专利名称：嗜尼古丁节杆菌在透明质酸降解中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及嗜尼古丁节杆菌在透明质酸降解中的应用，特别涉及一株产透明质酸 酶的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC N01. 1933在降解透明质酸中 的应用。
背景技术：
透明质酸，又名玻尿酸，是体内重要的生理活性物质。透明质酸在不同的代谢阶 段，因其相对分子质量的不同而产生不同的生物活性，低分子透明质酸具有高分子透明质 酸没有的某些生物活性，甚至两者有完全相反的作用。低分子透明质酸易吸收，在体内可重 新合成高分子透明质酸，增加内源性透明质酸的含量，可发挥保健和美容养颜的功效。目前 发酵法和从动物组织中提取的透明质酸相对分子量一般都在100万以上，目前降解透明质 酸的方法主要包括物理法、化学法和酶法。生物大分子的酶法降解由于其专一性强、效率高、反应条件温和没有副产物 等优点，常被人们首选用于大分子的降解。但是由于透明质酸酶的来源非常有限，价 格昂贵，在很大程度上限制了它们的应用。很多革兰阴性以及革兰阳性细菌都产可降 解透明质酸的酶。革兰阴性菌产生的酶存在于周质空间而不是释放到胞外，不大可 能与发病机制有关，而且，这些酶类更像是软骨素酶。产透明质酸酶的革兰阳性菌有 Streptococcus, Staphylococcus,Clostridium,Propionibacterium,Peptostreptococcus 以 及 Streptomyces0 Clostridiumperfringens, Propionibacterium acens 及 P印tostreptococcus均为厌氧菌，对其研究不多。而关于链球菌透明质酸酶的报道则很多， 且深入。其他的如Ti^ponema pallidum及T. pertenue产生表面缔合的透明质酸降解酶，但 好像是水解酶，还需进一步研究。巴西的Shimizu等发现Candida的一些菌也产透明质酸 酶，但是没有进一步研究，后来又报道Paracoccidioides brasiliensis也产透明质酸酶。总体来说，目前产透明质酸酶的微生物比较多，但是进行深入研究很少，主要以链 球菌透明质酸酶为主。且，透明质酸酶来源有限，价格昂贵。目前急需一种易于培养，酶活 高，且安全高效的微生物菌种，以提供新的透明质酸酶的来源。嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)，已由他人保藏于中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏日期为2000年1月16日，保藏号为CGMCC N01. 1933，标准菌株，其用途主要为降解尼古丁，目前，并未发现其能产透明质酸酶并将其 应用于透明质酸降解中的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCCN01. 1933 (保藏日期为2000年1月16日)的一种新用途，即在透明 质酸降解中的应用，其在常温条件下对透明质酸具有高效的降解作用。具体应用时，可以采用以下两种方案
1、在透明质酸发酵生产的后期，即发酵结束前3-12小时，向培养物中添加培养物 体积 0. 1 5% 的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933，并混 合发酵，发酵3-12小时，即得分子量在500-200000Da之间的低分子透明质酸。以降解透明 质酸，嗜尼古丁节杆菌可以降低发酵液粘度，并降解透明质酸，进而得到低分子透明质酸， 降解得到的透明质酸分子量在500-200000Da之间。2、在高分子透明质酸溶液(分子量大于100万Da)中添加嗜尼古丁节杆菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933，作用 2-24 小时后，即可以得到分子量在 500-200000Da之间的低分子透明质酸。所述高分子透明质酸溶液中高分子透明质酸的质量百分比为0. 1 5% ；添加嗜 尼古丁节杆菌的量优选溶液体积的0. 1 5%。所述添加的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacternicotinovorans) CGMCC N01. 1933 为 嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933 的发酵液，或嗜尼古丁 节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933 产生的透明质酸酶。本发明的发明人通过实验研究发现，嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)对透明质酸具有高效降解作用(详见实施实例2_5)，因此，可以用于降解 透明质酸。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明实施实例1 菌种的鉴定本发明的发明人从透明质酸腐败液中分离得到一菌株，用下述方法对其进行鉴 定提取细菌染色体DNA，并PCR扩增菌株16S rDNA序列。扩增16S rDNA的正向引 物为 27F 5‘ -AGAGTTTGATC (C/A) TGGCTCAG-3‘(对应于 E. coil 16S rDNA 序列的第 8-27 个 碱基位置)，反向引物 1492R :5，-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3‘(对应于 E. coli 16S rDNA的第1492-1510个碱基位置)。100 μ L 的 PCR 反应体系1 XPCR 缓冲液，1. 5mmol/L MgCl2,4X dNTP 混合物各 200ymol/L，引物各 0. 5ymol/L，Taq DNA 聚合酶 1 μ L (5U/μ L)，2 μ L DNA 原液。PCR 反 应条件96°C预变性6min ；94°C变性lmin，50°C复性lmin，72°C延伸2min，30个循环；最 后72°C温育6min。PCR扩增产物经电泳检测后，直接交由上海生工生物工程技术公司进 行纯化和序列测定。运用Blast程序与数据库中已存在的细菌16S rDNA核酸序列进行 相似性比较分析。结果表明本菌株与嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) (GenBank登录号GQ284335. 1)序列相似性为99 %，可以判定该菌株为嗜尼古丁节杆菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933。实施实例2 嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明质酸质量百分比为的透明质酸溶液(透明质酸分子量为140万Da)，接种体积 的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)，30°C搅拌培养24小时，培养结束后 检测透明质酸分子量为lOOODa。实施实例3 嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明质酸
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质量百分比为3%的透明质酸溶液(透明质酸分子量为150万Da)，接种2%体积 的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)，30°C搅拌培养12小时，培养结束后 检测透明质酸分子量为60000Da。实施实例4 嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明质酸使用链球菌发酵生产透明质酸，在发酵结束前6小时，接种体积的嗜尼古丁节 杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)，培养结束后检测透明质酸分子量为100000Da。实施实例5 嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)降解透明质酸使用链球菌发酵生产透明质酸，在发酵结束前10小时，接种0. 5%体积的嗜尼古 丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)，培养结束后检测透明质酸分子量为60000Da。
权利要求
嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC NO1.1933在透明质酸降解中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于具体应用方法如下在透明质酸发酵生产的后期，即发酵结束前3-12小时，向培养物中添加培养物体积 0. 1 5% 的嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans) CGMCC N01. 1933，并混合发 酵，发酵3-12小时，即得分子量在500-200000Da之间的低分子透明质酸。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于具体应用方法如下 0JMSIiiy^ Φ i^iJPBf M^Tliff Ir (Arthrobacter nicotinovorans)CGMCCN01. 1933，作用2_24小时后，即可以得到分子量在500_200000Da之间的低分子透明 质酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述高分子透明质酸溶液中高分子透明 质酸的质量百分比浓度为0. 1 5% ；添加嗜尼古丁节杆菌的量为溶液体积的0. 1 5%。
5.根据权利要求1 4所述的应用，其特征在于所述添加的嗜尼古丁节杆菌 (Arthrobacternicotinovorans)CGMCC N01. 1933 ^J Bf M " T ff (Arthrobacter nicotinovorans)CGMCCN01. 1933 的发酵液，或嗜尼古丁 节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC N01. 1933 的透明质酸酶。
全文摘要
本发明公开了嗜尼古丁节杆菌(Arthrobacter nicotinovorans)CGMCC No1.1933(保藏日期为2000年1月16日)的一种新用途，即在透明质酸降解中的应用，其在常温条件下对透明质酸具有高效的降解作用。降解时，有两种方式一、在透明质酸发酵生产的后期，向培养物中添加嗜尼古丁节杆菌，并混合发酵，发酵3-12小时，即得低分子透明质酸；二、在高分子透明质酸溶液中添加嗜尼古丁节杆菌，作用2-24小时后，即可以得到低分子透明质酸。
文档编号C12P19/04GK101886099SQ20101019160
公开日2010年11月17日 申请日期2010年6月4日 优先权日2010年6月4日
发明者吉爱国, 宋淑亮 申请人:山东大学威海分校