专利名称：一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。
背景技术：
目前动物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中兽药残留问题是影响动物 性食品安全的最主要因素之一，由于动物样本成分复杂，待测物浓度较低，而且大多数取 样量很少，这就对分析方法的选择性和灵敏度提出了更高的要求。化学发光免疫分析 (Chemiluminescence analysis,CL1A)技术将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反 应结合起来，具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备 等特点。CLIA不需要外来光源，具有比荧光免疫分析更高的信噪比，比常规的酶联免疫吸附 检测方法的抗背景干扰能力强，其灵敏度比ELISA高1至2个数量级，检测范围可达6个数 量级，自动化程度高，提高了分析方法的精密度，CLIA已经成为一种先进的痕量或超痕量物 质的检测技术。CLIA在兽医学、医学、食品分析等方面将会有更广阔的应用前景。己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种人工合成的雌激素，因其能促进蛋 白合成，加快增重和骨骼钙化，并减少饲料消耗，被作为动物促生长剂应用于畜禽生产和水 产养殖等方面。但许多科学试验证实了己烯雌酚是一种致癌物质，并具有以生殖毒性为主 的严重毒副作用对人和动物的健康危害较大，现在欧美、中国等许多国家已禁止将其用于 动物饲料中，但在畜牧生产上的常有非法应用的情况，导致其在畜禽产品中残留，危害公众 健康。目前，动物组织中己烯雌酚残留的检测方法主要采用气相色谱法、液相色谱法、气相 色谱_质谱法、液相色谱_联质谱法、酶联免疫法等。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂
品.ο本发明所提供的检测己烯雌酚的化学发光免疫试剂盒，包括己烯雌酚特异性抗 体、包被原和标准品溶液；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如 式I所示
权利要求
一种检测己烯雌酚的化学发光免疫试剂盒，包括己烯雌酚特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示FSA00000216119500011.tif
2.根据权利要求1所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括发光 液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体；所述试剂盒由己烯雌酚特异性抗体、包被原、标准品溶液、发光液、浓缩洗涤液、浓缩复 溶液、包被缓冲液、封闭液和酶标抗抗体组成。
3.根据权利要求1或2所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述己烯雌酚特异性抗体为己烯雌酚单克隆抗体或己烯雌酚多克隆抗体； 所述己烯雌酚单克隆抗体是由保藏号为CGMCC No. 3775的对己烯雌酚的单克隆杂交瘤 细胞株DES分泌的抗体。
4.根据权利要求1-3任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述标准品溶液 中标准品的浓度为ο μ g/L、0. 5 μ g/L、1 μ g/L、5 μ g/L、10 μ g/L或50 μ g/L，所述标准品为 己烯雌酚；所述发光液由C液和D液组成，发光液C液为过氧化氢；发光液D液为鲁米诺溶液； 所述浓缩洗涤液是将0. 05g叠氮钠防腐剂和IOOmL浓度为0. 02M、pH为7. 4的磷酸盐 缓冲液混合得到溶液；所述浓缩复溶液是将0. Ig牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 05mol/L、pH为7. 4的磷酸 盐缓冲液混合得到的溶液；所述包被缓冲液是PH值为9. 6的浓度为0. 03mol/L的碳酸盐缓冲液； 所述封闭液是将0. Olg叠氮化钠、IOg牛血清白蛋白和IOOmL浓度为0. 03mol/L、pH值 为7. 4磷酸盐溶液混合得到的溶液。
5.根据权利要求1-4任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述包被原是按照如下方法制备得到的a、将每18mg己烯雌酚半抗原、2. 5mL 二甲基 甲酰胺、15 μ L三正丁胺和9 μ L氯甲酸异丁酯混合反应30min，得到的产物溶液称为A液； 将每15mg载体蛋白溶于ImL 50%的二甲基甲酰胺水溶液(体积百分含量)中，调节pH至 9，得到的产物溶液称为B液；b、将A液加入到B液，4V反应4h后，再经过透析得到包被原； 所述己烯雌酚半抗原的结构式如式II所示
6.根据权利要求1-5任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述己烯雌酚半抗原是按照如下方法制备得到的I、先将每IlOmg己烯雌酚、200mg无水碳酸钠、50 μ L 4-溴丁酸乙酯和5mL丙酮混合得 到混合物，II、将步骤I得到的混合物进行60°C回流提取4h，抽干反应液，得到残留物，III、 再将步骤II得到的残留物溶解于5mL甲醇-氢氧化钾混合液后进行80°C回流提取lh，抽 干反应液，再次得到残留物，IV、向步骤III得到的残留物中加入SmL水得到混合液，调节 PH为3，离心收集沉淀；V、向步骤IV的沉淀加入5mL氯仿抽提，将有机相用硫酸钠干燥得到 残留物；VI、将步骤V得到的残留物溶于沸氯仿，再加入石油醚重结晶，干燥后得到的产物 即为己烯雌酚半抗原；所述甲醇-氢氧化钾液为将88mg氢氧化钾溶解于5mL甲醇得到的溶 液。
7.根据权利要求1-6任一所述的化学发光免疫试剂盒，其特征在于所述载体蛋白为鼠血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白，优选为卵清蛋白；所述酶标记抗抗体为酶标记羊抗鼠抗抗体。
8.一种检测己烯雌酚的方法，包括以下步骤1)样品前处理将每2g动物组织勻浆与IOmL乙腈-丙酮溶液混勻lmin，以3000g转速离心5min，取 上清液；将每2mL所述上清液用氮气干燥，再加入ImL复溶液溶解，再向其中加入ImL正己 烷混合，3000g离心5min，取下层溶液稀释5倍即为待测样本溶液；所述乙腈_丙酮溶液为 将乙腈和丙酮按体积比为80 20混合获得；所述动物组织为猪肉或鸡肉；所述复溶液为 将所述浓缩复溶液用0. 05mol/L、pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液稀释10倍得到的；2)利用权利要求1-7中任一所述的检测己烯雌酚的化学发光免疫试剂盒检测步骤1) 中的样本溶液。
9.由保藏号为CGMCCNo. 3775的对己烯雌酚的单克隆杂交瘤细胞株DES分泌的己烯雌 酚单克隆抗体。
10.保藏号为CGMCCNo. 3775的对己烯雌酚的单克隆杂交瘤细胞株DES。
全文摘要
本发明公开了一种检测己烯雌酚的方法及其专用化学发光免疫试剂盒。本发明所提供的检测己烯雌酚的化学发光免疫试剂盒，包括己烯雌酚特异性抗体、包被原和标准品溶液；所述包被原为己烯雌酚半抗原与载体蛋白的偶联物，其结构式如式I所示。本发明的检测方法，具有样品前处理过程简单、操作简便、费用低廉、特异性高、灵敏度高、精确度高等特点，能够现场监控且适合大量样本的筛查。
文档编号C12N5/20GK101936985SQ20101024428
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月3日 优先权日2010年8月3日
发明者史为民, 吴聪明, 张素霞, 曹兴元, 汤树生, 沈建忠, 王战辉, 程林丽 申请人:中国农业大学