木质素降解细菌的分离和适应性培养的方法

专利名称：木质素降解细菌的分离和适应性培养的方法
技术领域：
本发明涉及一种采用从特定地点分离出的木质素降解菌的设定聚生体降解木质素的新的需氧型生物方法。
背景技术：
真菌木质素是生物圈中最丰富的芳香族聚合物。在所有维管植物的细胞壁内都发现了与纤维素和半纤维素相结合存在的木质素。由于木质素相互之间的单元键是不可水解的，因此木质素难以发生化学降解或生物降解。在植物细胞壁内，木质素围绕在纤维素周围而形成基体，该基体本身是难降解的。木质素发生生物降解是造成木材在使用中发生多数天然破坏的原因，并且也可能在植物致病中起到了关键作用。另一方面，降解木质素的生物和它们的酶的潜在应用已经引起了关注，原因是它们可以为纸浆和纸工业提供环保技术。迄今为止，仅有少量的微生物群落能降解复合的木质素聚合物，最好的例子就是白色腐朽菌(white rot fungi)。关于生物降解木质素的多数研究都仅集中于一些真菌，如黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、Streptomycesviridosporus、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、硬毛栓菌(Trametes trogii)、层出镰刀菌(Fusarium proliferatum)(Regaldo等，1997)等。(1)在木材中引起白腐病的木腐担子菌类真菌是自然界中最有效的木质素降解物(Kirk and Farrell，1987；Eriksson等，1990)，且它们可能是木质素化组织的碳循环中的主要的天然试剂。尚未公开过其他微生物可作为纯培养物而有效地使木质素化的组织发生矿化(Kirk and Cullen，1998)。木腐担子菌类真菌在分类学上是一群异种高等真菌，其特征在于它们能利用一组细胞外的木质素降解酶来解聚和矿化木质素。在过去30年内，人们已经在有关生物技术应用，如生物制浆、生物漂白、纸浆厂派出污水、以及土壤生物补救技术方面对白色腐朽菌作用的木质素降解进行了深入细致的研究(Akhtar等，1992，1998；Lamar等，1992；Messner和Srebotnik，1994)。
人们已经对黄孢原毛平革菌的木质素降解进行了酶学和生物分子学的研究(Gold和Alic，1993；Cullen，1997；Kirk和Cullen，1998)。
许多木质素降解所必需的酶在20世纪80年代初期以前都未得到鉴定，当时只有漆酶是已知的。由于在20世纪80年代初期发现了两种重要的过氧化物酶，即1983年发现的木质素过氧化物酶(LiPs)和1984年发现的锰过氧化酶(MnPs)(Kirk和Farrell，1987)，因而能从真菌中分离出一系列酶并对它们进行了详细的鉴定。
LiP(木质素过氧化物酶)被认为是白色腐朽菌作用的木质素生物降解中的一种关键酶。人们构建了对编码P.chrysosporium的主要木质素过氧化物酶(LiP)同功酶的基因特异性的DNA探针。这些探针用于研究LiP酶在规定的低氮介质中的瞬时表达(Boominathan等，1993)。
也发现通用的子囊菌——曲霉菌能快速转化较宽范围的木质素相关性芳香族化合物。曲霉菌已显示能大量产生高水平的半纤维素水解酶。(4)Maria Teresa等已经说明了Bjerkandera sp.菌株BOS55是一种白色腐朽菌，它可漂白EDTA提取的桉树氧脱木素牛皮浆(UKP)而不需要锰。进一步地，在不存在锰的条件下，加入浓度为1-5mM的简单生理学有机酸(如羟基乙酸盐，乙醛酸盐，草酸盐以及其他)刺激了亮度增加，且纸浆去木质素作用是不加入酸的情况下的2-3倍。这一刺激归因于MnP和LiP的产量增加，以及藜芦基醇和草酸盐的生理学浓度增加。这些因素能显著提高超氧化物阴离子根的量，同时说明了引起更广泛的生物漂白的原因(5)。
迄今为止，所有的基础研究和应用研究工作都仅仅集中于真菌。在对生纸浆进行生物漂白的情况下，由于真菌的丝状体引起了空间位阻，使得利用真菌是不可行的。因此，鉴定出具有木质素氧化酶的细菌将具有重大意义。
细菌细菌在木质素生物降解中的作用仍处于推测中。一些工作者已经证明了混合的(Sundman等，1968)或纯的细菌培养物(Sorensen，1962)能在作为碳源的木质素上生长。Pseudomonas spp.是Kawakami(1976)以及Odier和Monties(1977)要求保护的，其可以降解植物木质素。Odier和Montis也指出了几种其他的细菌菌株，这些细菌菌株可在7天时间内消耗掉50％以上处于含葡萄糖的矿物介质中的木质素。
采用几株诺卡氏菌(Nocardia)和假单胞菌(Pseudomonas spp.)以及一些从废木质素含量高的河水中分离出的未经鉴定的细菌，测定它们从特异性14C-标记的松柏醇(DHP)或玉米秆木质素的脱氢聚合物中释放14CO2的能力。然而，它们中仅有一部分能从标记的木质素中释放出大量的14CO2。所测试的Nocardia spp.比Pseudomonas spp.以及未经鉴定的细菌的活性更高。(6)放射菌是在木质纤维素发生分解的土壤和堆肥中发现的丝状细菌。有几份报道所提供的证据表明属于链霉菌属的几个种能降解木质素。其他降解木质素的放射菌包括嗜中温高温单孢菌(Thermomonospora mesophila)，马杜拉放线菌(Actinomadura)和微单孢菌(Micromonospora)，链霉菌(Streptomyces)具有最高的降解木质素的能力。在多数研究中，在含有木质纤维素的培养物中产生了大量降解木质素的酶，这表明诱导机制是有效的。
在研究白蚁和它们的肠内微生物的共生关系时，Ajit Verma等(1994)断定白蚁土壤和白蚁内脏细菌两者在聚合物的解聚作用方面都起到了重要作用。内脏细菌能更有效地降解纤维素物质和半纤维素物质。从白蚁内脏的纯培养物中获得了水解纤维素和半纤维素的几种细菌分离物。其中的一些是节杆菌(Arthrobacter sp.)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，梭杆菌(Clostridiumsp.)，微球菌(Micrococcus sp.)，链霉菌(Streptomycessp.)，粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)。从白蚁内脏中仅获得了一些分解木聚糖的细菌(Micrococcusluteuns，绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa))。白蚁引起的木质素降解中的问题让人迷惑，原因是大量白蚁内脏是厌氧的，而木质素降解的天然厌氧机制是未知的(7)。
Berrocal等(1997)已经表明了来自在固态发酵物中生长的链霉菌(streptomyces sp.)的无细胞滤液能溶解至多20％的[14C]木质素。发现细胞外过氧化物酶和酚氧化酶(漆酶)这两种酶的活性与木质素的溶解速率和矿化速率有关。(8)往往与真菌有关的腐烂木材中所存在细菌已成为许多报道的主题。然而，细菌对降解木材成分的确切作用仍然是不清楚的。尽管营养物氮的可利用度抑制了合成的14C木质素在白腐真菌(Phanerochaete Chrysosporium)的作用下代谢成为CO2，但利用细菌Streptomyces badius来降解木质素时，最适宜采用大量的有机氮。(9)表现出很强的漂白硬木牛皮浆能力的细菌分离物中(如在前处于审理中的专利申请中所报道)，只有少数细菌分离物具有降解木质素的能力。
酶是代谢的催化基础，因此不仅是生物学界、也是工艺设计者/工程师/化学工程师以及其他科学领域研究人员们在全世界范围的热切研究焦点。
由于酶在古时候就已经在许多制造工艺，如酒、奶酪、面包等的制造中发挥核心作用。20世纪后半叶，人们在基础研究和潜在工业应用的广泛领域中利用微生物、其代谢产物和酶的知识有了史无前例的增长。然而，仅在过去的20年内，微生物酶才在纸浆和纸工业中有商业化应用。(10)酶在造纸业中的最普通应用是用于改进漂白。在1988年和1993年之间提交了至少15份涉及改进牛皮浆漂白的酶处理的专利或专利公开文献。
木质素，准确地应称为″天然塑料″，尽管它能抵抗微生物的攻击，但某些丝状真菌却能将其降解为CO2水平。截止1981年，人们还不是很清楚酶在木质素解聚中的作用。来自密歇根大学的Ming Tien等公开了降解木质素的酶。
在由真菌引起的木质素生物降解过程中起作用的主要酶是两种含有细胞外血红素的过氧化物酶木质素过氧化物酶(LiP，EC 1.11.1.14)和锰过氧化物酶(MnP，EC1.11.1.13)(Kirk等，1987)，Gold等(1989)；Hatakka(1994)。
LiP和MnP的主要区别在于被氧化的底物的性质。LiP能直接氧化非酚类或酚类木质素结构，从而分别生成芳基阳离子基团和苯氧基(Kirk，1987)。对于MnP，主要的还原底物是二价锰离子Mn2+。MnP在合适的螯合剂存在下的催化性循环产生了高活性的Mn3+螯合物，该螯合物能分别氧化各种酚类和以碳为中心的残基。(Wariishi等，1989；Hofrichter等，1998)。
通常，MnP不能氧化或解聚抵抗性更强的，构成了木材中约90％木质素的非酚类木质素结构。有趣的是，因为LiP和其它酶太大而不能渗透木制纤维素，对木质素的主要攻击似乎要求低分子量的试剂(Call等，1997)。由于这些矛盾，人们提出了通过小介质如thiyl或脂质基团的作用，使MnP分裂非酚类木质素结构的机制(Wariishi等，(1989)，Bao等，(1994))。
生长介质中的Mn(II)浓度在很大程度上影响了木质素过氧化物酶和漆酶的分泌方式。在以低Mn(II)浓度(2.4，μM)或高Mn(II)浓度(24和120μM)的胞外蛋白为对象的快速蛋白液相色谱曲线中未发现过氧化物酶。(16)人们已经提出另一种酶——胞外酚氧化酶(漆酶)在木质素降解中的作用，且近来证明了漆酶可参与木质素降解。(Bourbonnais和Paice 1990；1992Srinivasan等1995)。漆酶是一种含铜多酚氧化酶，已知漆酶能通过除去电子来催化许多无机和芳香族物质的氧化反应，该反应伴随着将O2还原为水。但是，尚未证明漆酶在生物漂白中的用途。
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发明目的本发明的主要目的是为降解木质素而提供一种新型的木质素降解菌聚生体。
本发明的又一目的是提供一种采用上述定义的木质素降解菌来降解木质素的新型生物方法。
本发明的再一个目的是提供一种制备能降解木质素的木质素降解菌聚生体的方法。
发明概述本发明提供了一种用于降解木质素的新型木质素降解菌聚生体，还提供了一种采用所述的木质素降解菌聚生体来降解木质素的生物方法。木质素降解菌是从锯屑连续长时间堆积的印度特定地点分离出的。培养所述的细菌来提高其降解木质素的能力，并最终制成聚生体来降解木质素。
发明详述本发明涉及用于降解木质素的木质素降解菌的协同聚生体，所述的聚生体包括菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的任意可能组合，这三种菌株保藏在印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098，其中每一种的含量都为20-40wt％。
在本发明的又一种实施方式中，聚生体包括比例相等的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的又一种实施方式中，细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
在本发明的又一种实施方式中，细菌是从印度Roorkhee的锯屑和土壤混合物中分离出的。
在本发明的又一种实施方式中，聚生体能降解至多0.8％的木质素。
在本发明的又一种实施方式中，MTCC 5094的性状是革兰氏阴性小杆菌。
在本发明的一种实施方式中，MTCC 5095的性状是革兰氏阴性球菌。
在本发明的又一种实施方式中，MTCC 5098的性状是革兰氏阴性长杆菌。
本发明设计的细菌分离物在基因组学与综合生物学研究所(IGIB)作为CBTCC保藏，对它们的鉴定正在进行中。
序号 培养物 保藏号1.CBTCC/52-03MTCC 50942.CBTCC/53-03MTCC 50953.CBTCC/54-03MTCC5098这些细菌分离物显示出能在规定的条件下降解木质素的重要能力。
本发明的细菌分离物是从印度Roorkee的木材工场分离出的，在此木材工场中锯屑连续堆积了10-12年。
本发明还提供了一种分离出能降解木质素的细菌分离物并培养该细菌分离物的方法，该方法包括a)在规定的条件下，采用土壤浸出液和特殊的诱导物对所述地点的细菌群进行富集；b)采用不同的介质(0.3木质素+琼脂；土壤浸出液+琼脂；50％土壤浸出液+琼脂；0.3％木质素+50％土壤浸出液)从所述地点捕获最大量的细菌群；c)在设定的介质、温度、pH、碳原等条件下培养从特定地点分离出的所述细菌；
d)将分离的细菌分离物接种到10ml 0.4％木质素中，检测它们降解木质素的能力；e)采用公知的分光光度法测定木质素降解程度；f)选择出能有效使木质素脱色的细菌分离物；g)对所选细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，观察它们的木质素降解活性的提高程度；h)进一步选择并制成不同的细菌分离物，观察它们对降解木质素的协同作用；i)在规定的条件下培养所述的细菌，以检测粗样品以及浓缩样品中的酶活性。在装有1000ml培养物的2升烧瓶中采用含有1.0％葡萄糖的MSM来生长培养物。培养烧瓶在30℃/120rpm下接种3天以实现旺盛生长；j)在达到旺盛生长O.D.(1.00)之后，对得到的培养物进行离心处理；k)收集上清液，采用硫酸铵进行浓缩，然后进行透析；l)在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，分析粗样品和浓缩样品两者中的木质素过氧化物酶。
在木发明的一种实施方式中，细菌是从印度Roorkee的特殊锯屑地点分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，对来自所述地点的土壤进行富集是这样进行的取5g新鲜土壤放入装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素、1mM藜芦基醇和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶以120rpm的转速在30℃下保持96小时。
在本发明的另一种实施方式中，采用四类不同的介质(0.3木质素+琼脂；土壤浸出液+琼脂；50％土壤浸出液+琼脂；0.3％木质素+50％土壤浸出液)来捕获所述地点的最大细菌群。
在本发明的另一种实施方式中，在介质、温度、pH、碳原等的规定条件下培养分离出的细菌分离物。
在本发明的另一种实施方式中，通过在10ml 0.4％木质素中接种所有细菌分离物，从而检测它们降解木质素的能力。通过公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
在本发明的另一种实施方式中，对一些选择出的细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，观察它们的木质素降解活性的提高。将细菌接种到0.5％-1.0％的木质素中，并在30℃下保持3个月。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
在本发明的另一种实施方式中，进一步将筛选的细菌分离物被制成许多聚生体，观察它们对降解木质素的协同作用。
在本发明的另一种实施方式中，在2升装有1000ml培养物的烧瓶中，采用含有1.0％葡萄糖的MSM生长培养物来进行酶研究。培养烧瓶在30℃/120rpm的条件下接种3天，以实现旺盛生长。
在本发明的另一种实施方式中，对培养物进行离心处理，收集上清液，然后采用80％硫酸铵沉淀并进行透析。
在本发明的另一种实施方式中，通过在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，分析粗样品和浓缩样品两者中的木质素过氧化物酶。
本发明还提供了一种木质素的降解方法，该方法包括在25-35℃下，使含有菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的细菌聚生体在含有木质素的溶液中接种1-5天，所述的菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03保藏在印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。这些微生物也已经保藏在DeutscheSamlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH，保藏号为微生物 DSMZ ID细菌CBTCC/52-03--------03-498A粘质沙雷氏杆菌(Serratia marcescens)CBTCC/53-03--------03-499P绿脓杆菌(seudomonas aeruginosa)CBTCC/54-03--------03-504P绿脓杆菌(seudomonas aeruginosa)在本发明的一种实施方式中，细菌聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098的全细胞细菌分离物。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC5095和MTCC5098，其中每一种的浓度为20-40wt％。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体包括等比例的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
在本发明的另一种实施方式中，细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，细菌是从印度奈尼塔尔邦(Uttar pradesh)的Roorkhee的锯屑和土壤混合物中分离出的。
在本发明的另一种实施方式中，聚生体能降解至多0.8％的木质素。
为了分离木质素降解菌，进行适当的富集。为提高需要的细菌的产率，将来自所述地点的5g新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶(杀真菌的)中。在120rmp下使富集烧瓶在30℃下保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在50℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下进行高压灭菌处理1小时。高压灭菌处理之后，将样品在5000rpm下离心处理10分钟。收集上清液(浸出液)，在进一步使用之前先储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶。
富集后的土壤样品在0.85％的盐水中连续稀释。从各个稀释液中分别取出100μl，在含有土壤浸出液，50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开，以分离出木质素降解菌。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
根据木质素的脱色程度，在36个分离物中总共选择出15个细菌分离物进行进一步的研究。为提高选择出的细菌分离物的木质素降解活性，进行适应较高浓度木质素的培养。所有的15个分离物在10ml 0.5％-1.00％的木质素中接种。所有试管都在30℃下保持3个月。进行长时间的培养之后，选择8个细菌分离物进行进一步的研究。选择出的分离物能使至多0.7％的木质素脱色。
采用公知的分光光度法测定木质素降解程度。为观察这些细菌分离物的协同作用，设计了许多聚生体并测试它们降解木质素的能力。发现包括被称为MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098的三种细菌的聚生体能降解至多0.8％的木质素。
为找到木质素在酶水平上的降解机制，进行木质素过氧化物酶(一种用于木质素降解的重要酶)的酶分析试验。将所有3种细菌在含有1％葡萄糖的1升最小量盐介质(MSM)中接种。为引入木质素降解酶，向培养物中加入1mM藜芦基醇。所有的培养物在振荡条件下(100-120rpm)于30-35℃下温育3天。
观察到旺盛生长之后，所有培养物在4℃下以10,000rpm离心分离，收集上清液以检测酶活性。
为浓缩细胞外酶，采用100％饱和硫酸铵溶液进行80％硫酸铵沉淀，然后进行后续的透析。
既对不含细胞的粗提取物，也对浓缩的样品进行木质素过氧化物酶的酶分析试验。为进行酶分析试验，向酒石酸(pH 3)缓冲液中加入10mM藜芦基醇，5mM H2O2和400μl酶溶液。在310nm下监测产物(藜芦基醛)的形成。木质素过氧化物酶催化藜芦基醇被H2O2氧化成藜芦基醛的反应。藜芦基醇在310nm处无吸收，但藜芦基醛具有强吸收(摩尔消光系数＝9300M-1cm-1)。所有三种细菌分离物都显示出不同程度的木质素降解活性。
本发明还参照附随的实施例展开进一步描述，但实施例是以阐述的方式给出，因此不应被曲解为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1在对木质素降解菌的努力探索中，进行了战略性的分离，以从特定地点捕获最大量的木质素降解菌。
分离点是位于印度Roorkee的一个工场，锯屑在这里连续堆积了10-12年。
为分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，使5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开，以分离出木质素降解菌。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
实施例2为分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，将5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
表1.以木质素(0.4％)作为唯一碳源的细菌降解


实施例3为从特定地点分离出木质素降解菌，进行适当的富集。为提高所需细菌的产率，将5g来自所述地点的新鲜土壤接种到装有100ml土壤浸出液、0.3％木质素和50μl Candid B的500ml高压灭菌烧瓶中。富集烧瓶在120rpm下于300℃保持96小时。
为制备土壤浸出液，取1Kg土壤，使其在500℃下干燥2小时。将400g干燥后的土壤溶解在960ml单独的蒸馏水中，并在151bs下高压灭菌1小时。进行高压灭菌之后，样品在5000rpm下离心10分钟。收集上清液，将其储存在灭菌瓶中，用于制备富集烧瓶和进一步使用。
富集的样品在0.85％盐水中进行连续稀释。从各个稀释液中取出100μl，在含有土壤浸出液、50％营养琼脂和0.2％木质素的培梯式培养皿上展开。如此获得的培养皿以倒转层位方式在30±2℃温育24-96小时。
根据菌落的形态和颜色选择出总共36个分离物，检测它们的木质素降解活性。挑选单独的分离菌落并将其划线到含有相同介质的新鲜培养皿上。重复上述步骤，直到获得纯的菌落。
为检测分离的细菌的木质素降解活性，将10ml 0.4％木质素装入30ml试管中，分别接种所有的细菌分离物。3天之后，不同的细菌分离物表现出对木质素具有不同的脱色程度。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。
根据木质素的脱色程度，从36个中选出总共15个细菌分离物，即L4，L5，L8，L10，L11，L13，L18，L20，L20，L22，L23，L27，L28，L29，L35和L36进行进一步研究。为提高选择出的细菌分离物的木质素降解活性，对它们进行适应较高浓度木质素的培养。所有的15个分离物在10ml 0.5％-1.00％的木质素中接种。所有试管都在30℃下保持3个月。进行长时间的适应性培养之后，选择8个细菌分离物，即L4，L5，L10，L13，L28，L29，L35和L36进行进一步的研究。采用公知的分光光度法测定木质素降解程度，选择出的分离物能使至多0.7％的木质素脱色(表2)。
表2对选择出的木质素降解菌进行适应较高浓度木质素的驯化

实施例4为观察培养的细菌的协同作用，设计了许多聚生体并测试它们降解木质素的能力。取三种细菌分离物而设计出聚生体。所有的聚生体都从能降解至多0.7％的木质素的8种细菌分离物，即L4，L5，L10，L13，L28，L29，L35和L36中制备。测试这些聚生体在协同方式下的木质素降解活性。
为了从用于生物降解研究的聚生体中制造接种体，将来自三种不同细菌的琼脂平板的环分别接种到含有1％葡萄糖的10ml MSM中。培养物在以100-120rpm振荡的培养摇瓶中于30℃下温育16-24小时。温育之后，在650nm下测定光学密度。通过稀释或浓缩细菌悬浮液，将培养物的光学密度保持为1.00。将所有3种培养物等比例混合，制得接种体。采用不同聚生体的接种体接种不同浓度的木质素(0.7％，0.8％，0.9％，1.0％)。所有的试管都在30℃下温育3天。采用公知的分光光度法测定木质素的降解程度。最后，选择出L35，L36和L13作为有效的木质素降解物，它们能降解至多0.8％的木质素。
表3木质素降解菌对木质素降解的协同作用


实施例5为找到木质素在酶水平上的降解机制，进行木质素过氧化物酶(一种用于木质素降解的重要酶)的酶分析试验。将能降解至多0.8％的聚生体16(表3)的所有3种细菌L35，L36和L13分别接种到含有1％葡萄糖的1升最小量盐介质(MSM)中。为引入木质素降解酶，向培养物中加入1mM藜芦基醇。所有的培养物在振荡条件下(100-120rpm)于30-35℃下温育3天。观察到旺盛生长之后，所有培养物在4℃下以10,000rpm离心分离，收集上清液以检测酶活性。为浓缩胞外酶，采用100％饱和硫酸铵溶液进行80％硫酸铵沉淀，然后进行后续的透析。
既对不含细胞的粗提取物，也对浓缩的样品进行木质素过氧化物酶的酶分析试验。为进行酶分析试验，向酒石酸(pH 3)缓冲液中加入10mM藜芦基醇、5mM H2O2和400μl酶溶液。在310nm下监测产物(藜芦基醛)的形成。木质素过氧化物酶催化藜芦基醇被H2O2氧化成藜芦基醛的反应。藜芦基醇在310nm处无吸收，但藜芦基醛具有强吸收(摩尔消光系数＝9300M-1cm-1)。所有三种细菌分离物都显示出不同程度的木质素降解活性(表4)。
表4


优点细菌引起的木质素降解对纸浆和纸工业废水的生物修复技术有重大意义。
木质素的细菌降解使人们对工业木质素废物转化为有用商品有了新的理解。
权利要求
1.一种用于降解木质素的木质素降解细菌的协同聚生体，所述的聚生体包括任意组合的菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03，这三种菌株保藏于印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
2.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述聚生体包括每一种的含量均为20-40wt％的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
3.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述聚生体包括等比例的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
4.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
5.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述细菌是从印度奈尼塔尔邦的Roorkhee的锯屑和土壤分离出的。
6.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，MTCC 5094的性状是革兰氏阴性小杆菌。
7.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，MTCC 5095的性状是革兰氏阴性球菌。
8.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述MTCC 5098的性状是革兰氏阴性长杆菌。
9.如权利要求1所述的协同细菌聚生体，其中，所述聚生体能降解至多0.8％的木质素。
10.一种制备细菌聚生体的方法，该细菌聚生体包括用来降解木质素的所培养的木质素降解菌分离物CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC/54-03，这三种细菌保藏在布达佩斯条约承认的印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，序号 培养物 保藏号1.CBTCC/52-03MTCC 50942.CBTCC/53-03MTCC 50953.CBTCC/54-03MTCC 5098所述的方法包括下列步骤a)从将要提取细菌的地点对细菌群进行富集；b)采用不同的介质分离出木质素降解菌；c)在介质、温度、pH、碳原等的规定条件下培养在步骤b)中分离的细菌；d)将分离的细菌分离物在10ml 0.4％木质素中进行接种，检测它们降解木质素的能力；e)选择出能有效地使木质素脱色的细菌分离物；f)对所选的细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，观察它们的木质素降解活性的提高程度；g)进一步筛选并配制细菌分离物，观察它们对降解木质素的协同作用；h)从步骤g)的所选细菌中选择出包括三种能降解至多0.8％的木质素的细菌分离物的微生物聚生体，并且在需要的情况下，i)在规定的条件下培养所述聚生体的细菌分离物，以检测粗样品以及浓缩样品中的酶活性；j)在达到旺盛生长O.D.(1.00-1.20)之后，对得到的培养物进行离心处理；k)收集上清液，采用硫酸铵沉淀进行浓缩，然后进行透析；以及1)在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，分析粗样品和浓缩样品两者中的木质素过氧化物酶。
11.如权利要求10所述的方法，其中，所述土壤富集是在100ml土壤浸出液和0.3％木质素中进行96小时。
12.如权利要求10所述的方法，其中，所述木质素降解菌的分离是采用四种介质进行的0.3木质素+琼脂；土壤浸出液+琼脂；50％土壤浸出液+琼脂；0.3％木质素+50％土壤浸出液。
13.如权利要求10所述的方法，其中，所述分离的细菌分离物的培养是在pH 6.8-7.2和30-35℃的条件下进行的。
14.如权利要求10所述的方法，其中，所述木质素的降解是通过将分离的细菌分离物接种到10ml 0.4％木质素中来进行的。
15.如权利要求10所述的方法，其中，对所选的细菌分离物进行适应较高浓度木质素的培养，所述的木质素在30ml试管中的含量为0.5％-1％。
16.如权利要求10所述的方法，其中，所述包括三种木质素降解菌的聚生体是通过测试分离出的细菌的不同组合，然后选择出已能降解至多0.8％木质素的聚生体而得到的。
17.如权利要求10所述的方法，其中，所述聚生体的细菌分离物分别在含有1.0％葡萄糖的1000ml最小量盐介质中进行培养。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述培养烧瓶在100-120rpm和30-34℃下温育3天达到旺盛生长。
19.如权利要求10所述的方法，其中，所述培养物在4℃下以10,000rpm离心30分钟。
20.如权利要求10所述的方法，其中，采用80％硫酸铵沉淀浓缩所述收集的上清液，然后进行透析。
21.如权利要求10所述的方法，其中，通过在310nm下采用分光光度法测定产物(藜芦基醛)的形成，既对粗样品，也对浓缩样品中的所述木质素过氧化物酶进行分析。
22.如权利要求10所述的方法，其中，所述锯屑土壤在提取前先进行富集，以得到所需的木质素降解菌落。
23.如权利要求10所述的方法，其中，所述锯屑土壤的富集方法为a)在土壤浸出液和0.3％木质素中进行所述土壤的富集；b)使富集烧瓶在100-120rpm/30-32℃的条件下进行温育。
24.如权利要求23所述的方法，其中，5-7g的所述土壤在100-120ml土壤浸出液和0.3％木质素中进行富集。
25.如权利要求23所述的方法，其中，所述富集在100-120rpm/30-32℃的条件下进行96小时。
26.如权利要求10所述的方法，其中，所述木质素降解菌是采用下列介质从锯屑地点分离出的a)0.3木质素+琼脂；b)土壤浸出液+琼脂；c)50％土壤浸出液+琼脂；d)0.3％木质素+50％土壤浸出液。
27.如权利要求10所述的方法，其中，所述分离出的木质素降解菌株通过下列步骤进行适应较高浓度木质素的培养a)在0.5％-1.00％的木质素中接种分离出的菌株，以及b)使试管在30-32℃下进行长时间温育。
28.如权利要求27所述的方法，其中，所述木质素降解菌分离物接种到0.5％-1.00％的木质素中。
29.如权利要求27所述的方法，其中，所述木质素的接种试管在30-32℃下保持3个月。
30.一种降解木质素的方法，该方法包括将包括菌株CBTCC/52-03，CBTCC/53-03和CBTCC54-03的细菌聚生体接种到含有木质素的溶液中，在25-35℃下培养1-5天，以上三种菌株保藏于印度昌迪加尔IMTECH的国际保藏中心，保藏号分别为MTCC 5094，MTCC5095和MTCC5098。
31.如权利要求30所述的方法，其中，所述细菌聚生体包括菌株MTCC5094，MTCC 5095和MTCC 5098的全细胞细菌分离物。
32.如权利要求30所述的方法，其中，所述聚生体包括菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC 5098。
33.如权利要求30所述的方法，其中，所述聚生体包括每一种的含量均为20-40wt％的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
34.如权利要求30所述的方法，其中，所述聚生体包括等比例的菌株MTCC 5094，MTCC 5095和MTCC5098。
35.如权利要求30所述的方法，其中，所述细菌是从锯屑和土壤的混合物中分离出的。
36.如权利要求30所述的方法，其中，所述细菌是从印度Roorkhee的锯屑和土壤的混合物中分离出的。
37.如权利要求30所述的方法，其中，所述聚生体能分解至多8.0％的木质素。
全文摘要
本发明提供了一种采用木质素降解菌的聚生体来降解木质素的新方法。本发明也公开了从特定地点分离细菌并对木质素降解菌进行适应性培养的方法。
文档编号C12R1/385GK1764717SQ200380110268
公开日2006年4月26日 申请日期2003年11月7日 优先权日2003年3月21日
发明者丽塔·库马尔, 阿尼尔·库马尔 申请人:科学与工业研究委员会