专利名称：一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质，具体涉及一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质。
背景技术：
致盲的原因有多种，由于各种原因导致眼睛的血管增生是主要的致盲原因之一。 引起眼睛的血管增生的常见病因有1、各种慢性进行性高血压或动脉硬化以及视网膜静脉炎等疾病并发的视网膜中央静脉总干或分支阻塞和糖尿病视网膜病变等引起的视网膜大面积慢性毛细血管缺血、缺氧、产生血管生成因子，从而导致新生血管形成。2、早产儿视网膜病变，多见于过量吸氧。早产儿视网膜尚未发育完善，以周边部最不成熟，处于高氧环境下，视网膜血管收缩、阻塞，使局部缺血、缺氧，诱发视网膜血管异常增生。3、渗出性年龄相关性黄斑变性、病理性近视等眼底退行性变性。大多位于后极部，是典型的脉络膜毛细血管-玻璃膜-视网膜色素上皮复合体病变。玻璃膜连同色素上皮皲裂，脉络膜血管增生并由皲裂处向视网膜神经上皮层下生长。4、各种原因所致的角膜损伤、溃疡或炎症引起的角膜或结膜血管增生。目前对于上述原因所致的眼睛的血管增生主要是采取中医疗法或激光等物理疗法，但是疗效不理想，尚没有特效的抑制眼睛的血管增生的药物。致使血管增生导致的盲症还没能得到有效的控制，而是随着老龄人口的增加等原因，血管增生所致的盲症呈增多之趋势。当前，亟待于开发新的抑制眼睛血管增生的药物。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质。本发明所采用的技术方案是一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质 (Canstatin-N)，具有以下基因序列ATG GTC AGC ATC GGC TAC CTC CTG GTG AAG CAC AGC CAG ACG GACCAG GAG CCC ATG TGC CCG GTG GGC ATG AAC AAA CTC TGG AGT GGA TACAGC CTG CTG TAC TTC GAG GGC CAG GAG AAG GCG CAC MC CAG GACCTG GGG CTG GCG GGC TCC TGC CTG GCG CGG TTC AGC ACC ATG CCC TTCCTG TAC TGC MC CCT GGT GAT GTC TGC TAC TAT GCC AGC CGG MC GACMG TCC TAC TGG CTC TCT ACC ACT GCG CCG CTG CCC CAT CAT CAT CATCAT CATTAG0上述蛋白质(Canstatin-N)由基因序列编码的氨基酸组成如下Met Val Ser lie Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met CysPro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln GluLys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr MetPro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys SerTyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro His His His His His His。本发明所提供的蛋白质(Canstatin-N)的制备方法是提取人脐带静脉基因组 DNA作为模板，根据血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨基酸基因片段(canstatin-N) 的序列合成基因片段特异引物
上游引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下游引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCC A 3，；用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨基酸基因片段canstatin-N，并在其序列的C末端加上his纯化标签(经DNA序列分析证明正确)；然后将这一基因片段重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表达Canstatin-N蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Canstatin-N蛋白。通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋白印迹实验证明纯化的目标蛋白正确(纯化的目标蛋白能够与Canstatin-N蛋白的抗体发生特异结合)；通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成试验证明纯化的Canstatin-N蛋白具有抑制新生血管生成的活性。利用上述蛋白质制备医药制品，可有效地治疗人眼睛血管增生。本发明所提供的Canstatin-N蛋白是一种血管生成抑制因子，用Canstatin-N 蛋白进行抑制人血管内皮细胞试验，证明Canstatin-N蛋白致使人血管内皮细胞凋亡率达93% ；通过建立试验小鼠眼睛血管增生模型，然后用Canstatin-N蛋白进行治疗，证明 Canstatin-N蛋白能有效地治疗眼睛视网膜血管增生，是一种治疗眼睛血管增生的药物。本发明以人脐带静脉基因组DNA为模板进行扩增得到canstatin-N基因，将 canstatin-N基因重组于Pichia pastoris基因组进行表达获得的Canstatin-N蛋白，可有效地提高血管内皮细胞凋亡率，抑制人血管内皮细胞，有效地抑制和治疗眼睛视网膜血管增生，为生产特效的抑制眼睛血管增生的药物的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。
具体实施例方式下面对本发明做进一步说明。Canstatin-N 蛋白的制备1、提取人脐带静脉基因组DNA作为模板，根据血管能抑素的N端1 89氨基酸基因片段的序列合成基因片段特异引物上游引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下游引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCC A 3，；用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素(canstatin)的N端1 89氨基酸基因片段canstatin-N，并在其序列的C末端加上his纯化标签。2、从Pichia pastoris中扩增pGAP启动子(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)(pGAP 是Pichia pastoris的组成型强启动子)；3、通过DNA的酶切和连接作用，将步骤1获得的融合了 his纯化标签的 canstatin-N DNA插入Pichia pastoris表达载体(pGAP为启动子，G418抗性基因作为筛选标记，不含引导蛋白分泌的信号肽)的多克隆位点，将这一载体转化Pichia pastoris基因组，并将转化物涂布于G418-YPD平板含G418为彡300 μ g/mL的YPD平板。4、从步骤3的G418-YPD平板在挑选Pichia pastoris重组子作为工程菌株；
5、将工程菌株菌液接种于液体培养基中液体培养基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白胨 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反应器中进行发酵表达 Canstatin-N蛋白。其发酵参数为温度观 30°C，pH5. 0，搅拌转速200-900r/min。发酵 1 2d后离心收获细胞。用蜗牛酶(6mg/mL，用lmol/L的山梨醇配置)裂解细胞，离心收获上清。先用离子交换剂(SP-kpharose FastFlow)进行纯化，然后用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒进行进一步纯化Canstatin-N蛋白。通过蛋白电泳(在SDS-PAGE上呈现纯化的目标蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋白印迹实验(纯化的目标蛋白能够与Canstatin-N蛋白的抗血清特异结合)证明纯化的目标蛋白正确；通过抑制鸡胚绒毛尿囊膜新生血管生成试验(纯化的目标蛋白能抑制6天龄鸡胚绒毛尿囊膜的新生血管的生成)证明纯化的Canstatin-N蛋白具有抑制新生血管生成的活性。实用例一、取Canstatin-N蛋白0. 8mg溶解于5ml生理盐水(0. 85% NaCl)，用孔径为0. 1 μ m的滤膜过滤除去细菌及病毒，然后加于995ml无菌的生理盐水中制备成滴眼液。实用例二、取Canstatin-N蛋白0. 5mg溶解于5ml PBS溶液(每升PBS溶液的制备=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HP041. 44g, KH2P040. 24g 溶解于 800ml 蒸馏水中盐酸调 pH 到 7. 4然后加水补充到1000ml，15磅20分高压灭菌冷却至室温)，用孔径为0. 1 μ m的滤膜过滤除去细菌及病毒，然后加于995ml无菌的PBS溶液中制备成滴眼液。滴眼液疗效检测实验一(一 )视网膜血管增生模型的制作取30只7天龄新生昆明种小鼠。将其中的20只7天龄新生昆明种小鼠与母鼠一起放置于密闭的玻璃器中，输入医用纯氧气，用自动调控测氧仪维持箱内氧饱和度75%，持续5天。5天后，将这些新生大鼠移入正常氧环境中再饲养7天，诱发新生鼠视网膜血管新生。另外10只7天龄新生昆明种小鼠与母鼠置于正常氧环境中再饲养12天。作为正常对照鼠(C组)。( 二 )滴眼液治疗视网膜血管增生方法将以上制备的视网膜血管增生模型鼠分成两组(A，B)，每组10只。A组鼠的左(AL) 眼滴实例1制备的滴眼液，每只眼睛滴25 μ 1/次，每天3至5次；右眼(AR)滴生理盐水，每只眼睛滴25μ 1/次，用药频率同左眼；B组鼠的左眼(BL)滴实例2制备的滴眼液，每只眼睛滴25 μ 1/次，每天3至5次；右眼(B 滴PBS溶液，每只眼睛滴25 μ 1/次，用药频率同左眼。治疗时间为三周。(三)滴眼液治疗视网膜血管增生的疗效分析将以上20只试验鼠处死，眼球摘除后放入多聚甲醛溶液中。C固定Mh，组织切片计算突破内界膜的血管内皮细胞核的数量。每只眼睛观察20个视野(表1)。结果分析(表 2)表明与对照组(右眼)相比，试验组A和B的右眼的血管内皮细胞核的数量呈显著性减少(P < 0. 05)。因此Canstatin-N眼药水对于眼睛的血管增生有治疗作用。结果分析(表2)表明与负对照(AR、BR组)比较，试验组(AL、BL组)的血管内皮细胞核呈显著性减少(P < 0. 05)。结论=Canstatin-N蛋白对眼睛血管增生有治疗作用。表1.用Canstatin-N蛋白治疗眼睛血管增生结果血管内皮细胞核数量(个)
权利要求
1.一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质，其特征在于，具有以下基因序列ATG GTC AGC ATC GGC TAC CTC CTG GTG AAG CAC AGC CAG ACG GACCAG GAG CCC ATG TGC CCG GTG GGC ATG AAC AAA CTC TGG AGT GGA TACAGC CTG CTG TAC TTC GAG GGC CAG GAG AAG GCG CAC AAC CAG GACCTG GGG CTG GCG GGC TCC TGC CTG GCG CGG TTC AGC ACC ATG CCC TTCCTG TAC TGC AAC CCT GGT GAT GTC TGC TAC TAT GCC AGC CGG AAC GACAAG TCC TAC TGG CTC TCT ACC ACT GCG CCG CTG CCC CAT CAT CAT CATCATCATTAG。
2.根据权利要求1所述的用于治疗眼睛血管增生的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质由基因序列编码的氨基酸组成如下Met Val SerIle Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met Cys Pro Val GlyMet Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala HisAsn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met Pro Phe LeuTyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp LeuSer Thr Thr Ala Pro Leu Pro His His His His His His。
3.—种权利要求1所述的用于治疗眼睛血管增生的蛋白质的制备方法，其特征在于 是提取人脐带静脉基因组DNA作为模板，根据血管能抑素的N端1 89氨基酸基因片段的序列合成基因片段特异引物上游引物5’ CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT 3’ ；下游引物5， CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCA3，；用反转录PCR方法从人基因组中扩增血管能抑素的N端1 89氨基酸基因片段 canstatin-N,并在其序列的C末端加上his纯化标签；然后将这一基因片段重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表达Canstatin-Ν蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Canstatin-N蛋白。
4.根据权利要求1所述的用于治疗眼睛血管增生的蛋白质，其特征在于利用所述蛋白质制备治疗人眼睛血管增生的医药制品。
全文摘要
本发明涉及一种用于治疗眼睛血管增生的蛋白质，是以人脐带静脉基因组DNA作为模板，设计基因片段特异引物，用反转录PCR方法扩增血管能抑素的N端1～89氨基酸基因片段，并在其序列的C末端加上his纯化标签；然后再重组于Pichia pastoris基因组，在Pichia pastoris中表达Canstatin-N蛋白；再用离子交换方法和亲和层析方法纯化Canstatin-N蛋白，所得蛋白质具有序列表中1项下的序列。本发明以人脐带静脉基因组DNA为模板进行扩增得到的Canstatin-N蛋白，可有效地抑制人血管内皮细胞，有效地抑制和治疗眼睛视网膜血管增生，为生产特效的抑制眼睛血管增生的药物的研究和开发创造了必要的条件，具有重要的理论和实践意义。
文档编号C12R1/84GK102250914SQ20101021612
公开日2011年11月23日 申请日期2010年6月17日 优先权日2010年6月17日
发明者尹慧祥, 张添元, 张爱联, 罗进贤 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所