专利名称：重型肝炎相关基因hTNFR1 microRNA腺病毒表达质粒的构建方法及其药学用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及构建一组基因生物制剂，即构建重型肝炎相关的人fgl2(Human Fibrinogen-like protein 2，hfgl2)凝血酶原酶、Fas 和肿瘤坏死因子受体 I (tumor necrosis factor, TNFR1)基因的microRNA腺病毒表达质粒，在重型肝炎中联合应用三种质粒进行 治疗，验证其药学用途。
背景技术：
由于病毒性肝炎发病率高、危害性大，已成为严重影响人民健康与生活水平、 制约经济发展的重要疾病。迄今为止，国际上对于重型肝炎尚无确定有效的治疗方法， 探索重型肝炎的发病机制和防治方法是应用基础和临床研究领域的重要课题。用鼠3型肝炎病毒(mouse hepatitis viras-3, MHV-3)感染不同种系近亲繁殖小 鼠，我们已成功建立了类似人类各种不同临床类型的肝炎，包括暴发型肝炎、慢性肝炎 及临床健康病毒携带者(专利申请号02115980.7) ； MHV-3诱导产生的鼠fgl2(mfgl2) 凝血酶原酶(纤维介素)基因在鼠病变肝组织中选择性高度表达，其基因表达水平与肝组 织纤维蛋白沉积及广泛肝细胞坏死密切相关；MHV-3感染小鼠接受鼠fgl2凝血酶原酶 中和抗体注射后可减轻肝脏疾病严重程度并显著降低死亡率。以上结果表明，鼠fgl2凝 血酶原酶在鼠暴发型肝炎的发病过程中起重要作用。在上述研究的基础上，我们进一步 研究发现重症乙型肝炎病人肝脏组织的枯否氏细胞、血管内皮细胞和坏死、纤维化区域 发现人fgl2(hfgl2)凝血酶原酶高度表达，fgl2在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和 微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏死，表明人fgl2凝血酶原酶在人病毒性肝炎的恶化 进展中起着关键性的作用。重型肝炎的肝细胞死亡包括细胞坏死和细胞凋亡。迅速发生的凋亡是引发暴发 性肝炎的重要机制之一。Fas基因广泛表达于人体组织中，属于肿瘤坏死因子受体超家族 (TNFRSF)，并被命名为CD95。Fas/FasL通过介导细胞凋亡，在感染性疾病、自身免疫 性疾病和肿瘤的发生中起重要的作用，是病毒性肝炎、酒精性肝病、自身免疫性肝病、 急慢性肝衰竭和移植性排斥反应等造成肝组织细胞炎症损伤的重要环节。肝细胞对Fas介 导的凋亡非常敏感。文献报导，病毒抗原激活肝细胞表达Fas，局部大量浸润的CTL表 达FasL，引起肝细胞凋亡，肝细胞Fas/FasL表达程度与病变活动性一致，Fas介导的肝 细胞凋亡在肝损伤中起非常重要的作用。肿瘤坏死因子(TNF)包括TNFa和TNF 3，其中TNF a主要是由活化的单核
/巨噬细胞分泌，是具有广泛的生物学活性的多肽调节因子，在内毒素性休克、炎症、免疫调节、细胞毒性和抗病毒活动中起着重要作用。TNFci诱导的各种细胞反应是通过细 胞表面两种特异性受体而产生的，即55KD的肿瘤坏死因子受体I (TNFRI)和75KD的肿 瘤坏死因子受体II (TNFR II)。TNF a的许多生物学效应包括细胞凋亡都是通过TNFR I 产生的，而TNFR II则起着辅助信号转导的作用。TNFR I的高表达所致的肝细胞凋亡在 人类重型肝炎的发生发展中起着重要作用。临床上多种病因可致重型肝炎，其发病凶险，患者短期内可出现大面积肝细胞 死亡，目前缺乏特异有效的治疗手段。研究表明Fas、TNFRI系统介导的肝细胞凋亡与 重型肝炎的肝损伤有关，抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞大量激活并高度集中于患者肝 脏，通过Fas/FasL或TNFa/TNFRI诱导细胞凋亡，进而杀伤肝细胞。hfgl2凝血酶原 酶在病毒性肝炎中引发肝脏纤维蛋白沉积和微血管内微循环障碍，导致肝细胞坏死。上 述研究表明人fgl2凝血酶原酶、Fas/FasL和TNF a /TNFR I系统在人重型肝炎的恶化进 展中起着关键性的作用。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指导入特异性针对目标基因的同源双链 RNA(double-strain RNA, dsRNA)，诱导产生的沉默复合体(RISC)将目标mRNA降解，
从而引起目标基因不表达或减效表达。MicroRNA是由机体内源基因转录的约70nt的发 夹状结构前体(pre-microRNA)被Dicer酶切割后产生的约22nt的非编码单链核苷酸片 段，可与目的基因mRNA的非翻译区结合，抑制mRNA的翻译而不影响其稳定性，也可 以RISC样降解与之完全互补的靶RNA。microRNA作为一种新的基因干预工具，具有高 效、特异、快速等优点，为基因调控的研究和基因治疗的发展带来了新的视角。国际上 大量研究表明其基因表达干预效果优于反义技术，更具临床应用价值。应用腺病毒载体 有如下优点1.宿主范围广，对人致病性低；2.可在增殖和非增殖细胞中感染和表达基 因；3.不整合到染色体中，无插入致突变性；4.与人类基因同源；5.能有效进行增殖， 滴度高；6.能同时表达多个基因。发明人构建了 hfgl2、hFas和hTNFRl基因的miRNA 表达质粒，并对其进行了体外细胞水平的实验，结果证明了 hfgl2、hFas和hTNFRl基因 的miRNA表达质粒对相应基因有特异性地抑制作用，表明它们对病毒诱导的重型肝炎的 治疗具有潜在的临床应用价值。
发明内容
本发明基于重型肝炎暂无确定有效的治疗方法，发明了一种用于治疗多种病 因诱导的重型肝炎的基因药物。发明人构建了一组新的生物制剂_hfgl2凝血酶原酶、 hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒，用以抑制重型肝炎相关的hfgl2凝血酶原酶、hFas 和hTNFRl的表达，阻止肝细胞死亡和异常凋亡，可望在临床上提高重型肝炎患者的存 活率和生存质量。所以，本发明的第一个目的是提供构建hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA表达质粒的方法；本发明的第二个目的是应用hfgl2凝血酶原酶、hFas 和hTNFRl的miRNA表达质粒特异性地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因 的表达，并验证其药学用途。我们通过细胞水平实验，证实hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA pcDNA表达质粒特异性地抑制细胞系中相应目的基因的表达。为了实现本发明的目的，发明人设计重型肝炎相关基因hfgl2、hFas和hTNFRl 的microRNA腺病毒表达质粒的构建方法，在于采用pAd/CMV/V5-DEST载体和 hfgl2、hFas、hTNFRl 的 pcDNA 表达质粒通过 Gateway 技术，构建 pAd_hfgl2、 pAd-hFas、pAd-hTNFRl。本发明所述的pcDNA表达质粒的构建是将产生hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA的双链寡核苷酸分别插入microRNA的表达载体pcDNATM6.2_GW/ EmGFP-miR 中。本发明所述的寡核甘酸如下产生hfgl2凝血酶原酶miRNA的单链寡核苷酸序列为5' -TGCTGTTCTTTGAACACCTCCTCGATGTTTTGGCCACTGACTGACATCG AGGATGTTCAAAGAA-3 ‘产生hFas的miRNA的单链寡核苷酸序列为5' -TGCTGTTAAGTTGGAGATTCATGAGAGTTTTGGCCACTGACTGACTCTC ATGACTCCAACCTTA-3 ‘产生hTNFRl的miRNA的单链寡核苷酸序列为5' -TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTGACTGACTGTG GGAACGACACCTGAA-3 ‘。本发明所述的pcDNA表达质粒，它们保藏的培养物名称为大肠杆菌ToplO/ phfgl2-miRNA/ 大肠杆菌 Top 10/phTNFRl-miRNA/ 大肠杆菌 ToplO/phFas-miRNA，已 保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号分别为CCTCCNO: 207188/CCTCC NO M207189/CCTCCNO M207187,保藏日期为 2007 年 11 月 30 日。下面发明人进一步展现本发明表达质粒构建的具体步骤是一、pcDNA表达质粒的构建构建表达hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA pcDNA表达质粒。1.利用Invitrogen公司miRNA设计软件获得针对hfg 12凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl基因的miRNA模板，合成miRNA模板单链。2.将退火的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA模板双链插入 miRNA 的表达载体 pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR。3.测序筛选未发生突变的hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因的miRNA表
达质粒。二、miRNA pcDNA表达质粒的细胞水平试验分别检测hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒特异性地抑 制细胞系中hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因表达的效果。采用red-time PCR 和western-blot方法，从基因水平和蛋白水平验证hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的 microRNA表达质粒分别特异有效地抑制hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl基因在293T
细胞中的表达。三、miRNA腺病毒表达质粒的构建利用 Gateway 技术，分别将 hfgl2、hFas 和 hTNFRl 的 miRNA pcDNA 表达质粒 和 pAd/CMV/V5-DEST 载体重组成 pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl 腺病毒表达质 粒。测序筛选未发生突变的pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl腺病毒表达质粒。
图1是本发明实时荧光定量PCR检测hFas-miRNA的干扰效果中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；2.阳性对照组(仅转染pcDNA3.0-Fas)；3.非相关对照组(pcDNA3.0-Fas+irrelevantmiRNA)；4.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNAl)；5.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA2)；6.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA3)。图2是本发明western-blot检测hFas-miRNA的干扰效果中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；2.阳性对照组(仅转染pcDNA3.0-Fas)；3.非相关对照组(pcDNA3.0-Fas+irrelevantmiRNA)；4.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNAl)；5.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA2)；6.实验组(pcDNA3.0-Fas+hFas_miRNA3)。图3是本发明实时荧光定量PCR检测hfgl2_miRNA的干扰效果中，1 pcDNA3.1_hfgl2 ；2 phfg 12-miRNA 1+PcDNA3.1 -hfg 12 ；3 phfg 12-miRNA2+PcDNA3.1 -hfg 12 ；4 phfg 12-miRNA3+PcDNA3.1 -hfg 12 ；5 irrelevant miRNA+PcDNA3.1 -hfg 12 ；6 blank control。图4是本发明western-blot检测hfgl2_miRNA的干扰效果中，M: Marker, B Blank ；1 phfg 12-miRNA 1 +pcDNA3.1 -hfg 12 ；2 phfg 12-miRNA2+pcDNA3.1 -hfg 12 ；3 phfg 12-miRNA3+pcDNA3.1 -hfg 12 ；4 irrelevant miRNA+pcDNA3.1 -hfg 12 ；5 pcDNA3.1_hfgl2。图5是本发明实时荧光定量PCR检测hTNFRl-miRNA的干扰效果中，1.空白对照组(未转染任何质粒的293T细胞)；2.阳性对照组(仅转染 pcDNA3.1_TNFRl)；3.非相关对照组(pcDNA3.1-TNFRl+irrelevantmiRNA)；4.实验组(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNAl)；5.实验组(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNA2)；6.实验组(pcDNA3.0-Fas+hTNFRl_miRNA3)。
具体实施例方式以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的详细描述。
本发明构建了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达质粒，并在细 胞水平证实其干扰效应，包括以下步骤(以构建hFas-microRNA表达质粒为例)一、pcDNA表达载体的构建构建hFas-miRNA 表达质粒根据 PubMed 上 hFas cDNA 序列，利用 Invitrogen 公司miRNA设计软件设计、合成3对互补寡核苷酸单链。按照分子克隆操作过程，将ds Oligo 插入 microRNA 的表达载体 pcDNATM6.2-GW/EmGFP_miR，构建 3 个 hFas-miRNA 质粒p-hFasmi-RNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3。测序筛选未发生突变的 hFas
基因的miRNA表达质粒。二、miRNA pcDNA表达质粒的细胞水平试验研究microRNA表达体系在导入人体后是否能特异性结合到靶基因并有效表达，目前 国际上尚无能够提供直接证据的相关实验方法，只能通过体外干预试验来间接反映上述 生物制剂的干预效果。发明人构建了 hfgl2凝血酶原酶、hFas和hTNFRl的miRNA表达 质粒，并对其进行细胞水平的实验，过程如下(以hFas-miRNA表达质粒体外抑制Fas基 因在293T细胞中的表达为例)材料miRNA 表达质粒p-hFasmiRNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3，能够表 达hFas-miRNA，用于抑制hFas基因的表达。非相关对照质粒。pCDNA3.0-hFas hFas的真核基因表达载体，可通过转染导入Fas基因使其在细 胞系中外源性表达。293T细胞人胚肾细胞。方法使用lipofectamine2000 将 p-hFasmiRNAl、p_hFasmiRNA2 和 p_hFasmiRNA3 分 别与pcDNA3.0-hFaS共转染293T细胞，作为试验组；不转染任何质粒作为空白对照组； 另仅转染pcDNA3.0-hFas作为阳性对照组；共转染非相关对照和pcDNA3.0_hFas作为非 相关对照组。转染后48h提取细胞RNA，real-time PCR检测Fas基因mRNA的表达情 况。裂解细胞提取蛋白，western-blot检测Fas蛋白的表达情况。结果rea卜time PCR 禾口 western-blot 检测到 293T 细胞内 p-hFasmiRNAl、 p-hFasmiRNA2和p_hFasmiRNA3在基因水平(附图1)和蛋白水平对hFas的表达均具有 特异性抑制作用(附图2)。系列体外试验均表明本发明涉及的新的生物制剂hfgl2凝血酶原酶、hFas和 hTNFRl的miRNA表达质粒在细胞水平可有效地干预相应目的基因的表达(附图3、4、 5)。在转染 293T 细胞系 48 小时后，p_hfgl2miRNA 对 hfgl2、p-hFasmiRNA 对 hFas、 p-hTNFRI miRNA对hTNFRl在RNA水平上的抑制效率分别达到89.3 %、87.5 %和80 %。
联合使用miRNA表达质粒也显示了相似的很好的干预效果。本项发明对于重型肝炎的治 疗，尤其是在提高重型肝炎患者的存活率、延长移植物存活时间等方面具有深远而重大 的药学意义。三、miRNA腺病毒表达质粒的构建
利用 Gateway 技术，分别将 hfgl2、hFas 和 hTNFRl 的 miRNA pcDNA 表达质粒 和 pAd/CMV/V5-DEST 载体重组成 pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl 腺病毒表达质 粒。测序筛选未发生突变的pAd_hfgl2、pAd-hFas、pAd-hTNFRl腺病毒表达质粒。
权利要求
1.重型肝炎相关基因hTNFRlmicroRNA腺病毒表达质粒的构建方法，采用pAd/ CMV/V5-DEST载体和hTNFRl的pcDNA表达质粒通过Gateway技术，构建重组腺病毒 载体pAd-hTNFRl，pcDNA表达质粒的构建是将产生hTNFRl的miRNA的双链寡核苷酸 插入microRNA的表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP_miR中，其特征在于所述的寡核甘酸如下，产生hTNFRl的miRNA的单链寡核苷酸序列为 5 ‘ -TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTG ACTGACTGTGGGAACGACACCTGAA-3 ‘。
2.按权利要求1所述的重型肝炎相关基因hTNFRlmicroRNA腺病毒表达质粒的 构建方法，其特征是pcDNA表达质粒，其保藏的培养物名称为大肠杆菌ToplO/ phTNFRl-miRNA/，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO M207189。
全文摘要
重型肝炎相关基因hTNFR1microRNA腺病毒表达质粒的构建方法及其药学用途，本发明涉及构建了一组基因生物制剂，即构建了重型肝炎相关的hTNFR1基因的microRNA腺病毒表达质粒，其产生hTNFR1iRNA的单链寡核苷酸序列为5′-TGCTGTTCAGGTGTCGATTTCCCACAGTTTTGGCCACTGACTGACTGTGGGAACGACACCTGAA-3′。在细胞水平检测microRNA干扰质粒的有效性和特异性，建立hTNFR1 microRNA腺病毒表达质粒应用于治疗重型肝炎。
文档编号C12N15/63GK102010879SQ20101028588
公开日2011年4月13日 申请日期2008年7月18日 优先权日2008年7月18日
发明者严伟明, 习东, 宁琴, 朱传龙, 王鸣, 罗小平, 郭健文, 高随 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院