专利名称：：高f值猪血寡肽的制备方法
技术领域：
：本发明涉及酶解猪血蛋白制备高F值猪血寡肽的技术，具体涉及用猪血蛋白为原料，通过超声波破壁、控制蛋白酶酶解、活性炭吸附脱去芳香族氨基酸、喷雾干燥等，属于食品生物
技术领域：
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背景技术：
：高F值寡肽是指由37个氨基酸残基所组成的混合小肽体系。F值是指支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)与芳香族氨基酸(色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸)的含量的克分子数比值(FischerRatio)。高F值寡肽具有护肝、抗疲劳、醒酒、治疗苯丙酮尿症、降低血清胆固醇、抑制癌细胞增殖等多种功能。我国临床上使用的高F值制剂一般是采用纯净结晶的氨基酸按需要进行一定比例配制的。因此价格比较贵。由于许多实验证明口服高F值氨基酸混合物的治疗是有效的。因此，这启发了人们采用水解食物蛋白来制备高F值口服制剂，再者，有人认为寡肽在肠道中的吸收行为不同于氨基酸而易于吸收、尤其是三肽或四肽。所以口服寡肽混合物比口服氨基酸混合物对机体的补充更有效。因此可以推测从食物蛋白制备高F值寡肽混合物应用于临床作为口服制剂将是行之有效的。国外关于高F值寡肽的制备方法的研究，YamashitaM等人(YamashitaM，AraiS，FujimakiM.A1ow—phenylalanine，high_tyro_sineplasteinasanacceptabledieteticfood.Methodofpreparationbyuseofenzymaticproteinhydrolysisandresynthesis[J]Journaloffoodscience,1976，41(5):1029-1032)首次报道了利用胃蛋白酶与链霉蛋白酶从鱼蛋白和大豆分离蛋白中制取了低苯丙氨酸含量的寡肽混合物，产率分别为69.3%和60.9%，苯丙氨酸含量分别为0.05%和0.23%;SoichiA等(SoichiA.Comparativenutritionalvalueforaminoacids，olige_pep_tidesandsoybeanprotein[J]Jaocs，1987，64(12):1692-1695)根据食物蛋白的理化特性，在进行酶水解之前，先进行适当的前处理，以便提高水解度及可溶性肽的产量。他们用胃蛋白酶、链酶蛋白酶、木瓜蛋白酶以及a-胰凝乳蛋白酶等作用于乳清蛋白制备高F值低聚肽。预处理过程中先将乳清蛋白分散在水中，然后在9(TC下加热10min，再用酶处理，可大大提高其水解程度，产品最终得率为81.0X，苯丙氨酸含量为0.30X。由于高F值寡肽特殊生理功能，对高F值寡肽制备研究热潮就一直处于高涨状态。ShinyaT等(ShinyaT，TanabeS，WatanabeM，AraiS.Enzymaticmodificationofzeintoproductionanon_bitterpeptidefractionwithaveryhighfischerratioforpatientswithh印aticenc印halopathy[J].AgricBiolChem，1991，55(4):1119—1123)在以玉米醇溶蛋白制备高F值寡肽时，先将玉米蛋白悬浮在乙醇和0.1的KOH溶液中，蛋白分子结构变得更加松散，以利于酶的作用，从而提高可溶性肽的转化率；ShuJi(ShujiA，etal.ProcessingofAsia-PacificBiochemicalEngineeringConference[C].1992:739-742)、Bautista(BautistaJ，etal.Sunflowerproteinhydrolysatesfordietarytreatmentofpatientswithliverfailure[J].JournalAmericanOilChemistrySociety,2000，77(2):121-126.)分别以牛乳酪蛋白、葵花蛋白为原料制备高F值寡月太。Pedroche(J.Pedroche，etal.Productionandcharacterizationofcaseinhy_drolysateswithahighaminoacidFischer'sratiousingimmobilizedproteases[J]InternationalDairy,2004，(528):527-533)等研究用固定化酶水解牛酪蛋白获得高F值水解产物，用胰乳蛋白酶处理后再用羧肽酶A除去AAA,得到的产物F值达到30.6，而苯丙氨酸和酪氨酸总值<1.4X，通过BiogelP2凝胶柱过柱后，这种水解物可用以治疗肝脑病、酪氨酸血症和苯丙尿酮症。目前，国内关于高F值寡肽的研究起步较晚王梅等[WangMei，GuWen-ying.Thepreparationofactivatedcharcoalchro—matogr即hyseparationofmixtureofhighFvalueoligo-peptide[J].JournalofWu-xiuniversityoflightindustry,1998,17(4):41-45(InChinese)]首次采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶降解玉米黄粉制备高F值寡肽混合物，研究比较了玉米醇溶蛋白不同前处理方法对可溶性肽产量的影响，最终可以得到产率为7.9X高F值寡肽混合物，F值为31.O，芳香族氨基酸的含量为0.06%，完全符合0kitaM等提出的高F值制剂的标准；谷文英[GuWen-ying.HighFischerratiop印tidemixture[J].ChinaFoodAdditives,2000，(2):69-73(InChinese)]、吴红艳[WuHong_yan，LiuXiao_yan，LiuZong_min，ZhengXi_qim.Pr印aratehighfischerratioofoligo-peptidewithcornscr即[J].Journalofscienceofteachers'collegeanduniversity,2003，(8):43-45(InChinese]等也研究利用玉米黄粉为原料制备高F值寡肽混合物；宋春丽等[SongCh皿-li，ChiYu-jie，S皿Bo，LiuFeng.StudyonTechnologyofPreparingHighFischerRatioSoybeanOligo-peptidewithTwoProteinases[J].Foodscience,2007，28(6):110-113(InChinese)]利用碱性丝氨酸蛋白酶和蛋白酶II对大豆分离蛋白进行两步定向酶切，来制备具有改善肝昏迷生物活性的高F值寡肽；何慧等[HeHui.Studyonpeptideshydrolyzedfromsoybeanandcornproteinsbyproteaseandtheirbioactivities[J].Scienceandtechnologyofcereals,oilsandfoods,2002，10(1):14-16(InChinese)]研究将大豆蛋白和玉米蛋白按一定比例复配，用碱性蛋白酶水解，得到F值2.92酶解液，可作为生产高F值寡肽原料。随着对各种天然生物材料研究深入，制备高F值寡肽原料也在不断扩大。赵姗姗等[ZhaoShan-shan，GanXin.Studyonoligo-peptidesofhighfischerratiowithkonjacflypowder[J].Chemistry&Bioengineering，2005，(1):10-12(InChinese)]论述了根据魔芋飞粉开发制备高F值寡肽可行性；彭晓红等[PengXiao-hong，KuangYing-qiu，MaoPing-sheng.Theedibleandhealthyfunctionofsilk[J].Jiang_susericllture，2004，(1):23-24(InChinese)]论述将蚕丝用盐酸水解，再以氢氧化钠中和后，经脱盐、浓縮、冷冻干燥，制成黄褐色蚕丝低聚肽和氨基酸粉末，从而可将这种低聚肽粉末经过除AAA处理，制备高F值低聚肽。刘静波等[LiuJing-bo，LinSong-yi，ZhangTie-him，ZhaoFa-li，LiuYu.ControllableEnzymeDisassembleConditionsofHighFValueOligo—peptidefromEggWhite[J].JournalofShen-yangAgriculturalUniversity，2007，38(2):174-177(InChinese)]将鸡蛋清用碱性蛋白酶和风味酶双酶酶解制备高F值寡肽，为固定化酶在蛋清高F值寡肽的生产技术的研究奠定基础。目前国内外生产高F值寡肽原料的来源十分广泛，来自于动物蛋白的有鱼蛋白、乳清蛋白、牛乳酪蛋白等；来自于植物蛋白的有玉米醇溶蛋白、大豆蛋白、葵花蛋白等。目前研究最深入的要数玉米黄粉的高F值寡肽混合物，其它如大豆蛋白等也有一定的报道。由于国内高F值寡肽市场主要呈现工业化生产的产品种类少，产量低，制备条件落后，产品供不应求的状态。因此，如何利用资源丰富、蛋白质含量高、杂质少、支链氨基酸较芳香族氨基酸含量高、适用于高F值寡肽生产的原料，并且开发生产高F值寡肽产品的方法成为急待解决的第一个问题。猪血血红蛋白的营养价值很高，特别是赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的含量较高。血红蛋白中的血红素具有颜色及腥味，即使在食品中加入少量也会使食品呈暗棕色并有异味，影响其感官质量，从而限制了血红蛋白的应用。我国每年屠宰生产的猪血约有170万吨，猪血资源十分丰富，但目前我国猪血的利用率不超过10%，并且我国利用猪血资源开发的产品还比较单调，除了小部分被加工成血粉或发酵血粉作为饲料添加剂及用于生化制药生产血红素、超氧化物歧化酶、蛋白胨外，相当大的一部分都作为废弃物排出，既污染了环境，又浪费了宝贵的蛋白资源。发明人长期从事猪血综合利用方面的研究，发现猪血的氨基酸组成中，支链氨基酸与芳香族氨基酸的质量比为1.75:l，是制备高F值寡肽的理想原料。如果对原料进行预处理后，利用酶体系的专一性，尽量在水解物肽链里保留支链氨基酸，而使芳香族氨基酸游离析出，然后经选择性吸附层析将芳香族氨基酸吸附脱离水解物，从而制得高F值水解物，再经过一系列处理即可得到猪血高F值寡肽混合物。这对解决猪血对环境的污染和提高蛋白质资源的利用率均具有重要意义。目前，国内外还未有从猪血中制备高F值寡肽产品的相关报道。由于猪血不同于前述的玉米蛋白、大豆蛋白、葵花蛋白等植物来源和鱼蛋白、鸡蛋清、蚕丝等动物来源，因此不能完全照搬前述的现有方法。杨世宇(利用猪血纤维生产水解蛋白注射液，肉类工业，1987年第3期第40-42页)报道了一种利用猪血制备医用的血纤维水解蛋白的方法，包括热碱处理猪血、活性碳或白土除去热源和过敏原、通过离子交换树脂纯化并干燥浓縮。但该方法仅仅涉及从猪血中制备水解蛋白而不是高F值寡肽，同时该方法或相类似的方法涉及离子交换树脂，导致生产周期长、生产成本高而难以大规模应用。因此，如何提供一种从猪血中制备高F值寡肽产品的方法成为目前急需解决的问题。
发明内容发明人经过长期摸索和实验确定了本发明方法，利用蛋白酶酶解猪血蛋白、通过活性炭吸附去除芳香族氨基酸，制备高F值寡肽，包括蛋白酶的选择及其酶解技术参数，吸附剂的选择及其吸附技术参数等。本发明拓宽了生产高F值寡肽的原料来源，以新鲜猪血为原料，极大地提高蛋白质资源的利用率和解决猪血对环境的污染；其次，摒弃了常规方法中生产高F值寡肽需要凝胶过滤或离子柱过滤纯化的方法，直接选用蛋白水解、活性碳处理的技术，通过优化技术参数，并结合以可溶性淀粉为载体进行的喷雾干燥技术，取得了显著的技术效果。本发明所述的一种从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，包括(l)猪血抗凝处理；(2)利用碱性蛋白酶水解猪血蛋白，反应条件温度4555t:，加酶量0.350.45g/100mL猪血，初始pH值1012，反应时间68h。(3)将碱性蛋白酶酶解后的猪血蛋白水解液，再用风味蛋白酶水解，反应条件为温度4547°C，加酶量0.350.50g/100mL猪血，初始pH值1012，反应时间57h。(4)使用活性炭对猪血蛋白水解液进行高F值化处理，条件为炭液比(即活性碳和反应溶液的质量比)l:815、温度405(TC、吸附时间24h、pH值46。(5)以可溶性淀粉为载体，对高F值猪血寡肽进行喷雾干燥，条件为进口风19021(TC，出口风80IO(TC，最终得到乳白色产品。在实施方案中，步骤(4)通过高速离心除去活性碳，并用超滤膜截留、纯化水解产物。在实施方案中，使用截留分子质量丽CO为lku、面积0.4m2的超滤膜进行截留纯化，其中在操作终点时，添加截留液约10%体积的蒸馏水进行纳滤三次。在实施方案中，步骤(1)中通过加入5.08.Og/L柠檬酸三钠进行抗凝处理，在超声波破碎1015min之后，保存备用或直接使用。在实施方案中，步骤(2)加酶量优选0.45g/100mL，反应温度优选50°C。在实施方案中，步骤(3)加酶量优选0.45g/100mL，反应温度优选46t:。在实施方案中，步骤(3)中通过氢氧化钠或氢氧化钾、步骤(4)中通过盐酸调节pH。技术效果1.本发明的方法拓宽了生产高F值寡肽的原料来源，以新鲜猪血为原料，极大地提高蛋白质资源的利用率和解决猪血对环境的污染。2.摒弃了常规方法中生产高F值寡肽的需要凝胶过滤或离子柱过滤纯化的方法，生产周期短、降低了生产成本，适于大规模工业化应用。3.本发明为了通过对猪血的深加工，提高猪血的附加值，减少环境污染，为高F值寡肽的原料来源和生产方法提供新的解决方案。4.通过本方法制备的高F值猪血寡肽，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游离氨基酸组成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F值〉25，产品得率>10.74%，优于现有技术。具体实施例方式下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。实施例1:从猪血中制备提取高F值猪血寡肽。第一步检疫合格的生猪洗净后采血，加6.Og/L柠檬酸三钠抗凝，超声波破碎10min，用NaOH将初始pH值调至12，加碱性蛋白酶进行水解，加酶量0.45g/100mL，在50°C下，酶解7h。第二步碱性蛋白酶酶解后的猪血蛋白水解液，加入风味蛋白酶(购自诺维信中国生物技术有限公司)水解，加酶量O.45g/100mL，46。C下，酶解6h。第三步用盐酸将猪血蛋白水解液pH值调至5，再将活化后的活性炭加入猪血蛋白水解液，炭液比1:IO，在45"下，吸附3h，期间每隔1520min搅拌一次。第四步9000r/min转速离心30min除去活性炭，用截留分子质量丽CO为lku、面积O.4n^的超滤膜，采用截留液全回流操作方式，工作温度25t:，在纳滤接近终点时，添加截留液10%左右的蒸馏水纳滤三次。最后对高F值猪血寡肽进行喷雾干燥，条件为进口风190°C，出口风90°C，得到高F值猪血寡肽产品为乳白色，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游离氨基酸组成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F值为25.98，产品得率为10.68%。实施例2:从猪血中制备提取高F值猪血寡肽。第一步检疫合格的生猪洗净后采血，加7.Og/L柠檬酸三钠抗凝，超声波破碎12min，用NaOH将初始pH值调至10，加碱性蛋白酶进行水解，加酶量0.40g/100mL，在52°C下，酶解6h。第二步碱性蛋白酶酶解后的猪血蛋白水解液，加入风味蛋白酶(购自诺维信中国生物技术有限公司)水解，加酶量O.50g/100mL，45t:下，酶解5h。第三步用盐酸将猪血蛋白水解液pH值调至5，再将活化后的活性炭加入猪血蛋白水解液，炭液比1:15，在5(TC下，吸附2h，期间每隔1520min搅拌一次。第四步9000r/min转速离心30min除去活性炭，用截留分子质量丽CO为lku、面积O.4n^的超滤膜，采用截留液全回流操作方式，工作温度25t:，在纳滤接近终点时，添加截留液10%左右的蒸馏水纳滤三次。最后对高F值猪血寡肽进行喷雾干燥，条件为进口风190°C，出口风90°C，得到高F值猪血寡肽产品为乳白色，分子量集中在8001200Da，其氨基酸及游离氨基酸组成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量<0.1%，F值为25.98，产品得率为10.68%。权利要求一种从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，包括(1)猪血抗凝处理；(2)利用碱性蛋白酶水解猪血蛋白，反应条件温度45～55℃，加酶量0.35～0.45g/100mL猪血，初始pH值10～12，反应时间6～8h；(3)将碱性蛋白酶酶解后的猪血蛋白水解液，再用风味蛋白酶水解，反应条件为温度45～47℃，加酶量0.35～0.50g/100mL猪血，初始pH值10～12，反应时间5～7h；(4)使用活性炭对猪血蛋白水解液进行高F值化处理，条件为炭液质量比1∶8～15、温度40～50℃、吸附时间2～4h、pH值4～6；(5)以可溶性淀粉为载体，对高F值猪血寡肽进行喷雾干燥，条件为进口风190～210℃，出口风80～100℃，最终得到乳白色产品。2.根据权利要求1所述的从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，其中步骤(4)通过高速离心除去活性碳，并用超滤膜截留、纯化水解产物。3.根据权利要求1所述的从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，其中使用截留分子质量丽CO为lku、面积0.4m2的超滤膜进行截留纯化，其中在操作终点时，添加截留液约10%体积的蒸馏水进行纳滤三次。4.根据权利要求1所述的从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，其中步骤(1)中通过加入5.08.Og/L柠檬酸三钠进行抗凝处理，在超声波破碎1015min之后，保存备用或直接使用。5.根据权利要求1所述的从猪血中制备高F值猪血寡肽的方法，其中步骤(3)中通过添加氢氧化钠或氢氧化钾、步骤(4)中通过添加盐酸调节pH。全文摘要本发明涉及一种高F值猪血寡肽的制备方法，本发明以新鲜猪血为原料，利用蛋白酶酶解猪血蛋白、通过活性炭吸附去除芳香族氨基酸，制备高F值寡肽，包括蛋白酶的选择及其酶解技术参数，吸附剂的选择及其吸附技术参数等，目的是为了通过对猪血的深加工，提高猪血的附加值，减少环境污染，为高F值寡肽的制备提供新的途径，通过本方法制备的高F值猪血寡肽，分子量集中在800～1200Da，其氨基酸及游离氨基酸组成具有良好的平衡性，芳香族氨基酸含量＜0.1％，F值＞25，产品得率＞10.74％。文档编号A23J3/34GK101791039SQ20101013036公开日2010年8月4日申请日期2010年3月23日优先权日2010年3月23日发明者卢向阳,方俊申请人:湖南农业大学