪寒, 李成仁, 沈江萍, 温立斌, 茅爱华, 郭容利 申请人:江苏省农业科学院