专利名称：一种控制水稻株型，器官大小，根系及结实率性状的xiao基因的克隆与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物生物技术和基因工程技术领域。具体涉及一个位于水稻第四染色体长臂上参与油菜素内酯信号传导途径，控制水稻株型、器官大小、根系和结实率多效性基因XIAO的克隆及应用。
背景技术：
多种因素会影响水稻的产量。其中分蘖、每穗颖花数、谷粒的大小、株型、结实率以及根系的发达程度都会对产量造成极大的影响。随着水稻功能基因组平台的建立和发展， 分离克隆这些水稻重要农艺性状基因的速度明显加快。利用T-DNA插入突变体克隆基因显得尤为突出。株高是影响产量的一个重要因子。矮化水稻，可提高水稻的耐肥性，从而大幅提高产量。上世纪60年代在亚洲大面积推广的矮化品种，大幅提高了产量，并称为水稻的“第一次绿色革命”。2002年，水稻绿色革命基因SDl被克隆，发现它是一个赤霉素合成途径的基因(Sasaki et al.，2002)。陈了赤霉素，油菜素内酯、生长素、细胞分裂素都发现参与株高的控制。产量的构成因子还有每穗颖花数(穗大小)，粒重(粒大小)。综合来看，株高、穗大小、粒大小都是植物器官变化的单个表现形式，本质上是细胞分裂，分化的结果。另外，株型、叶倾角其实是由叶枕细胞分裂，伸长所致。因此，从细胞分裂入手，直接寻找控制细胞分裂的基因，是一种快速，高效克隆产量基因的方法。细胞如何分裂是最基本的生物学问题之一。过去对细胞分裂，细胞周期的研究成果大部分是基于单细胞的水平。研究植物器官大小，不仅能在植物整体发育水平上研究细胞分裂问题，更能够提高产量。植物器官大小是由组成器官的细胞数目和细胞大小决定的(Li et al. ,2008； Mizukami and Fischer, 2000 ；Szecsi et al.，2006)，并且，从目前克隆的基因来看，细胞数目的变化是器官变化的主要细胞学基础。从发育的角度来看，器官原基的大小，细胞分裂持续的时间以及分裂的速度三者决定了最终器官的大小(Anastasiou et al.，2007 ；Barroco et al.，2006)。细胞数目的变化是由细胞周期决定的。AINTEGUMENATA(ANT)调控拟南芥器官大小的发育生物学基础是使细胞持续分裂的时间延长，它的分子机制则是ANT使细胞周期蛋白CycD3的表达时间延长，在9星期发育成熟的老叶中，超表达的植株叶片中CycD3的表达量显著高于对照，而在细胞分裂旺盛的花芽中CycD3的表达差异不显著(Mizukami and Fischer, 2000) 0因此，通过调控细胞周期基因就有可能达到控制植物器官大小的目的。依赖细胞周期蛋白的激酶抑制因子(CDKI)通过与细胞周期蛋白(cyclin)和依赖细胞周期蛋白激酶(CDK)复合体结合，达到抑制CDK的活性，从而抑制细胞周期的进行。Barroco发现在超表达CDKI的水稻的第6片叶比对照要短14%，叶片变小的机制是CDKI降低了的细胞分裂速率(Barroco et al. 2006)。植物激素在植物的形态建成中发挥了重要的作用。其中一种机制就是植物激素通过调控细胞周期相关基因的表达来实现的(del Pozo et al.，2005)。受生长素响应的 ARGOS是一个控制拟南芥器官大小的基因，它通过延长它的下游基因ANT和CycD3的表达时间，使得细胞持续分裂的时间延长，最终决定了器官的大小(Hu et al.，2006)。并且，ARGOS 在水稻中的同源基因OsARGOS也能使拟南芥器官变大，OSARGOS同时受生长素和细胞分裂素诱导。生长素控制器官大小的另一个例子就是生长素响应因子(AUXINRESPONSE FACTOR 2，ARF2)。在arf2突变体中，ARGOS, ANT和CycD3的表达时间都延长了，最终导致arf2的种子变大(Schruffet al. ,2006) 本发明从细胞分裂的角度，克隆参与水稻株型、产量相关基因，并挖掘植物激素在其中发挥的重要作用，为水稻理想株型的分子设计育种挖掘基因资源。
发明内容
针对上述研究背景，本发明的目的在于分离克隆水稻产量相关基因ΧΙΑ0(大写斜体表示，下同)，并为利用植物激素应答而调节水稻产量提供一种新的途径。XIAO基因具有如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列，也包括与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。本发明也包括SEQ ID NO :2所示的XIAO(大写正体表示，下同)蛋白的氨基酸序列，及与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有90%同源性以上的氨基酸序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个氨基酸而产生的功能类似物。本发明克隆的水稻XIAO基因的T-DNA插入失活突变体xiao (小写斜体表示，下同)在形态上总体表现出器官变小、株型直立，根系卷曲及结实率下降(见实施例2，图1， 图5)，并且突变表型也与在XIAO基因内的T-DNA插入共分离(见实施例1)。正常功能的 XIAO基因转化该突变体后植株恢复为野生型的表型(见实施例1，表1)。实现本发明的具体技术步骤如下1.筛选华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室创建的水稻T-DNA插入突变体库(Wu et al.，2003)，筛选得到一个产量相关的突变体材料05Z11EJ51，我们将其命名为 xiao，突变体的筛选鉴定方法见实施例1第1部分中详细描述。2.本发明比较了野生型(WT，下同)和突变体xiao对外援施加植物激素油菜素内酯(BR，下同)的反应，结果表明产生突变体的表型的原因是由于突变体对BR超敏感(见实施例3)。3.通过对突变体xiao的T-DNA插入与突变性状的共分离验证及功能互补实验 (见实施例1)，成功克隆产量相关基因XIAO。详细的技术发明细节在《具体实施方式
》中列出。本发明的优点是1.本发明克隆了一个同时控制多种产量构成因子的基因。2.本发明发现调控植物激素如油菜素内酯能够调节水稻产量。
序列表SEQ ID NO 1 是本发明分离克隆来源于水稻品种“日本晴”的XIAO基因的核苷酸序列，序列全长6474bp，包括编码区(3001-6474bp)。
序列表SEQ ID NO :2是本发明分离克隆的来源日本晴的XIAO蛋白的氨基酸序列。图1 野生型和突变体xiao的表型比较。图IA 成熟期水稻野生型植株与不育植株形态比较左为野生型WT，右为突变体
xiaoo图IB 成熟期水稻野生型植株与不育植株株高比较左为野生型WT，右为突变体
xiaoo图IC 成熟期水稻野生型植株与不育植株花药比较左为野生型WT，右为突变体
xiaoo图ID 成熟期水稻野生型植株与不育植株种子比较左为野生型WT，右为突变体
xiaoo图IE 成熟期水稻野生型植株与不育植株剑叶叶倾角比较左为野生型WT，右为突变体xiao。图2. XIAO基因型鉴定。图2A :ΧΙΑ0基因的结构和T-DNA插入位点分析。起始密码(ATG)和终止密码(TGA) 已经标出，实心黑方框表示XIAO基因的唯一一个外显子，空心黑方框表示UTR ；三角形表示 xiao T-DNA插入的位置。Pl，P2，表示跨T-DNA的两条基因组引物，P3表示位于xiao突变体中T-DNA上的边界引物。图2B 是一个xiao T-DNA插入杂合植株后代的基因型检测。植株基因型的确定当 Pl和P3配对时才可以扩增出目标产物，由于T-DNA插入片段太大，Pl与P2配对扩增的产物无法得到；野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以Pl和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物Pl与P2配对扩增得到目标产物；而XIAO杂合T-DNA插入转基因植株则Pl和P2 配对以及Pl和P3配对时都可以扩增得到产物。植株表型20个Tl代单株中第4、7、8、10、 16和18株为突变表型(以M表示)。由图可知突变体的基因型均为纯合T-DNA插入，而正常植株的基因型为野生(以W表示)或杂合型(以H表示)，这一结果表明表型与XIAO基因内的T-DNA插入共分离。图3. XIAO基因功能互补实验。图3A 互补载体PC2301-XIA0结构示意图，该载体的构建说明见实施例1中的第 3部分，即将含有基因XIAO的完整的编码区和其启动子区域用EcoR I和)(bal I从BAC克隆(0SJNBa0020J04)酶切后克隆到载体pCAMBIA2301 (由澳大利亚CAMBIA实验室赠送，http://www. cambia. org/daisy/cambia/materials/overview, html)上形成的新质粒。以pCAMBIA2301空载体转化植株作为阴性对照。图;3B =XIAO基因功能互补实验所用的载体pCAMBIA2301结构示意图。图4 野生型和突变体花药纵切比较细胞数目。图4A、图4C表示野生型成熟花药花药纵切片。图4B、图4D表示突变体成熟花药花药纵切片。英文字母分别表示花药的结构。E 表皮细胞，P 花粉粒。Bars = 50 μ m图5.用表油菜素内酯(BL)处理野生型和突变体的结果。图5A 在对照(不添加BL)培养基中生长的根，左为野生型WT，右为突变体xiao。图5B 在处理(添加0.01 μ M BL)培养基中生长的根，左为野生型WT，右为突变体
5xiaOo图5C:将WT和xiao种子在培养基(依次添加0，0·01，0· 1，1μΜ BL)中黑暗发芽，
测量胚芽鞘长度，作图。图6.构建本室突变体库所用到的载体pFX-EM. 2-15R图7.用Realtime PCR方法检测野生型和突变体中细胞周期基因的表达量
具体实施例方式实施例1 :ΧΙΑ0基因的分离克隆1. xiao突变体的获得所用的水稻T-DNA插入突变体库由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室利用载体PFX-EM.2-15R构建而成(Wu et al.，200 。突变体的筛选鉴定方法是从上述水稻T-DNA插入突变体库(RMD ;http://rmd. ncpgr. cn/)中将Ttl代转基因水稻种子(转化受体是中花11号，为中国农业科学院培育的常用水稻品种)，经浸种、催芽后播于秧田，20 天后移栽至大田。种植密度为5寸X8寸，种植地点为中国湖北省武汉市洪山区华中农业大学的试验田，按常规的水稻种植方法进行田间管理。经过大田筛选得到一个器官变小，不育，株型直立的家系(图1)。原始编号为05Z11EJ51。申请人将这个突变体命名为xiao。 该突变体已经收集到水稻突变体库中(RMD :http://rmd. ncpgr. cn/),该突变体库的所有资源均可被研究人员索取(Zhang et al.，2006)。2. T-DNA插入侧翼序列与突变表型的共分离检测为了证实xiao的突变表型是由于XIAO基因内的T-DNA插入引起，本发明对20个 T1代转基因植株(其中，第4、7、8、10、16和18株为突变单株)进行了 T-DNA插入位点侧翼序列与突变表型的共分离检测。共分离检测的具体步骤为(1)在XIAO基因T-DNA插入位点两侧设计一对基因组引物Pl(5 ‘ -TTGACGGTGCTCGACCTTTC-3‘)和 P2 (5‘ -TACGCACTGCATTCGTTCTC-3‘)，在 T-DNA上设计一条载体引物P3 (5’ -ATCCAGATCCCCCGAATTA-3’)，如图2A。在T1代植株中， XIAO纯合T-DNA插入植株只有当Pl和P3配对时才可以扩增出目标产物；而由于T-DNA插入使Pl与P2配对扩增的产物> 101Λ，在申请人设定的PCR反应程序无法得到相应PCR产物(这样鉴定植株基因型的方法是领域内的通用方法)。野生型植株由于没有T-DNA的插入，所以Pl和P3配对扩增没有产物，但可以利用引物Pl与P2配对扩增得到目标产物。而 XIAO杂合T-DNA插入转基因植株则Pl和P2配对以及Pl和P3配对时都可以扩增得到产物。(2)应用CTAB法(Liu et al.，1997)。从20株T1代单株中分别抽提总DNA作为模板， 用(1)中引物组合P1+P3和P1+P2进行PCR扩增。反应体系为20 μ L，具体包含DNA模板 IyL5IO 倍体积的 Taq 酶反应缓冲液 1. 5 μ 1 ； 2mM dNTPO. 9 μ L ； 25mM 镁离子 1. 2 μ L ;10 μ M 引物各0. 2yL;l个单位Taq酶，加双蒸水至15yL。反应参数设置如下94°C 4min -MV 30sec，58°C 30sec，72°C 1. 5min,35 cycles ；72°C 5min，25°C lmin。(3)将反应产物经琼脂糖凝胶电泳，根据凝胶上的带型判定各个单株的基因型。实验结果显示，20株T1代单株中，6株突变体表型植株的基因型均为XIAO纯合T-DNA插入，而其他14株表型正常的植株基因型为野生或杂合型(如图2B)。这表明xiao突变体的突变表型是由于XIAO基因内的 T-DNA插入造成，且该突变体表现为隐性纯和突变体。
3.互补载体的构建互补载体pC2301-XIA0的构建方法如下以pCAMBIA2301载体为骨架载体，用EcoR I和)(bal I酶切水稻“日本晴“BAC克隆0SJNBa0020J04，得到一系列将酶切片段，其中包括目的片段含整个XIAO基因编码区及ATG前约3. Ikb和终止密码后约3. 6kb (图3A)。将酶切片段与用EcoR I和)(bal I双酶切的载体质粒PCAMBIA2301连接(图;3B)(所使用的内切酶、碱性磷酸酶均购自Takara公司，连接酶购自!Iomega公司，具体用法与用量参考该产品的说明书)。连接产物通过电转化的方法(电转化仪为印pendorf公司产品，本发明所用电压为1800V，具体操作参考该仪器的使用说明书)导入大肠杆菌DHlOB (购自!Iomega公司) 中，加800ul LB复苏30分钟，取80ul涂于含卡那霉素、5-溴-4-氯-3- 口引哚- β -D-半乳糖(Χ-β-gal)及异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LA平板，37°C温箱培养14-16小时(LA与LB配方参考萨姆布鲁克，《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社，2002年)。 挑白色单克隆，扩大培养并抽提质粒，酶切验证及测序验证后得到目的克隆。把构建好的载体电转入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (由澳大利亚CAMBIA实验室赠送) 中。转化后的菌株命名为EHA105-p2301-XIA0。4.遗传转化采用农杆菌介导的遗传转化方法将菌株EHA105-pC2301-XIA0导入xiao突变体的愈伤组织，经过预培养、侵染、共培养、筛选具有G418 (用于筛选阳性的转基因愈伤的一种抗生素，购自北京原平皓生物技术有限公司)抗性的愈伤组织、分化、生根及炼苗移栽大田得到转基因植株(农杆菌介导的遗传转化试剂及配方主要应用Hiei等人报道的方法基础上进行优化(Hiei et al. ,1994 ；Lin and Zhang, 2005) 参见申请人先前的专利文献，专利号ZL 200710053552. 9，发明的名称水稻广亲和基因S5的分离克隆及应用专利申请日2007年10月15日；专利
公开日2008年6月18日；
发明者张启发, 江云鹤 申请人:华中农业大学