一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法

专利名称：一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法
技术领域：
本发明属于水产生物DNA分子遗传标记技术领域，特别涉及一种拟穴青蟹微卫星 分子标记的构建方法。
背景技术：
微卫星DNA(Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由1-6个 核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats, SSR)，是近十几年发展起来的一 种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、呈共显性遗传及 操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图 谱构建及QTL定位等领域中。国内外学者已在大多数的重要水产养殖动物中开发了微卫星标记。如Guo等开 发了大黄鱼的6个多态微卫星标记；李绍戊等开发了团头鲂的19个微卫星标记；马洪雨等 报道了圆斑星鲽的40个多态微卫星标记和条斑星鲽的31个多态微卫星标记；Wang等开发 了太平洋牡蛎的17个EST来源的多态微卫星标记；Elf strom等开发了扇贝的16个微卫星 标记；Yap等筛选到梭子蟹的8个多态微卫星标记；An等筛选了中华绒螯蟹的9个微卫星标 记。这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁 图谱构建等研究中。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)属节肢动物门(Arthropoda)、甲壳纲 (Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、青蟹属(Scylla)，主要分布于 太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，在我国主要分布于东南沿海各省，以福建、广东 和海南最多，是我国重要的养殖蟹类之一。为了鉴定和保护在我国广泛分布的青蟹资源，马 凌波等对我国东南沿海的青蟹的线粒体进行了研究，结果证实在我国广泛分布的青蟹绝大 多数为拟穴青蟹，而不是先前认为的锯缘青蟹。目前，可利用的拟穴青蟹微卫星标记数量非 常少，严重限制了相关遗传学研究的发展。

发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种拟穴青蟹微卫星分子标记及其构建方法 和应用，该方法具有操作简单，快速、准确、灵敏等优点，一次可获得几百、甚至上千条微卫 星序列，并且所获得的大多数的微卫星序列均可设计引物，在拟穴青蟹遗传变异分析、种质 资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中具有良好的应用前景。本发明的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，包括(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释备用；(2)基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；(3)扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；(4)扩增产物的克隆及测序；(5)序列分析及微卫星特异引物设计；
(6)使用引物对拟穴青蟹不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩 增；(7)使用6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；(8)根 据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得20个多态性的 微卫星标记，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。所述步骤(1)中的拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释，包括以下步骤剪取拟穴青 蟹少量肌肉组织100-150mg，置于500 μ 1组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋 白酶K和终浓度为100 μ g/ml的RNaseA，55°C消化2_3个小时；用酚氯仿异戊醇混合 液按体积比为25 24 1混合，抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70% 乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为lOOng/μ 1，于-20°C保存备 用。所述步骤(2)中的基因组DNA的酶切是利用限制性内切酶MseI消化DNA，于37°C 酶切3个小时；之后于70°C保温15分钟使内切酶失活；所述的连接街头是在酶切片断两端连接上序列特异的接头，其序列为oligo A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，；oligo B :5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，，连接反应在 16°C进行 10 个 小时，之后将连接产物稀释10倍待用；所述的预扩增是利用接头特异性引物通过PCR扩增，达到富集连接产物的目的， 预扩增引物MseI-N的序列为5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ；用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测 预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。所述步骤(3)中的扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增，包括以下步骤将 步骤(2)回收的预扩增产物与生物素标记的微卫星重复探针((CAA)ltl和(GATA)8)进行杂 交，再利用该杂交产物与磁珠杂交，然后将非目的片断洗脱，从而获得微卫星重复片断，最 后利用PCR扩增法富集微卫星重复片断。所述步骤(4)中的克隆及测序，包括以下步骤首先是将PCR富集片段连接到 PMD19-T载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，接种到LB培养基中生长，再利 用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的阳性克隆 并进行测序。所述步骤(5)中的序列分析及微卫星特异引物设计，包含以下步骤首先利用生 物学软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后使用软件 SSRHUNTER 1. 3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为2_5个碱基重复单元、重复 次数> 4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的 序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件Primer Premier 5. 0对含有完整侧翼 序列的微卫星序列进行引物设计；引物应符合以下标准(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60%之间； (3)退火温度在48-60°C之间；(4) PCR产物的预期长度在130_350bp之间；其中，所述的拟穴青蟹微卫星分子标记及其对应的特异引物序列，如下所示ScpOl 长度 337bpstaaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacccacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg
ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactacctacaggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccacactcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtacacattggccta tccatccaca actacaacct cccatta
ScpO 1标记的特异弓丨物序列F:tcataacgccatccttctatR:tgggaggttgtagttgtgga ；Scp02 长度 243bpsaacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaacacaacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatgaagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagcaggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcacattaScp02标记的特异引物序列F:gcaacacaatataatgcaatgtaaR:agcgtgacctgctgatagg ；Scp03 长度 298bpstaataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaacaacctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccaccttctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgcatgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggtggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcattaScp03标记的特异引物序列F:tggtcctcaacaacctcattR:atgacgtaccacctaccattct ；Scp04 长度 509bpstaatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaacattaccatta tcatcaccag C3-CC3-CC3-3-CaattaCCatCactatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaacaccagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctcctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaacgtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtggtgac Bgcgggtgtg gactcctgtg tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgcacacacaagg agtagcgagg cgcgagttaScp04标记的特异引物序列F:ttcctggacttgcttgcgtaaaR:gcgcctcgctactccttgtg ；Scp05 长度 334bpstaaccactca accaccccca atccacttac ccatccattc aaccacccgt ccactcacac catccatcta tccacacaac tattcacact catccaccca tctaacaaca cacctaccta aaccatccac ttactcttcc atccacattt atgaatgcag ctacccattc acacacccct Scp05标记的特异引物序列 F:cagccattgactcctatcga R:tgcattcatgtacggctaaa ； Scp06 长度 237bps
C3.3.C3.3.C3.3.C Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.
tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta Scp06标记的特异引物序列 F:ccttgttttccttccttcatct R:gagagaagcctgcagttagtcat ； Scp07 长度 301bps
Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q. C3.3.C3.3.C3.3.C
aggagaaaac aataataact actactacta ttaatatttc ttttactgga acaactgcca ccaccaccac caccagcaca taccaatacc atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt a
Scp07标记的特异引物序列
F agcaacagcaggagaaaacaat Rcctattatgaacagttcgtggg ； Scp08 长度 271bps taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca attccatgta ttcttcttct tcttcttctt gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggt tttgctttgg ttttgagtca taataagtgg ScpOS标记的特异引物序列 F:cgctctttgtattgtgattcc R :atgactcaaaaccaaagcaaa ； Scp09 长度 315bps taagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt
caatccatcc acactctaca ctcatccacc caactcattc caatccaccc ccat
agccattgac cacacattca tacccctcta atccatccat atccattcat
C 3.3. C 3.3. C 3.3. C
ccactattat attcacacag actgcaggct
Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.
ctactactac atactaccac agcagtagtg cataataggg
ttttaacagt cttcttgttc acttatgaaa ttagctcagt t
tcctatcgat tccatccatc ctgaccagcc ccatctatcc ttagccgtac
tttcctgaca ttcccttata acagacagac tctctcactc
catcttttcc gtagtggtgg agacagacaa aggctta
Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.
tattaaattt caccaccacc aagaggcacg gcaatcaatt
cagcaacagc attactacta accaccagca gttacataac agtgcatatt
tgtgcgctct ttgttcttgt agctctcgtt ttttactttc
ttgtattgtg tcttcttatt ttgtgtcttg gtttgtgtct
tgatagggta gatgacacct cgccaggatt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat
ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttcttttctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctctctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgttgttgttgttg ttgttScp09标记的特异引物序列FcagtattgaaatgatagggtagatgacRcggtaacaacggcgagaac ；ScplO 长度 274bpstaacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagtgcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatttgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatgatacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtcttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact tacaScplO标记的特异引物序列F:acaactagcgccgcccctcgR:acccagccttaagacctcgc ；Scpll 长度 262bpstaacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctctctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttccttccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctcttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttcttttctctca acttgtatct taScpll标记的特异引物序列F:ttcatcttccatccgatattRgaaccagataaaataatgcaaa ；Scpl2 长度 294bpstaataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaacctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacacacacacacac acacacacac acgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtttttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgattgatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gateScpl2标记的特异引物序列F:cacccatccaagaactaaccR :caatcacgagcaggtgttaa ；Scpl3 长度 273bpstaagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgtggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagtgagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacacaC3.C3.C3.C3.C3. ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac
tcctgtggta tagaagtctt aattatactg ttaScpl3标记 的特异引物序列F:tgtttggattcttcttttcagR:taccacaggagtacagggtg ；Scpl4 长度 359bpstaaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaagtttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacacacgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaattaattgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctgagatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaacaagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggttaScpl4标记的特异引物序列FttgtgaaaacgtaagacagacR:aattacaactattgcatgagg ；Scpl5 长度 422bpstaacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtattgtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgagatggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtgtgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagtgaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcggcccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagtattacaatgac gtgagggtac gggatgagta C 3. C C 3. C 3.3. C 3. ttcataacca gctaattgattaScpl5标记的特异引物序列FtaacacagactacgaatgtagacttR:gcatagccaatgattgattaga ；Scpl6 长度 262bpstaactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgtgtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttccctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaactaactttct tgtagatgct taScpl6标记的特异引物序列F :aaacccaagtaactgaggagR gtagggaaaggtgtaccaag ；Scpl7 长度 187bpsagatagacag acacagaggc atactgaaac acaaataata ggccattcag tcagtccaattgacatatat acataccttc tgacaaacac acagatgcag agagataactacacacacac acacacacac acacacacac acacacacac aactccggta tgcgaatgccBggtgtggct aatgagtccc ggaggaggaa gaaagaggaa gtgatggagg gaagaagaaa aggaaaaaaa gaagagaagg gctttgcgtt ggggcaggcg
tcccaggcgc tggaggaagg agaaggaaag aaagctgcaa ggaggagaga gagagagaggacgttaScpl7标记的特异引物序列F:agatagacagacacagaggcatactR:taacgtcggcattcgcatac ；Scpl8 长度 307bpstaactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctccacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaaaagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaaaaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaaggatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactctactttctcScplS标记的特异引物序列F :cccttacctgaagatgctR :caacgcaaagctagagtg ；Scpl9 长度 179bpstaagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggccccgaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaagataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggatScpl9标记的特异引物序列F:ggcgatgattattggttggcR:ttcacccgattcgtcctttt ；Scp20 长度 155bpstaacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatatacatgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggggggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgtScp20标记的特异引物序列FtggatataaagtggaactgatggcgR :cacaccgctcccataccccttο所述步骤(6)中的PCR扩增的反应体系总体积为25μ 1，包括基因组DNA模 板1μ 1、上下游引物终浓度均为0.4μπιΟ1/1、Μβ2+终浓度为1.5mm0l/L、dNTP终浓度为 0. 2mmol/L、Tag DNA聚合酶0. 75U、IXPCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25 μ 1 ； 反应程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72°C延伸 50秒，30个循环；最后于72°C延伸7分钟。所述步骤(7)中的检测步骤包括将步骤(6)的PCR产物于95°C变性后，上样3μ 1 于6%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，再经染色、显色后获得了拟穴青蟹的PCR产物电泳图像。本发明的一种拟穴青蟹微卫星分子标记应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源 保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域。本发明的通过拟穴青蟹两种微卫星富集文库(CAA)n、(GATA)n的构建，阳性克隆的
aagtggaact gatggcgact ctgtgtgagg ggcgtgtgag鉴定及测序，序列分析及微卫星引物的设计，最终获得20个扩增条带清晰的多态性的微卫 星标记，将这20个多态性标记用于拟穴青蟹不同地理群体或群体内不同个体的遗传学分 析，获得拟穴青蟹的遗传变异的多态性图谱。有益效果本发明提供了一种可快速、大量的制备拟穴青蟹的微卫星标记，一次可获得几百、 甚至上千条微卫星序列，并且所获得的大多数的微卫星序列均可设计引物，具有操作简单， 快 速、准确、灵敏等优点，一周内可完成一个过程，大大提高了构建微卫星标记的效率，在拟 穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中 具有良好的应用前景。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人 员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定 的范围。实施例11、拟穴青蟹基因组DNA的提取剪取拟穴青蟹少量肌肉组织约100-150mg，置于500 μ 1组织提取液(lOmmol/L Tris-CI,pH8. 0 ；IOOmmo 1/L EDTA，pH8. 0 ；IOOmmo 1/L NaCl ；0. 5% SDS)中剪碎，加入蛋白酶 K (终浓度为20mg/ml)和RNaseA (终浓度为100 μ g/ml)，充分混勻，55°C消化2-3个小时至 澄清；用酚氯仿异戊醇混合液(体积比为25 24 1)抽提两次；然后用2倍体积的 无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50 μ L TE(10mmol/L Tris-HCl, ρΗ8. 0 ； 10mmol/L EDTA, pH8. 0)中；最后将 DNA 浓度稀释为 IOOng/μ 1，并保存在 _20°C备 用；2、拟穴青蟹基因组DNA的酶切、连接利用限制性内切酶MseI对拟穴青蟹基因组DNA进行消化，酶切反应总体积为 30μ 1，包括6μ 1 的 IOXbuffer R with BSA、6U 的内切酶 Msel、10 μ 1 的基因组 DNA 及 13. 4μ 1的灭菌双蒸水，37°C水浴消化约3小时，之后70°C保温15分钟使内切酶失活；连接步骤如下首先将合成的单链寡核苷酸oligo A(0lig0 A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，)和 oligo B(5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，)稀释为浓度 IOOymol/ L,然后等体积混合，再稀释为浓度20 μ mol/L,于94°C变性5分钟，缓慢冷却至室温，-20°C 保存备用；连接反应的总体积为17. 5 μ 1，包括1. 5μ 1的10 X T4DNAbuf f er、2. 5 μ 1的接头、 10. 5U的T4DNA连接酶及10 μ 1的酶切产物，16°C连接约10小时，之后将连接产物稀释10
倍待用；3、预扩增预扩增引物MseI-N 的序列为5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’，PCR 反应体系为 20 μ 1， 包括10Χ连接产物5 μ 1、引物终浓度均为0. 4μ mol/L、Mg2+终浓度为1. 5mmol/L、dNTP终 浓度为0. 2mmol/L、Tag DNA聚合酶1U、1 XPCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为20 μ 1 ；PCR反应程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒、53°C退火50秒、72°C延伸1分 钟，25个循环；最后于72°C延伸7分钟。利用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并 回收大小在250-800bp之间的扩增产物；4、回收产物与生物素标记的微卫星探针杂交 委托生物公司合成两种微卫星寡核苷酸探针，用生物素在其5’端进行标记。两种 探针序列分别为5，-CAACAACAACAACAACAACAACAACAACAA-3，和 5，-GATAGATAGATAGATAGATA GATAGATAGATA-3，；将两种探针稀释为浓度40 μ mol/L,杂交体系为96 μ 1，包括70 μ 1的杂 交液(6XSSC+0. SDS)、6 μ 1的探针及20 μ 1的上述预扩增回收产物，杂交反应在PCR仪 中进行，程序为94°C变性5分钟，65°C退火30分钟，10°C暂时保存；5、磁珠杂交及洗脱首先用杂交液(6 X SSC+0. 1 % SDS)对磁珠进行仔细的洗涤3次，每次3分钟；然 后将上述杂交混合液与磁珠混合，在室温下杂交约30分钟，期间不断的重悬磁珠；最后对 磁珠进行洗涤，目的是去除非目的片段及杂质。洗涤步骤如下首先用400 μ 1的杂交液 (6 X SSC+0. 1 % SDS)清洗磁珠3次，每次3分钟；然后用400 μ 1的2 X SSC清洗磁珠3次， 每次3分钟；最后用400 μ 1的1 X SSC清洗磁珠2次，每次3分钟；用磁力架吸附磁珠并去 除液体后，向磁珠中加入50 μ 1的TE溶液，在95°C水浴中变性5分钟后，快速收集TE溶液；6、杂交后的PCR扩增对磁珠杂交后的洗脱产物进行PCR扩增，其反应体系为20μ 1，包括洗脱产物 5 μ 1、预扩增引物终浓度为0. 4 μ mol/L、Mg2+终浓度为1. 5mmol/L、dNTP终浓度为0. 2mmol/ L、Tag DNA聚合酶1UUXPCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为20 μ 1 ；PCR反应程 序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒、53 °C退火50秒、72 °C延伸1分钟，25个循环 ’最 后于72°C延伸7分钟，利用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的浓度；7、T载体连接将上述PCR扩增产物连接到T载体中，连接体系为ΙΟμΙ，包括solution I 5. 0μ l、pMD19-T 载体(TaKaRa) 1· 0μ 1 及 PCR 扩增产物 4. 0 μ 1，4°C 过夜；8、克隆、测序将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，使用载体通用引物(M13-47 5，-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3，；M13-48 :5，-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3，)对克隆进 行PCR鉴定。PCR反应体系为25 μ 1，包括菌液1 μ 1、上下游引物终浓度均为0. 4 μ mol/L、 Mg2+ 终浓度为 1. 5mmol/L、dNTP 终浓度为 0. 2mmol/L、Tag DNA 聚合酶 IUU X PCR buffer, 最后补充灭菌双蒸水至总体积为25 μ 1 ；PCR反应程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30 秒、55 °C退火50秒、72 °C延伸50秒，25个循环；最后于72°C延伸7分钟。最后，挑选插入片 断长度在250-800bp之间的阳性克隆，用ABI3730测序仪进行测序；9、微卫星引物设计首先利用生物学软件DNAMAN 4. 0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同 的序列；然后使用软件SSRHUNTER 1. 3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为2_5 个碱基重复单元、重复次数> 4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据 库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件PrimerPremier 5. 0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计。
引物应符合以下标准(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60%之间； (3)退火温度在48-60°C之间；(4斤0 产物的预期长度在130-35(^ 之间，引物信息详见表 1 ；10、微卫星标记的PCR扩增利用上述微卫星 引物对拟穴青蟹群体进行PCR扩增，其反应体系为25 μ 1，包括 基因组DNA模板1 μ 1、上、下游引物终浓度均为0. 4μ mol/L、Mg2+终浓度为1. 5mmol/L、dNTP 终浓度为0. 2mmol/L,Tag DNA聚合酶1UUXPCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为 25 μ 1。PCR反应程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒、引物特异的退火温度(表1) 退火50秒、72°C延伸50秒，30个循环；最后于72°C延伸7分钟，4°C保存备用；11、PCR产物的电泳检测向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98. 0%甲酰胺，IOmmol/L EDTA，0. 25% 溴酚蓝，0. 25% 二甲苯氰)，于95°C变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μ 1于6%的变性 聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI，电泳液为IX TBE^gS 35-40V/ cm,电泳约1-1. 5小时。电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为首先用70%乙醇固定10分钟，蒸 馏水洗5分钟；然后用1. 5%。硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2%的 NaOH+4%。的甲醛)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了拟穴青蟹遗传 变异的多态性图谱。表1本发明所构建的拟穴青蟹的20个微卫星标记
权利要求
一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，包括(1)拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释备用；(2)基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；(3)扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；(4)扩增产物的克隆及测序；(5)序列分析及微卫星特异引物设计；(6)使用引物对拟穴青蟹不同地理群体或群体内个体的基因组DNA进行PCR扩增；(7)使用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；(8)根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，共获得20个多态性的微卫星标记，从而获得拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱。
2.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(1)中的拟穴青蟹基因组DNA的提取并稀释，包括以下步骤剪取拟穴青蟹少量肌肉 组织100-15011^，置于50(^1组织提取液的中剪碎，加入终浓度为20mg/ml的蛋白酶K和终 浓度为100yg/ml的RNaseA，55°C消化2-3个小时；用酚氯仿异戊醇混合液按体积比 为25 24 1混合，抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和 自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为IOOng/ μ 1，于_20°C保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(2)中的基因组DNA的酶切是利用限制性内切酶MseI消化DNA，于37°C酶切3个小 时；之后于70°C保温15分钟使内切酶失活；所述的连接街头是在酶切片断两端连接上序列特异的接头，其序列为oligo A 5，-CTACTCAGGACTCAT-3，；oligo B :5，-GAGTCCTGAGTAGCA-3，，连接反应在 16°C进行 10 个 小时，之后将连接产物稀释10倍待用；所述的预扩增是利用接头特异性引物通过PCR扩增，达到富集连接产物的目的，预扩 增引物MseI-N的序列为5’ -GATGAGTCCTGAGTAA-3’ ；用1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩 增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。
4.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(3)中的扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增，包括以下步骤将步骤(2)回 收的预扩增产物与生物素标记的微卫星重复探针((CAA)ltl和(GATA)8)进行杂交，再利用该 杂交产物与磁珠杂交，然后将非目的片断洗脱，从而获得微卫星重复片断，最后利用PCR扩 增法富集微卫星重复片断。
5.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(4)中的克隆及测序，包括以下步骤首先是将PCR富集片段连接到pMD19-T载体 中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞ToplO中，接种到LB培养基中生长，再利用载体通用弓I 物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-800bp的阳性克隆并进行测序。
6.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于 所述步骤(5)中的序列分析及微卫星特异引物设计，包含以下步骤首先利用生物学 软件DNAMAN 4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后使用软件 SSRHUNTER 1. 3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为2_5个碱基重复单元、重复 次数> 4次；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件Primer Premier 5. 0对含有完整侧翼 序列的微卫星序列进行引物设计；引物应符合以下标准(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60%之间；(3) 退火温度在48-60°0之间；(4斤0 产物的预期长度在130-350bp之间；其中，所述的拟穴青 蟹微卫星分子标记及其对应的特异引物序列，如下所示=ScpOl 长度 337bpstaaccacatc cacccgtcca ctcaaccact caaccatatc cactcactca cctacttacc cacactcata acgccatcct tctatccact aactcacact cacccgacca cccacctccg ttagcccacc catccactca ctcaaccaca accacccatc cacccaccgc acactaccta caggctcatc cacctatcta tccatccatc cgctcatcta cctgtaaacc acccacccac actcacacat tcatcatccc acccacatcc accaaaccag ccaccccacc atccagtaca cattggccta tccatccaca actacaacct cccatta ScpOl标记的特异引物序列 F :tcataacgccatccttctat R :tgggaggttgtagttgtgga ； Scp02 长度 243bpsaacaacgcag cgcaacacaa tataatgcaa tgtaacaaca caacacaaca caacacaaca caacaccgca acgcaacacc ggcttagggt gacagcacgt aacacctcgc agcgtgcatg aagccaaaac agcaacactg aatgggaaga catacaagag caatccaatg ttggcgcagc aggaatcctg tgtccctatc agcaggtcac gcttgcctcc atttcaaatc cactcgcaca ttaScp02标记的特异引物序列 F :gcaacacaatataatgcaatgtaa R :agcgtgacctgctgatagg ； Scp03 长度 298bpstaataataac aataacagaa acaatgactc taccttctaa cacaggaatg gtcctcaaca acctcattgg caagaagggg tcactgtcat cactgcaaga ctactgggac gtggccacct tctttgagat cagcgtgttg gcagaggatt atggaaaggc ggtgcaggca gctgagtgca tgtttagatt gaagcctcct aattggtgag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtaagggt ggtgcattgt gggagtgtgt ttagtgttgg tgagagaatg gtaggtggta cgtcatta Scp03标记的特异引物序列 F:tggtcctcaacaacctcatt R:atgacgtaccacctaccattct ； Scp04 长度 509bpstaatgtcaga cgcagtgatg taggcagaaa tgttaagaat aaagcaacac catcaccaac attaccatta tcatcaccag C3-CC3-CC3-3-CaattaCCatCactatatcta caactcatca caacctctaa tcaccaccac caccatcatc accagtcaac accagtgcac cacaggaacg aaaacaccac cccactcatc tccctcctca tctcctgctc ctgtttcgtc tattccagtt tcccctcgtg taccaatttc ctggacttgc ttgcgtaaac gtcactccat tttctgtcat tcgtttttct ctcatgcatc cctcggcctc gtgtgtgtgtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtggtgac agcgggtgtg gactcctgtg acacacaagg agtagcgagg cgcgagtta Scp04标记的特异引物序列 F :ttcctggacttgcttgcgtaaa R :gcgcctcgctactccttgtg ； Scp05 长度 334bps taaccactca accaccccca atccacttac ccatccattc aaccacccgt ccactcacac catccatcta tccacacaac tattcacact catccaccca tctaacaaca cacctaccta aaccatccac ttactcttcc atccacattt atgaatgcag ctacccattc acacacccct Scp05标记的特异引物序列 F :cagccattgactcctatcga R:tgcattcatgtacggctaaa ； Scp06 长度 237bpsC3.3.C3.3.C3.3.C Q.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.tccctccttg ttttccttcc ttcatctctt tggtggtgga ggacgatatt acaaacaagc actaacaaag gaacaaacaa ataatgacta Scp06标记的特异引物序列 F:ccttgttttccttccttcatct R:gagagaagcctgcagttagtcat ； Scp07 长度 301bpsQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ. Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q. C3.3.C3.3.C3.3.Caggagaaaac aataataact actactacta ttaatatttc ttttactgga acaactgcca ccaccaccac caccagcaca taccaatacc atcactgcat tataaaaccc acgaactgtt aScp07标记的特异引物序列F :agcaacagcaggagaaaacaat R cctattatgaacagttcgtggg ； Scp08 长度 271bps taacccttcc tttgtaaagt tagcgcgtca attccatgta ttcttcttct tcttcttctt gttattatta tacttttgtt gtgttcggtt ttgttacact ttttcttttg ttgttgtggtgtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt tgcgtgattg ttgctgtgta cacacgccgccaatccatcc acactctaca ctcatccacc caactcattc caatccaccc ccatC 3.3. C 3.3. C 3.3. Cccactattat attcacacag actgcaggctagccattgac cacacattca tacccctcta atccatccat atccattcatQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.CQ.ctactactac atactaccac agcagtagtg cataatagggttttaacagt cttcttgttc acttatgaaa ttagctcagttcctatcgat tccatccatc ctgaccagcc ccatctatcc ttagccgtactttcctgaca ttcccttata acagacagac tctctcactccatcttttcc gtagtggtgg agacagacaa aggcttaQ.CQ.Q.CQ.Q.CQ.Q.tattaaattt caccaccacc aagaggcacg gcaatcaattcagcaacagc attactacta accaccagca gttacataac agtgcatatttgtgcgctct ttgttcttgt agctctcgtt ttttactttcttgtattgtg tcttcttatt ttgtgtcttg gtttgtgtcttttgctttgg ttttgagtca taataagtgg t ScpOS标记的特异引物序列 F:cgctctttgtattgtgattcc R :atgactcaaaaccaaagcaaa ； Scp09 长度 315bpstaagccgcca gagcaaggcc agtattgaaa tgatagggta gatgacacct cgccaggatt ttctgtccgt ttgtctgtgt gtatgctgtt gcttgcctgt gtgtctgttt tcctttatat ttgtctgttt gtcagtgtct gtctgtttgt gtgtctgtcg taaagtctca ctcttctttt ctttgtctgt ctgtccttac ttctgactgt caatctctcc ctctctctct ctctctctct ctctctctct gcttgttctc gccgttgtta ccgtcgggag ttgcttttgt cgttgttgtt gttgttgttg ttgtt Scp09标记的特异引物序列 F :cagtattgaaatgatagggtagatgac R:cggtaacaacggcgagaac ； ScplO 长度 274bpstaacgaagct aacacaacta gcgccgcccc tcgtgcgtgt gtgtgtgtgg cgagacgagt gcaagcaaga gagtgtttat ctacttgtct tgacttgtct gcacctacaa gagcaatatt tgtcttgtac tgtgtttccc gggccgacag aaagcagcgg tgtgggtgag agggaatatg atacagtgcg gagataaggc cagtaatccc cgagtgtgta gggttgtgca gcgcgaggtc ttaaggctgg gtagtgatct agacgcgact taca ScplO标记的特异引物序列 F:acaactagcgccgcccctcg R:acccagccttaagacctcgc ； Scpll 长度 262bpstaacacacac tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc tctaagcttt tttcatttca tcttccatcc gatatttttt tttttcactt ttccttcctt ccctcgttcc ttcctgactt tctctcttcg tccctcttcc taaccttttt ctccggtctc ttcttttact cctttatctc ctttcatctc gctgttcttt tgcattattt tatctggttc ttttctctca acttgtatctta Scpll标记的特异引物序列 F:ttcatcttccatccgatatt R :gaaccagataaaataatgcaaa ； Scpl2 长度 294bpstaataatatc aacatggcgg tcacccatcc aagaactaac cgaacccccc gttgcttaac ctcacttaca acacgaaaag ctgcgtattg aacatagtaa ggtcgttggc acacacacacacgcaatgat ctagagtaac atgcatccaa attacaagtt tttttttctc tctttctctc atagtaatta gcgtcattca attaacacct gctcgtgatt gatgagggga agttaatgac tgatgcattt gttgctaata attaggcgaa gate Scpl2标记的特异引物序列F:cacccatccaagaactaacc R:caatcacgagcaggtgttaa ； Scpl3 长度 273bpstaagcactat ttgtttggat tcttcttttc agtgtccaca ttcgttaatg agttgtttgt ggtgctggtg aatctgagct agaggattga gtagtggtag gtgattctga ttatgatagt gagtttgaat ttaggttaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca C3.C3.C3.C3.C3. ccttccgaag cttgctgcca gcgcccacat gccactctca caccctgtac tcctgtggta tagaagtctt aattatactg tta Scpl3标记的特异引物序列 F :tgtttggattcttcttttcag R :taccacaggagtacagggtg ； Scpl4 长度 359bpstaaacacaaa tacactgttg tgaaaacgta agacagaccg gtagacacaa agaccgaaag tttttatagt attgtagatt atatgacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca cgtgtagagg aggacagcca aggccagaaa aacagagtga aaataatgaa cgttaaatta attgcggctc ccacattgac aactggagag tttccaaaac gctggccagt tcattttctg agatgtcttg atatttccct catgcaatag ttgtaattat aagaaggaga aaaagagaaa caagtaaagt gttttagagt ttgccactga aatgcatgaa agagtgaaaa ttgcggtta Scpl4标记的特异引物序列 F :ttgtgaaaacgtaagacagac R :aattacaactattgcatgagg ； Scpl5 长度 422bpstaacacagac tacgaatgta gactttttta tgcatgtgat atgggatatg cgtgtgtatt gtgtgctgga tgaatacgag taagaacgtt cagatgtgtg tatatgtgat ggcgtatgag atggtaaagt atgcgtgtag gatagcaaat gtataaactc gtgtttatga atatagtgtg tgtgtgtgtg tgtgttctaa tcaatcattg gctatgcctt ccctctagtc gctagcgagt gaagatgaca cgctgccatt gccttgtgct aaggaagcag acactaacgt cggccgtcgg cccttcaagc cagacagtat agttggcgga ggtgactgag acacgtatta caatgcagta ttacaatgac gtgagggtac gggatgagta C 3. C C 3. C 3.3. C 3. ttcataacca gctaattgat taScpl5标记的特异引物序列 F taacacagactacgaatgtagactt R :gcatagccaatgattgattaga ； Scpl6 长度 262bpstaactccaaa ggaatgtggt gagtgaaagc aaacccaagt aactgaggag tggtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtatgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtatgtgt gtgtgtgtgt gtgtattcaa ccctttgact gccacttggt acacctttcc ctacagccac attcgatctt tgaactggga agaaattgca aaatgtattc tatttcgtaa ctaactttct tgtagatgct taScpie标记的特异引物序列 F :aaacccaagtaactgaggag R :gtagggaaaggtgtaccaag ； Scpl7 长度 187bps agatagacag acacagaggc atactgaaac tgacatatat acataccttc tgacaaacac`3.C3.C3.C3.C3.C 3.C3.C3.C3.C3.C 3.C3.C3.C3.C3.C`3. C 3.3.3. 3.3. 3.acagatgcag`3.C3.C3.C3.C3.Cggccattcag agagataact aactccggtatcagtccaat1`3.C3.C3.C3.C3.CtgcgaatgccgacgttaScpl7标记的特异引物序列 F:agatagacagacacagaggcatact R:taacgtcggcattcgcatac ； Scpl8 长度 307bpstaactgcagt cccttacctg aagatgctac aggtgtgctc aggtgtggct aatgagtccc cacacctgtc ccctcccaca cctggcaagg gaaaatggaa ggaggaggaa gaaagaggaa aagaaggagg aggaaaaaag tggaaaaatg agagaaggaa gtgatggagg gaagaagaaa aaaggaatag gagaaaagag aagaggtgaa gagaggaaag aggaaaaaaa gaagagaagg gatgaaggaa gaagggagag agagagagag agtcactcta gctttgcgtt ggggcaggcg ctttctcScplS标记的特异引物序列 F:cccttacctgaagatgct R :caacgcaaagctagagtg ； Scpl9 长度 179bpstaagggcgat gattattggt tggccagaac aagcggcccc tcccaggcgc tggaggaagg gaggtggaag gaaggaagga agaagaagaa gaaaagaaag agaaggaaag aaagctgcaa ataaaaaaaa ggacgaatcg ggtgaagtga gtcagtggat ggaggagaga gagagagag Scpl9标记的特异引物序列 F :ggcgatgattattggttggc R :ttcacccgattcgtcctttt ； Scp20 长度 155bpstaacccgcgt gcttgtgtat ttatttgtgt attggatata aagtggaact gatggcgact catgcattag gagggcgaag tagagtgaca gagatcaggg ctgtgtgagg ggcgtgtgag gggagagaga gagaaggggt atgggagcgg tgtgt Scp20标记的特异引物序列 F:tggatataaagtggaactgatggcg R:cacaccgctcccataccccttο
7.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(6)中的PCR扩增的反应体系总体积为25μ1，包括基因组DNA模板Ιμ 、上下游 引物终浓度均为0. 4 μ mol/L、Mg2+终浓度为1. 5mmol/L、dNTP终浓度为0. 2mmol/L、TagDNA 聚合酶0. 75U、IXPCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25 μ 1 ；反应程序为94°C预变性5分钟，94°C变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72°C延伸50秒，30个循环； 最后于72°C延伸7分钟。
8.根据权利要求1所述的一种拟穴青蟹微卫星分子标记的构建方法，其特征在于所 述步骤(7)中的检测步骤包括将步骤(6)的PCR产物于95°C变性后，上样3μ1于6%的 变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，再经染色、显色后获得了拟穴青蟹的PCR产物电泳图像。
9.一种拟穴青蟹微卫星分子标记应用于拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管 理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种领域。
全文摘要
本发明涉及一种拟穴青蟹微卫星分子标记的获得方法，包括拟穴青蟹基因组DNA的提取；基因组DNA的酶切、连接接头及预扩增；扩增产物与探针和磁珠杂交及再次PCR扩增；扩增产物的克隆及测序；序列分析及微卫星特异引物设计；不同地理群体或群体内个体的基因组DNA的PCR扩增；6％的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；拟穴青蟹遗传变异的多态性图谱的获得。本发明在拟穴青蟹遗传变异分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及标记辅助育种等领域中具有良好的应用前景。
文档编号C12N15/10GK101886070SQ201010129629
公开日2010年11月17日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者马凌波, 马春艳, 马洪雨 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所