一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，属于微生物应用【技术领域】。所述短小芽孢杆菌（Bacilluspumilus）05-5402，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.7418。获取方法包括分离、筛选、纯化工序，首先从烟株或土壤中分离能降解尼古丁的菌株，再用以NNK为唯一碳源和氮源的培养基筛选，最后在培养基平板上纯化即得。菌株的应用包括发酵、接种、降解工序，首先将菌株在25~30℃下培养48~72h得发酵菌剂，于烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按烟草重量的3~5%喷施，保持4~7天的降解时间即可。所述菌株能实现烟草特有亚硝胺的高效定向降解，且抗逆性好，简便易得，使用方便，具有较高的推广应用价值。
【专利说明】一株短小芽孢杆菌、该菌株的获取方法及该菌株在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用
【技术领域】[0001]本发明属于微生物应用【技术领域】，具体涉及一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌，及其获取方法和在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。
【背景技术】
[0002]TSNAs是烟草特有的N-亚硝基类化合物，是烟叶中重要的有害成分，对吸烟者的健康存在严重影响。NNN、NNK, NAB, NAT是烟草和烟气中主要的TSNAs，尤其NNN与NNK均为动物强致癌物，危害极大。影响烟草中TSNAs含量的因素很多，其中主要有烟草类型、烟草组织、栽培方式、调制方法、微生物群落、氮肥施用量、硝酸还原酶及亚硝化酶的活性等。通过这些影响因子的改变可以调控TSNAs的形成量，但目前关于TSNAs降解的方法还不多。因此，针对烟叶调制过程或烟叶制丝过程中，烟叶或烟丝内的水、热交换特点，分离、选育一株抗逆性好，能实现烟草特有亚硝胺定向降解的菌株，同时结合烟叶调制过程或烟叶制丝过程中环境温、湿度变化的阶段性特征，选择适宜的施用方法，对于提高烟草品质，降低烟草特有亚硝胺对人体健康及生活环境带来的危害都具有十分重要的意义。
【发明内容】
[0003]本发明的第一目的在于提供一株能实现烟草特有亚硝胺定向降解的短小芽孢杆菌。本发明的第二目的在于提供所述短小芽孢杆菌的获取方法。本发明的第三目的在于提供所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用。
[0004]本发明的第一目的是这样实现的:一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus),命名为05-5402，经鉴定为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的一个株系，是从烟株组织或植烟土壤中分离得到，已于2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称06110:，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC N0.7418。
[0005]本发明的第二目的是这样实现的:一种所述短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括:
A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为25~30°C，时间40~55h ；
分离培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ；
B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌
株;培养条件为:25~30°C，时间40~55h ；
筛选培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002,NNK0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ;
C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)05-5402 ;
培养条件为:25~30°C，时间40~55h ；
纯化培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0006]本发明的第三目的是这样实现的:一种所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括:
a、发酵:首先将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)05-5402接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为:25~30°C，时间24~36h ；
斜面培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0007]然后将发酵种 子接种到种子培养液中，接种量为3~5ν/ν%,摇瓶装液量为25~35ν/ν%，得到发酵菌剂；
培养条件为:25~30°C，时间24~36h ；
种子培养液成分以g/L计为:胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~
6.0 ；
b、接种:在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷
施；
C、降解:喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
[0008]本发明所述短小芽孢杆菌可应用于烟草特有亚硝胺的定向降解，具有以下优点:
1、本发明所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402是一种烟草特有亚硝胺的高
效降解菌，对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK、NAB和NAT四种主要TSNAs的总降解率可达12.2~17.3%。
[0009]2、本发明所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402大量存在于烟株与土壤中，来源广泛，易于分离、培养。同时，生产工艺简单，成本低廉，使用便利，且对人体无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及。
[0010]3、本发明所述短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402能在含有O~80g/LNaCl，pH3.0~10.0的培养基中生长，生长温度范围为10~45°C，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制和制丝过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高。
【具体实施方式】
[0011]下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。[0012]一株短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC N0.7418。
[0013]所述菌株为革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小，存在于菌体中，在培养基上菌落呈圆形，直径2~3mm，扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐，为好氧菌。所述菌株可在含有O~80g/L NaCl, pH3.0~10.0的培养基中生长，生长温度范围为10~45°C。
[0014]所述菌株可在以NNK为唯一碳源和氮源的培养基中生长。
[0015]所述NNK指的是4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基_1_ 丁酮(4_ (N-NITR0S0METHYLAΜΙΝ0)-1-(3-PYRIDYL)-1-BUTAN0NE)。
[0016]所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2 ~17.3%。
[0017]一种所 述短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括:
A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为25~30°C，时间40~55h ；
分离培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ；
B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌
株;
培养条件为:25~30°C，时间40~55h ；
筛选培养基成分以g/L计为:琼脂12.0~18.0、K2HPO4L 4~1.8、KH2PO40.3~0.5、NaCl0.08 ~0.12、MgSO4.7Η200.I ~0.3、CaCl20.04 ~0.06、MnSO4.Η200.001 ~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002,NNK0.8 ~1.2，ρΗ6.5 ~7.5 ;
C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)05-5402 ;
培养条件为:25~30°C，时间40~55h ；
纯化培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5。
[0018]步骤A所述的烟株组织为烟株的叶片或茎。
[0019]步骤A所述的烟株组织优选为烤烟Κ326的叶片或茎。所述的植烟土壤为烤烟Κ326的植烟土壤。
[0020]步骤A所述的分离优选将烟叶0.8~1.2g进行组织研磨后，加入90~IlOml无菌水，于室温下130~170rpm振荡提取25~35min，得到提取悬浊液。
[0021]步骤A所述的室温指的是20~25°C。
[0022]步骤A所述的尼古丁指的是N-甲基-2 [α (β，Y)]-吡啶基四氢吡咯。
[0023]步骤A所述的培养条件优选为28°C，时间48h。
[0024]步骤B及步骤C所述的NNK指的是4_甲基亚硝胺基-1_3_吡啶基_1_ 丁酮。[0025]步骤B所述的培养条件优选为28°C，时间48h。
[0026]步骤B所述的筛选培养基优选由不加葡萄糖的M9培养基加入0.1 % NNK制成。
[0027]步骤C所述的培养条件优选为28°C，时间48h。
[0028]一种所述短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括:
a、发酵:首先将短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)05-5402接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
培养条件为:25~30°C，时间24~36h ；
斜面培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0~12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂 15.0 ~19.0, ρΗ7.0 ~7.5 ;
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3~5v/v%，摇瓶装液量为25~35v/ ，得到发酵菌剂；
培养条件为:25~30°C，时间24~36h ；
种子培养液成分以g/L计为:胰蛋白胨8.0~12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~
6.0 ；
b、接种:在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷
施；
C、降解:喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
[0029]步骤a所述的发酵,摇瓶转速为140~160rpm。
[0030]步骤a所述的培养条件优选为28°C，时间30h。
[0031]步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为I X IO9~I X IO10个/ml。
[0032]步骤b所述的接种也可以在烟叶调制前进行。
[0033]步骤b及步骤c所述的烟叶包括白肋烟、烤烟或晒烟中的任一种。
[0034]步骤b及步骤c所述的烟叶优选白肋烟。
[0035]步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程和晾晒烟的晾晒过程。
[0036]步骤b所述的制丝指的是将烟叶原料加工成适合烟支卷制工艺要求的烟丝的加工过程。
[0037]步骤c所述的降解，对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30~40%，并于25~35°C的条件下保持5天的降解时间。
[0038]步骤c所述的降解，喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4~7天的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2~17.3%。
[0039]下面通过实施例加以说明:
实施例1
-短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402的获取与鉴定
(I)短小芽抱杆菌(·Bacillus pumilus)05-5402的获取
A、分离:烤烟K326的叶片样品采自云南省玉溪市。将烟叶样品Ig进行组织研磨，加入无菌水100ml，于室温下150rpm振荡提取30min，得到提取悬浊液。将提取的悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株；
培养条件为28°C，时间48h ；
分离培养基成分以g/L计为:琼脂15.0、K2HPO4L 6、KH2PO40.4、NaCl0.1、MgSO4.7Η200.2、CaCl20.05、MnSO4.Η200.002、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、尼古丁 1.0, ρΗ7.0。
[0040]B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株；
培养条件为:28°C，时间48h ；
筛选培养基成分以g/L计为:琼脂15.0、K2HPO4L 6、KH2PO40.4、NaCl0.1、MgSO4.7Η200.2、CaCl20.05、MnSO4.Η200.002、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η200.0002、NaMoO4.2Η200.0002、NNK1.0, ρΗ7.0。
[0041]C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，定名为05-5402菌株；
培养条件为:28°C，时间48h ；
纯化培养基成分以g/L计为:蛋白胨10.0、牛肉浸膏3.0、NaC15.0、琼脂17.0,ρΗ7.2。
`[0042](2)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402 的鉴定
对上述选育的菌株05-5402，通过常规方法进行生物学和生理生化特性检测与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下:细菌基因组DNA的提取用TaKaRa MiniBEST BacterialGenomic DNA Extraction Kit Ver.2.0,方法参见试剂盒说明书。PCR扩增选用引物F27/R1492，常规条件扩增，扩增产物经 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0回收后，连接于载体PMD18-T Vector，转化入感受态细胞E.coli DH5a，挑取白色菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
[0043]以上实验结果记录如下:
1、形态特征:该菌株于26°C培养，在显微镜下，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小，存在于菌体中。菌体平均大小为0.61~0.68 μ mX 2.2~2.8 μ m，革兰氏染色为阳性。
[0044]2、培养特征:该菌株于28 V在NA平板培养基上培养24h，菌落呈圆形，直径2~3mm,扁平无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐，为好氧菌。
[0045]3、生理生化特征:该菌株生理生化反应呈阳性的是:过氧化氢酶实验、VP实验、产H2S实验、明胶液化实验、卵磷脂酶实验；生理生化反应呈阴性的反应为:水解淀粉实验、产NH3实验、甲基红实验、吲哚实验、水解脂肪实验、硝酸盐还原实验。
[0046]4、稳定性特征:该菌株可在含有O~80g/L NaCl,pH3.0~10.0的培养基中生长，生长温度范围为10~45°c，最适宜生长温度为28~35°C，最适宜pH值为7.2~7.4。
[0047]5、16S rDNA序列分析:通过序列比对和生理生化特性将05-5402菌株鉴定为短小芽抱杆菌(Bacillus pumilus)。
[0048]本发明所述的05-5402菌株其16S rDNA序列见序列表。
[0049](3)短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402 的保藏通过上述鉴定结果，确认菌株05-5402为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的一个株系，命名为05-5402。于2013年4月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，其保藏编号为CGMCC N0.7418。
[0050]实施例2
——短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)05-5402对烟草浸提液中TSNAs的降解实验实验方法:按白肋烟末:蒸馏水=I: 10的比例混匀，超声波浸提30min后过滤，滤液加入酵母膏(1.5g/L)，调节pH至7.2~7.4。300ml三角瓶分装100ml灭菌，挑取一环筛选的05-5402菌株接种，150rpm振荡培养48h。以不接菌的白肋烟浸提液作为对照(CK)。菌液以8000rpm的速度常温离心IOmin,滤液再经0.22 μ m水相滤膜过滤,取滤液进行UPLC-MS/MS分析(范多青等，中国烟草学报，2012，18 (6):10-16)。
[0051]实验结果:由表1数据可知，菌株05-5402对白肋烟浸提液中的TSNAs降解效果良好。经48h处理，浸提液中TSNAs含量较对照降低了 22.3%。其中，NNK和NAT的含量分别降低了 47.6%和 55.8%。
[0052]表1菌株05-5402对烟草浸提液中TSNAs的降解效果
【权利要求】
1.一株短小芽孢杆菌Cfeci77w5./7--Υ7?5.) 05-5402,已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其保藏编号为CGMCC N0.7418。
2.如权利要求1所述的短小芽孢杆菌，其特征在于所述菌株可在以4-甲基亚硝胺基-1-3-吡啶基-1- 丁酮为唯一碳源和氮源的培养基中生长。
3.如权利要求1或2所述的短小芽孢杆菌，其特征在于所述菌株对调制或制丝过程烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2~17.3%。
4.一种权利要求3所述的短小芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括: A、分离:将烟株组织或植烟土壤研磨后加入无菌水，于室温下振荡提取25~35min，得到提取悬浊液，将提取悬浊液用稀释平板的方法分离能在分离培养基上生长的菌株； 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 分离培养基成分以 g/L 计为:琼脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~θ.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.ΟΟ1~Ο.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4CH2O 0.0002、尼古丁 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； B、筛选:将分离出的菌株转接到筛选培养基平板上，得到一菌落长势旺盛的细菌菌株; 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 筛选培养基成分以 g/L 计为:琼脂 12.0-18.0、K2HPO4 1.4^1.8、KH2PO4 0.3^0.5、NaCl0.08~0.12、MgSO4.7Η20 0.1~0.3、CaCl2 0.04~0.06、MnS04.H20 0.001~0.003、CuSO4.5Η200.0001、ZnSO4.7Η20 0.0002、NaMoO4.2Η20 0.0002、NNK 0.8~1.2，pH 6.5~7.5 ； C、纯化:将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即短小芽抱杆菌pumilus) 05-5402 ； 培养条件为:25~30°C，时间40~55h ； 纯化培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0-12.0、牛肉浸膏2.0~4.0、NaC14.0~6.0、琼脂15.0~19.0, ρΗ7.0~7.5。
5.如权利要求4所述的获取方法，其特征在于步骤A所述的烟株组织为烤烟Κ326的叶片或茎。
6.一种权利要求3所述的短小芽孢杆菌在烟草特有亚硝胺定向降解中的应用，包括发酵、接种及降解工序，具体包括: a、发酵:首先将短小芽孢杆菌pumilus)05-5402接种到斜面培养基上，得到发酵种子； 培养条件为:25~30°C，时间24~36h ； 斜面培养基成分以g/L计为:蛋白胨8.0-12.0、牛肉浸膏2.0-4.0、NaC14.0~6.0、琼脂.15.0-19.0, ρΗ7.0-7.5 ； 然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3~5ν/ν%，摇瓶装液量为25~35ν/ν%，得到发酵菌剂； 培养条件为:25~30°C，时间24~36h ； 种子培养液成分以g/L计为:胰蛋白胨8.0-12.0、酵母浸膏4.0~6.0、NaC14.0~6.0 ； b、接种:在烟叶调制或制丝过程中，将发酵菌剂按照烟叶或烟丝重量的3~5%进行喷施； C、降解:喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝需保持4~7天的降解时间，即可实现烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的有效降解。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为I X IO9~I X 101° 个/ml。
8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于步骤b所述的接种也可以在烟叶调制前进行。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于步骤c所述的降解，对于在调制前接种的烟叶，无需设定特殊降解条件，对于在制丝过程中接种的烟丝，需调节烟丝的水分含量为30^40%,并于25~35°C的条件下保持5天的降解时间。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于步骤c所述的降解，喷施过发酵菌剂的烟叶或烟丝保持4~7天的降解时间后，烟叶或烟丝中NNN、NNK, NAB和NAT的总降解率为12.2~17.3%。
【文档编号】C12N1/02GK103667120SQ201310610097
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】夏振远, 雷丽萍, 汪安云, 吴玉萍, 莫笑晗, 马雁军, 周俊 申请人:云南省烟草农业科学研究院