专利名称：一种提高脂肪酶活力持续性的方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程领域，特别涉及一种在酿酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)细胞壁外表面展露表达脂肪酶以提高该酶活力持续性的方法。
背景技术：
酯是一大类在化工、食品、医药等领域广泛应用的重要产品或中间体，仅用作食用香料的酯即达数百种。各种酯的合成路线相同，均以羧基供体(如酸、酸酐)和羟基供体 (如醇、淀粉等)为原料，通过酯化反应制备。脂肪酶能催化许多种酯的生物合成。与酯的化学合成相比，酯的生物合成具有效率更高、反应条件温和、能耗低等优点。但目前应用的脂肪酶存在酶活力持续性不足这一问题。包括脂肪酶在内的各种酶的重组表达方式有细胞内表达和分泌表达两种，这两种酶的重组表达方式使酶分子与宿主细胞之间没有关联，即酶分子不是宿主细胞的组成部分，从而很容易失活。如果使酶分子成为细胞的有机组成部分，则只要细胞保持存活状态酶分子也会保持活力，从而可以显著提高酶的活力持续性。本发明开发一种使脂肪酶成为酿酒酵母细胞有机组成的技术，即将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分，只要酿酒酵母细胞保持存活则脂肪酶始终保持活性状态，从而显著提高了脂肪酶活力持续性。
发明内容
针对现有的脂肪酶活力持续性不足的问题，本发明提供一种使脂肪酶成为酿酒酵母细胞有机组成部分的技术，使脂肪酶只要酿酒酵母细胞保持存活即可保持活力，从而显著提高脂肪酶活力持续性。本发明的一种提高脂肪酶活力持续性的方法，包括以下步骤将脂肪酶基因(Genbank号连接(常规方法)在酿酒酵母细胞壁成份 FLO序列(Genbank号S73336)的N端，然后插入(常规方法)酿酒酵母表达载体GALl启动子(Genbank号:AY428072)下游MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GALl启动子+MF α 1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有4. 2-6. 8% (重量百分比)半乳糖(普通半乳糖)的YPD培养基中本发明的优点将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接，如此则只要酿酒酵母细胞保持存活状态，脂肪酶即可保持活力。
具体实施例方式以下通过实施例进一步对本发明进行描述
实施例1脂肪酶展露表达将脂肪酶基因(来自Rhizopus oryzae, Genbank号AF22943Q连接在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，Genbank号S73336)的 N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子(来自酿酒酵母表达载体pYES263，Genbank 号AY428072)下游MF α 1信号肽序列(来自酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae, Genbank号M17301)的C端，构建成表达框(从N端到C端):GAL1启动子+MF α 1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列。将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞 (Saccharomycescerevisiae，购自安琪酵母股份有限公司)JlJMF α 1信号肽将引导脂肪酶向酿酒酵母细胞外分泌，而脂肪酶下游的FLO序列则锚定在酿酒酵母细胞壁中，从而使脂肪酶展露表达在酿酒酵母细胞壁外表面。实施例2脂肪酶展露表达的诱导在培养酿酒酵母的YPD培养基中，添加4. 2-6. 8%半乳糖(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon Biological Engineering Technology&ServicesCo. , Ltd.), 则表达框“GALl启动子+MF α 1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GALl启动子就会活化，诱导脂肪酶在酿酒酵母细胞壁外表面展露表达。实施例3半乳糖对脂肪酶展露表达的作用在培养酿酒酵母的YPD培养基中，如果不含半乳糖，则未检测到脂肪酶活性，这是因为表达框“GAL1启动子+MF α 1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中的GALl启动子无法活化。实施例4脂肪酶展露表达后其活力持续性显著提高按照实施例1和实施例2所示步骤进行展露表达的脂肪酶活性为512U/mL(4. 2% 半乳糖)和505U/mL(6. 8%半乳糖)，半衰期均为65天，即第65天时能保持起始活性的一半。而如果在实施例1和实施例2所示的展露表达表达框“GAL1启动子+MFa 1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列”中去除FLO序列序列，则脂肪酶进行分泌表达，活性为141U/ mL (4. 2%半乳糖)和137U/mL(6. 8%半乳糖)，半衰期均仅为7天，即第7天时能保持起始活性的一半。因此，将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接而成为酿酒酵母细胞的组成部分，只要酿酒酵母细胞保持存活则脂肪酶始终保持活性状态，从而显著提高了脂肪酶活力持续性。对脂肪酶活性测定采用脂肪酸释放测定法，活性单位定义为在pH 7.0的25% 橄榄油(购自上海生工生物工程有限公司，Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.，Ltd.)溶液中，每分钟释放出1 μ mol脂肪酸(标准品购自上海生工生物工禾呈有P艮公司，Shanghai Sangon BiologicalEngineering Technology&Services Co.，Ltd.)的酶量定义为1个脂肪酶活力单位(U)。最后，需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种提高植酸酶活力持续性的方法，其特征在于包括以下步骤将植酸酶基因连接在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列的N端，然后插入酿酒酵母表达载体GALl启动子下游MFa 1信号肽序列的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MF α 1信号肽序列+植酸酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于将包含“权利要求1”所述表达框的酿酒酵母细胞培养于添加有重量百分比3-6. 5%半乳糖的YPD培养基中。
全文摘要
本发明的一种提高脂肪酶活力持续性的方法，包括以下步骤将脂肪酶基因(Genbank号AF229435)连接(常规方法)在酿酒酵母细胞壁成份FLO序列(Genbank号S73336)的N端，然后插入(常规方法)酿酒酵母表达载体GAL 1启动子(Genbank号AY428072)下游MFα1信号肽序列(Genbank号M17301)的C端，构建成表达框，表达框从N端到C端GAL1启动子+MFα1信号肽序列+脂肪酶基因+FLO序列；将包含该表达框的酵母质粒转化入酿酒酵母细胞。本发明的优点将脂肪酶与酿酒酵母细胞壁成分FLO连接，如此则只要酿酒酵母细胞保持存活状态，脂肪酶即可保持活力。
文档编号C12R1/865GK102242088SQ20101017180
公开日2011年11月16日 申请日期2010年5月14日 优先权日2010年5月14日
发明者何国庆, 周陈伟, 廖文艳, 徐娟, 王睿之, 阮晖, 陈美龄, 陈赟, 马风兰 申请人:浙江大学