专利名称：一种布鲁氏菌诊断试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物检测技术，特别是一种对布鲁氏菌进行诊断检测的试剂 盒，以及这种试剂盒的使用方法。
背景技术：
布鲁氏菌病(Brucellosis)，是由革兰阴性、兼性细胞内寄生的布鲁氏菌属 (Brucella)细菌引起的人兽共患传染病，已在世界范围内广泛流行，已有170多个国家报 告有人、畜布鲁氏菌病疫情的发生。布鲁氏菌宿主范围广泛，可感染60多种家畜、野生动物 及海洋哺乳动物。感染后主要导致动物生殖系统损害，引起怀孕母畜胎膜发炎，导致不孕、 流产、死胎等，严重危害畜牧业和养殖业的发展。人常常由于接触感染动物的乳、肉、皮毛及 疫畜流产物等发生感染，造成骨关节、神经系统、生殖系统、循环系统和免疫系统等损害，并 常伴发菌血症、毒血症。疫情报告显示，人间2008年全国报告新发病例数27767例，发病率 为2. 15/10万，比2007年同期(19721例)上升了 40. 07%，首次超过新中国成立以来1963 年的历史最高水平。而动物疫情也自20世纪90年代以来开始有所回升。由于目前没有有效的预防人畜布鲁氏菌病的疫苗，早发现、早诊断、早治疗可能是 控制人畜布鲁氏菌病的有效措施。目前布鲁氏菌病的检测方法主要有分离培养、血清学方 法和普通PCR方法。分离培养虽然是确诊布鲁氏菌病的最佳证据，但由于费时、出菌率低以 及生物安全等问题，临床应用较少。血清学检测方法如SAT，简便、快速，也是国际公认的布 鲁氏菌病标准化诊断方法，但因其特异性低，特别是耶尔森氏菌(0 9)与布鲁氏菌抗原存 在很大的相似性(Kittelberger，1997)，容易出现假阳性结果。普通PCR方法用于病原核酸 检测，因其敏感、快速、无需活菌操作等优点，在布鲁氏菌病诊断方面具有一定价值，但需要 专门的仪器、操作繁琐，不适合临床及基层生产使用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测成本低、方便快捷、灵敏度高 和特异性强的布鲁氏菌快速检测试剂盒及其检测方法。本发明的布鲁氏菌检测试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成，两对特异性引物 序列如下内引物 FIP :gccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca内引物 BIP :cagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt外引物 F3 gacgccatccaggaacag外引物 B3 gcatcaccttcaacaccgtat。采用上述试剂盒进行布鲁氏菌检测的方法(1)首先从待检测的样品中提取样品DNA ；(2)在以从待检测样品中提取的样品DNA为模板、以检测试剂盒的内引物FIP、内 引物BIP、外引物F3和外引物B3为引物的反应体系中进行LAMP反应；
(3)反应结束后，加入显色液进行分析，判定阴阳性。本发明的检测方法中LAMP反应体系中主要成分终浓度组成如下10 X Thermopol缓冲液 终浓度为1 X内引物 FIP 和 BIP各 1.2 2· Ομ M夕卜弓I物F3禾口 Β3各0.1 0·4μΜ脱氧核糖核苷酸混合物 0.4 2. OmMBst DNA聚合酶5 IOU/反应甜菜碱0. 5 1. 2Μ硫酸镁2 6mM溶剂为DEPC水。本发明的检测方法中，LAMP反应条件设置为63 65°C lh，80°C 2min ；所用显色 液为 20 倍 SYBR Green I。本发明的原理是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外 引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环 链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很 多环的花椰菜结构的茎_环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)，从 dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁乳白色沉淀，即 可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(63 65°C )条件下45 90分钟内完成。 这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检 测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求 较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选 体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技 术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围 等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通 量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。目前国家标准中以微生物分离培养 和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成 鉴定报告需10-15天。而采用本发明的基因快速诊断试剂盒仅需2小时。并且，本发明的 反应液中加入了显色液，使鉴定结果更为直观清晰。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果1.不需要特殊试剂与设备，检测成本低；2.具有高特异性，应用六个区段，四条引 物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否；3.快速高效，检测时间约2小时；4.灵敏 度高，扩增模板仅需10拷贝或更少，检测率达到99% ；5.鉴定简便，从dNTP析出的焦磷酸 根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，可通过肉眼直接观察鉴定， 并且加入显色液后，阴阳性结果显色差异显著，明显可靠，验证率高。6.用途广可广泛用 于各种型布鲁氏菌的安全快速检测。
具体实施例方式下列实施例进一步说明本发明，但不应该当作对本发明的限制。实施例1试剂盒的制备
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本试剂盒至少由两对特异性扩增引物，即内弓 I物 FIP :gccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca ；内弓I物 BIP :cagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt ；夕卜弓丨物 F3 gacgccatccaggaacag ；外弓丨物 B3 :gcatcaccttcaacaccgtat ；试剂盒中的其余物质可以通过外购的方式解决。实施例2优选的试剂盒本发明优选的试剂盒应由以下内容组成两对前述的特异性扩增引物，其中，所述的外引物浓度为5pmol/yL，内引物浓度 为20pmol/ μ L ；Bst DNA聚合酶，Bst DNA聚合酶活力为8个活性单位/微升；脱氧核糖核 苷酸混合物；缓冲液；甜菜碱；硫酸镁；显色液和阳性对照液组成，具体制备如下按实施例1中引物序列经DNA合成仪合成寡聚脱氧核酸引物，并以内引物20pmol/ μ L、外引物5ρπι01/μ L浓度配置，分别分装于容器购置Bst DNA聚合酶置于容器；购置甜菜碱，按5mol/L配置，分装置于容器；购置脱氧核糖核苷酸，按脱氧核糖核苷酸混合物25mmol/L配置，分装置于容器；购置硫酸镁，按lOOmmol/L配置，分装置于容器；购置显色液SYBR Green I，按20倍配置，分装置于容器；制作阳性对照液，分装置于容器。其制作方法为采用PCR扩增一段布鲁氏菌基因 特异序列，然后装入PMD18-T载体，转化至DH5a感受态细菌，抽取质粒DNA经序列测定后， 采用紫外分光光度计测定质粒DNA的浓度并用灭菌双蒸水调整拷贝数至IO7拷贝/ μ L。将上述八个容器组装成试剂盒，提供使用说明书，封装。实施例3本发明的布鲁氏菌基因快速诊断试剂盒的应用1、样品处理(模板DNA提取)按照ΝΥ/Τ1467-2007中2. 4款的方法采集待检样品，如血液或乳液；按照ΝΥ/Τ1467-2007中2. 5款的方法对待检样品进行核酸提取，获得样品模板，或 使用等同的商品化核酸提取试剂盒按说明书操作提取待检样品的DNA模板。2、环介导扩增反应过程
(1)反应体系在0. 2ml薄壁管中加入以下试剂
IOXThermopol 缓冲液 2..5 μ L
甜菜碱 5.OyL
脱氧核糖核苷酸混合物1. 2μ L
内引物(FIP/BIP)各2. 0μ L
外引物(F3/B3)各l.OyL
硫酸镁l.OyL
Bst DNA聚合酶l.OyL
模板DNA3. 0μ L
DEPC 水5. 3μ L
总体积25 μ L
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(2)反应条件63-65°C反应lh，然后80C水浴2min。在进行环介异扩增反应的同时，用现有的普通PCR方法对待检样品进行平行检 测；然后对用本试剂盒的方法和普通PCR方法均检测为阳性的待检样品DNA模板进行梯度 稀释后，作为模板DNA再用此两种方法分别进行反应检测。此外，对耶尔森氏菌阳性样品也 分别用此两种方法进行检测。3、结果判定在上述反应管和阳性对照管中分别加入1 μ L SYBR Green I显色液混勻，观察产 物颜色变化，若反应管与对照管一样呈现明显绿色则为阳性，若反应管呈现橙色则为阴性。经实际检测表明，用本发明检测试剂盒方法和现有普通PCR方法检测待检样品， 对用此两种方法均检测为阳性的同一样品模板DNA进行10拷贝稀释后，再用此两种方法进 行平行检测，发现用本发明检测试剂盒的方法仍可以检测为阳性，而普通PCR则不能检出。 此外，用布鲁氏菌普通PCR方法对耶尔森氏菌阳性样品进行检测，有假阳性出现，而使用本 发明检测试剂盒的方法则没有。这表明，本发明检测试剂盒的方法比现有的普通PCR方法 具有更高的敏感性和特异性。
权利要求
一种布鲁氏菌诊断试剂盒，其特征是试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成，两对特异性引物序列如下内引物FIPgccatagccaaggtaaagaccggcggttgaagtagctcccca内引物BIPcagcaccgttggcagcatcagatctggtcctgctggaagt外引物F3gacgccatccaggaacag外引物B3gcatcaccttcaacaccgtat。
2.用权利要求1所述试剂盒检测布鲁氏菌的方法，其特征是该方法包括如下步骤(1)提取样品DNA；(2)以待测样品DNA为模板、加入试剂盒的内引物FIP、内引物BIP、外引物F3和外引物 B3为反应体系，并对反应体系进行LAMP反应；(3)反应结束后，加入显色液，根据反应物所呈现的颜色判定被检样品的阴阳性。 本发明的方法中，所述的LAMP反应体系中主要成分终浓度组成如下lOXThermopol 缓冲液 内引物FIP和BIP 外引物F3和B3 脱氧核糖核苷酸混合物 Bst DNA聚合酶 甜菜碱 硫酸镁溶剂为DEPC水。本发明的方法中，LAMP反应条件设置为63 SYBR Green I。终浓度为1X 各 1. 2 2. Oil M 各 0. 1 0.4iiM 0. 4 2. OmM 5 10U/反应 0. 5 1. 2M 2 6mM 65°C lh，80°C 2min ；显色液采用20倍
全文摘要
本发明公开一种微生物检测技术，特别是一种对布鲁氏菌进行诊断检测的试剂盒，以及这种试剂盒的使用方法。本发明的布鲁氏菌检测试剂盒至少由两对特异性扩增引物构成。本发明的原理是利用环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)，由Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物(即内引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。
文档编号C12Q1/68GK101984068SQ201010162779
公开日2011年3月9日 申请日期2010年3月19日 优先权日2010年3月19日
发明者周继章, 宫晓炜, 曹小安, 蔺国珍, 邱昌庆, 郑福英 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所