专利名称：一种高效转化棘白菌素b的基因工程菌及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。
背景技术：
在过去的二十多年里，严重危害人类生命健康的真菌感染，无论是其发生频率还是感染种类都在不断地增加，特别是在免疫抑制患者中。在20世纪80年代中期前的近30 年里，两性霉素一直是控制临床真菌感染的主要药物，尽管其神经毒性比较大，但临床别无选择。直到20世纪80年代末和90年代咪唑类及三唑类抗真菌药物的研发成功，临床方能有效而安全地控制真菌感染。但是，随着这些抗真菌药物的使用，耐药菌不断出现，因此，寻找一种新的安全有效的抗真菌药物就显得尤为重要。棘白菌素类药物是20世纪70年代发现的一组天然产物，是真菌的次级代谢产物， 包含一个带有一条脂类侧链的环状六肽核，该脂类侧链通过非竞争性作用机制抑制β _(1， 3)-D-葡聚糖的合成，从而导致细胞壁葡聚糖的排空、渗透不稳定以及真菌细胞的溶解而发挥其抗真菌作用。棘白菌素作为一种可杀死真菌的药物表现出抗菌谱广、活性强的特点，是治疗免疫抑制患者和免疫正常患者真菌感染的重要选择药物。但是天然的棘白菌素类化合物由于酰基侧链的存在，使其具有一定的溶血毒性。将棘白菌素B切除侧链之后，经过一系列的化学修饰可以得到一系列具有临床应用前景的衍生物。其中最主要的是如西洛芬净 (Cilofungin)、卡帕芬净(Caspofungin, MK991)、米卡芬净(Micafungin, FK463)、阿尼芬净 (Anidulafungin,LY303366)o西洛芬净由于其毒性和剂型(不溶于水)问题以及对卡氏肺囊虫肺炎(PCP)的活性较低，目前已经终止了研究开发，但后三者已先后在01年、02年、06 年上市。其中阿尼芬净是由礼来公司和Vicuron !Pharmaceuticals公司联合研制开发，给药途径为静脉滴注。动物实验研究表明，同卡泊芬净和米卡芬净相比，阿尼芬净对烟曲霉菌活性更强，对白色念珠菌活性相对较弱。在一项对食管念珠菌感染患者进行的双盲对照试验中，静脉滴注阿尼芬净的有效率为97.2%，氟康唑的有效率为98.8%，阿尼芬净的不良反应发生率为10%，对照组为13%。阿尼芬净的制备过程经过两步(1)通过微生物转化-游动放线菌发酵产生的去酰化酶对棘白菌素B进行催化，使侧链断裂，生成母核和不饱和脂肪酸侧链。( 在母核的基础上加入新的侧链——戊氧-三苯羧基。但是游动放线菌生长周期长，发酵条件较为苛刻，并且游动放线菌野生菌株去酰化酶产量不高，因此目前通过游动放线菌转化棘白菌素B的效率低，生产成本较高。
权利要求
1.一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌，其特征在于，其是在变铅青链霉菌 Streptomyces Iividans野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。
2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒依次含有启动子、棘白菌素B去酰化酶编码区和终止子。
3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的表达盒在变铅青链霉菌 Streptomyces Iividans野生菌株的基因组中的整合位点是attB位点。
4.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述的变铅青链霉菌Sti^ptomyces Iividans S 生菌株是变铅青链霉菌 Sti^ptomyces lividansTKM。
5.一种重组载体，其特征在于，其在多克隆位点插入有棘白菌素B去酰化酶基因的的表达盒。
6.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体的骨架是PSET152。
7.一种转化子，其特征在于，其含有权利要求5或6所述的重组载体。
8.一种制备如权利要求1 4任一项所述的高效转化棘白菌素B的基因工程菌的方法，其特征在于，包括将权利要求7所述的转化子与变铅青链霉菌Sti^ptomyces Iividans 接合，挑选接合子即得。
9.一种制备棘白菌素B母核的方法，其特征在于，包括采用如权利要求1 4任一项所述的基因工程菌，以静息细胞转化法转化棘白菌素B为棘白菌素B母核。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的静息细胞转化法包括将如权利要求1 4任一项所述的基因工程菌置于缓冲溶液中，以棘白菌素B为前体物质进行转化反应，从所得转化反应液中即可分离获得ECB母核。
全文摘要
本发明公开了一种高效转化棘白菌素B的基因工程菌及其制备方法。该基因工程菌是在变铅青链霉菌Streptomyces lividans野生菌株的基因组中整合有棘白菌素B去酰化酶基因的表达盒的工程菌。通过棘白菌素B转化验证，该基因工程菌的转化效率较犹他游动放线菌Actinoplanes utahensis野生菌株提高1.5倍。
文档编号C12N15/63GK102443561SQ201010505210
公开日2012年5月9日 申请日期2010年10月13日 优先权日2010年10月13日
发明者刘爱娟, 周雨朦, 李继安, 邵雷, 陈代杰 申请人:上海医药工业研究院