专利名称：一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针的制作方法
技术领域：
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体涉及一种检测多种呼吸道病毒的 方法及其引物与探针，尤其涉及利用针对呼吸道病毒的特异性核酸探针用液相芯片方式结 合多重聚合酶链反应(PCR)技术，用于快速检测多种呼吸道病毒的方法。
背景技术：
呼吸道疾病是世界范围内常见的重要致死疾病之一，引发急性呼吸道感染的病原 微生物种类很多，其中病毒占了 90%以上，且其引起的临床表现症状都类似如发热、头痛、 四肢酸痛、打喷嚏、流鼻涕、鼻塞、咳嗽、咽痛等。常见的呼吸道病毒包括腺病毒(AdV)、人偏 肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒 (BOV)、鼻病毒(RV)、HKUl 病毒(HKUl)、NL63 病毒(NL63)、SARS 病毒(SARS)、副流感病毒 I 型(PIVl)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)寸。在对上述病毒检测方面，目前常规应用的检测手段如分离培养方法、免疫学方法 以及核酸检测方法如PCR、多重PCR、RT-PCR方法和基于Taqman探针技术的实时荧光PCR 方法等。但这些方法或多或少存在一些缺陷如分离培养方法在技术上比较困难，且获得病 原学诊断和药敏结果常需要3 5天以上，在临床上难以及早进行病原学诊断和耐药性测 定，无法满足临床救治危重感染者的需要；而用免疫学方法检测病毒的特异性抗体时，不仅 需分别在患者感染的急性期及恢复期采集双份血清，并且还可能存在抗原抗体间的交叉反 应而干扰检测，不利于疾病的早期诊断；在核酸检测方法方面，PCR、多重PCR、RT-PCR方法 及基于Taqman探针技术的实时荧光PCR方法等的灵敏度高，特异性好，适合于快速检测鉴 定，但这些方法大多基于单一反应或少数重数的多重反应的检测，在对临床样本进行检测 时，对每一个样本的数十种指标进行检测和排除时，需要耗费大量的劳动和成本。对于分子实验室中大量样本的常规检测，研究者正致力于开发和建设以多重快速 检测为目标的检测平台，典型的高通量多重分析技术包括生物芯片、毛细电泳和质谱等，由 于其能在同一反应容器中同时检测多个核酸序列，因此在节约时间、劳动和成本方面更具 有优势，是高通量、特异、可靠、快速和经济的核酸检测方法。基于微球的液相芯片技术，提供了一个新的应用面广泛的高通量核酸检测平台。 它包含有直径5. 6 μ m的聚苯乙烯微球，其内部染有两种可以进行光谱区分的荧光染料。精 确控制两种荧光染料的量，可获得具有特异荧光编码的100种不同微球组。每种微球表面 都可以修饰上不同的反应物。因为可以根据微球的特异荧光编码来区分不同的微球组，所 以可以将它们混合在一起，在同一个反应容器中同时检测高达100种不同的分析物。在报 告分子上还耦合有第三种荧光用于定量分析发生于微球表面的生物分子间的相互作用。微 球在高速液流中经由液相芯片分析仪的两个独立激光进行分别检测。一个635nm、10mW的 红色二极管激光激发微球上的两种荧光，另一个532nm、13mW的钇铝石榴石(YAG)激光激发 结合在微球表面的报告分子的荧光(R-藻红蛋白，Alexa532,或Cy3)。高速数字信号处理器根据荧光编码地址对微球进行分类并定量微球表面的反应。每秒检测数千个微球的能力使 该分析系统可以在数秒内对同一反应容器中的每个样品同时分析和报告高达100个不同 的反应。与其它检测方法相比，基于液相芯片技术的检测平台具有以下优点需标本量少、 高通量检测；高速度、低成本；灵敏度高、有重复性好、线性范围广、操作简便等特点。采用多重PCR联合液相芯片技术，可以快速准确的对呼吸道病毒进行检测。
发明内容
本发明为了弥补现有技术的不足，提供一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物 与探针。
本发明利用多重聚合酶链反应(PCR)结合液相芯片来检测多种呼吸道病毒，其优势 在于，利用该项技术，可以平行一次检测14种呼吸道病毒，包括腺病毒(AdV)、人偏肺病毒 (hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、 鼻病毒(RV)、HKUl病毒(HKUl)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型 (PIVl)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)。并 且该技术操作便捷，特异性强，灵敏度高，稳定性好。本发明提出的检测多种呼吸道病毒的方法，包括如下步骤
(1)利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的腺病 毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病 毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKUl 病毒(HKUl)、NL63 病毒(NL63)、SARS 病毒 (SARS)、副流感病毒I型(PIVl)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副 流感病毒IV型(PIV4)的核酸序列进行广泛的病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的 特异性序列，设计出针对相应基因片段的反转录引物、PCR引物和特异性核酸探针。其中人 偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病 毒(RV)、HKUl 病毒(HKUl)、NL63 病毒(NL63)、SARS 病毒(SARS)、副流感病毒 I 型(PIVl)、 副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)等RNA病毒 需要设计反转录引物。腺病毒(AdV)和博卡病毒(BOV)这两种DNA病毒无需设计反转录引 物；
(2)采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；
(3)采用多重不对称PCR的方法分两组对病毒cDNA/DNA进行PCR扩增，其中每对引物 中有一个5’端修饰有生物素标记，以使该条单链产物能与偶联于微球上特异性核酸探针互 补结合并利于后期信号标记；
(4)特异性核酸探针5’端进行C12-胺基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR 扩增产物与偶联有特异性核酸探针的混合微球组温育杂交，最后用Bio-Plex 200进行检 测；
本发明所述对RNA病毒特异基因进行特异性反转录反应，针对不同病毒，其反转录序 列分别为SEQ ID Nos :1-12。对RNA病毒的多重特异性反转录反应增加了病毒检测的特异 性，减少了后期PCR扩增中非特异序列对扩增的影响，提高扩增效率，具有较高的灵敏度。名称序列SEQ ID No hMPV-rtpagactgtgaaacaagaggagac1IfA-rtptattgaaagatgagtcttctaacc2IfB-rtpttgaatgcatatgaccagagt3RSV-rtpgtaataactaaattagcagcagg4RV-rtptatatatattgtcaccataagc5HKUl-rtpC C ￡1 ￡1 ￡1 ￡1C ￡1 ￡1 ￡1C ￡1C ￡1 ￡1C ￡1 ￡1 6NL63-rtpgtaacaataacacaccacttctg7SARS-rtpcattctcctaagaagctattaa8PIVl-rtptcatcaaacttaatcactcaagg9PIV2-rtpaagctgttcagtcactgctatac10PIV3-rtpgacatggcataatgtgctatc11PIV4-rtptcacaacaatgaaaataatggac12。 本发明所述用于PCR扩增的病毒特异基因序列的引物，其序列针对不同病毒，分 别为SEQ ID Nos 14-41.选用的引物对各自扩增的病毒特异序列，都有很高的灵敏度，提 高了检测的准确性。
名称序列SEQ ID No AdV-Fgaygcytcggagtacctgag14AdV-RBtgccacngtggggttycta15hMPV-Fcttttgcgacacagcagcag16hMPV-RBagaggggacagtgcaaccat17IfA-Fttctaaccgaggtcgaaacgt18IfA-RBcaggattggtcttgtctttagc19IfB-FBaaggacattcaaagccaa20IfB-Ragttcttccgtgaccagt21RSV-FBactacccaaggacatagccaac22RSV-Raaatcccttcaactctactgcc23BOV-FBaaggctgagcgagaggcat24BOV-Ragtttttgaagaagcgaag25RV-FBcccctgaatgcggctaacctt26RV-Ragtgaaacacggacacccaaa27HKUl-Ftttgaagagtatagcagc28HKUl-RBcccaacccataagaacag29NL63-Fcgtacttctattatgaagcatga30NL63-RBgcagatctaatgttatacttaaa31SARS-Fagagccaccacattttca32SARS-RBacatggggatagcactac33PIVl-FBtacctatgacatcaacgac34PIVl-Rtcaaatactaaatcttcta35PIV2-FBctgagaaagaagattatgc36PIV2-Rctgttgtatttggaagaga37PIV3-FBggagcattgtgtcatctg38PIV3-Rcgtttactctttcggttg39PIV4-Fgctcccataatcgtcact40PIV4-RBtatttgcttggttccaga41 更佳的，本发明所述的引物中还有扩增人GAPDH基因片段的一个反转录引物，其序列为=SEQ ID No 13，和一对PCR引物，其序列分别为=SEQ ID Nos :42_43，用以作为内对 照片段，其中，PCR引物的设计使用跨内含子设计，以利于监控体系反转录效果，提高检测准 确性。
权利要求
一种检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，具体步骤为(1)利用生物信息学知识和相关生物信息学软件，对公开数据库中所能检索到的腺病毒(AdV)、人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、博卡病毒(BOV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4)的核酸序列进行病毒基因组序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对相应基因片段的反转录引物、PCR引物和特异性核酸探针；其中人偏肺病毒(hMPV)、流感病毒A型(IfA)、流感病毒B型(IfB)、呼吸道合胞病毒(RSV)、鼻病毒(RV)、HKU1病毒(HKU1)、NL63病毒(NL63)、SARS病毒(SARS)、副流感病毒I型(PIV1)、副流感病毒II型(PIV2)、副流感病毒III型(PIV3)、副流感病毒IV型(PIV4) RNA病毒设计反转录引物，腺病毒(AdV)和博卡病毒(BOV)这两种DNA病毒不设计反转录引物；(2)采用多重反转录反应的方法对RNA病毒的特定基因序列反转录成cDNA；(3)采用多重不对称PCR的方法分两组对病毒cDNA/DNA进行PCR扩增，其中每对引物中有一个5’端修饰有生物素标记，以使该条单链产物能与偶联于微球上特异性核酸探针互补结合并利于后期信号标记；(4)特异性核酸探针5’端进行C12 胺基化处理，与荧光编码的微球进行偶联；将PCR扩增产物与偶联有特异性核酸探针的混合微球组温育杂交，最后用Bio PlexTM 200进行检测。
2.如权利要求1所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述的反转录引物 包括针对12种呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列分别为SEQ ID Nos 1-13 hMPV-rtp agactgtgaaacaagaggagac SEQ ID No: 1 ； IfA-rtp tattgaaagatgagtcttctaacc SEQ ID No: 2 ； IfB-rtp ttgaatgcatatgaccagagt SEQ ID No: 3 ； RSV-rtp gtaataactaaattagcagcagg SEQ ID No: 4 ； RV-rtp tatatatattgtcaccataagc SEQ ID No: 5 ； HKUl—rtp ccaaaactaaactactaacaat SEQ ID No: 6 ； NL63~rtp gtaacaataacacaccacttctg SEQ ID No: 7 ； SARS—rtp cattctcctaagaagctattaa SEQ ID No: 8 ； PIVl-rtp tcatcaaacttaatcactcaagg SEQ ID No: 9 ； PIV2~rtp aagctgttcagtcactgctatac SEQ ID No: 10 ； PIV3-rtp gacatggcataatgtgctatc SEQ ID No: 11 ； PIV4_rtp tcacaacaatgaaaataatggac SEQ ID No: 12 ； GAPDH—rtp aatcatattggaacatgtaaacc SEQ ID No: 13。
3.如权利要求2所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于，所述的PCR引物包括 针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的PCR引物，其序列分别为:SEQ ID Nos 14-43 AdV-F gaygcytcggagtacctgag SEQ ID No: 14 ； AdV-RB tgccacngtggggttycta SEQ ID No: 15 ； hMPV-F cttttgcgacacagcagcag SEQ ID No: 16 ；hMPV-RB agaggggacagtgcaaccat SEQ ID No: 17 ； IfA-F ttctaaccgaggtcgaaacgt SEQ ID No: 18 ； IfA-RB caggattggtcttgtctttagc SEQ ID No: 19; IfB-FB aaggacattcaaagccaa SEQ ID No: 20 ； IfB-R agttcttccgtgaccagt SEQ ID No: 21 ； RSV-FB actacccaaggacatagccaac SEQ ID No: 22 ； RSV-R aaatcccttcaactctactgcc SEQ ID No: 23 ； BOV-FB aaggctgagcgagaggcat SEQ ID No: 24 ； BOV-R agtttttgaagaagcgaag SEQ ID No: 25 ； RV-FB cccctgaatgcggctaacctt SEQ ID No: 26 ； RV-R agtgaaacacggacacccaaa SEQ ID No: 27 ； HKUl-F tttgaagagtatagcagc SEQ ID No: 28; HKUl-RB cccaacccataagaacag SEQ ID No: 29 ； NL63—F cgtacttctattatgaagcatga SEQ ID No: 30 ； NL63-RB gcagatctaatgttatacttaaa SEQ ID No: 31 ； SARS-F agagccaccacattttca SEQ ID No: 32 ; SARS-RB acatggggatagcactac SEQ ID No: 33 ； PIVl-FB tacctatgacatcaacgac SEQ ID No: 34 ； PIVl-R tcaaatactaaatcttcta SEQ ID No: 35 ； PIV2-FB ctgagaaagaagattatgc SEQ ID No: 36 ； PIV2-R ctgttgtatttggaagaga SEQ ID No: 37; PIV3-FB ggagcattgtgtcatctg SEQ ID No: 38; PIV3-R cgtttactctttcggttg SEQ ID No: 39; PIV4-F gctcccataatcgtcact SEQ ID No: 40; PIV4-RB tatttgcttggttccaga SEQ ID No: 41 ； GAPDH-FB ggaaggtgaaggtcggagt SEQ ID No: 42 ； GAPDH-R gtagttgaggtcaatgaaggg SEQ ID No: 43。
4.如权利要求3所述的检测多种呼吸道病毒的方法，其特征在于所述的荧光编码微球 为15种不同荧光编码的微球，所述的核酸探针为15种特异性核酸探针，每种所述荧光编码 微球上固定有1种特异性核酸探针；所述的15种特异性核酸探针包括针对14种呼吸道病 毒和1种内对照基因的探针，其序列分别为:SEQ ID Nos 44-58 AdV-P gccaccgacacctacttca SEQ ID No: 44 ； hMPV-P tacccatgcaaagtcagc SEQ ID No: 45; IfA-P gagatcgcacagagacttga SEQ ID No: 46 ； IfB-P taattgtctccctcttctgg SEQ ID No: 47; RSV-P ctctggtagaagattgtgcta SEQ ID No: 48; BOV-P ctcctctgcgatctctatat SEQ ID No: 49; RV-P atcccgcaattactcattac SEQ ID No: 50 ； HKUl-P tcctgttgttataggaaccac SEQ ID No: 51 ；NL63-P aacgtacaggtgttattttg SEQ ID No: 52 ；SARS-P agggtacagtgaataatgct SEQ ID No: 53 ；PIVl-P tgtagtctcattcacagtgg SEQ ID No: 54;PIV2-P ataatagaaagcaagtctcagt SEQ ID No: 55 ；PIV3-P actctcgatttttgtgagtc SEQ ID No: 56;PIV4-P tttgttgatcaagacaataca SEQ ID No: 57 ；GAPDH-P agttaaaagcagccctggtg SEQ ID No: 58。
5.用于如权利要求1一4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的反转录引物，其特征 在于，包括针对12种呼吸道病毒和1种内对照基因的反转录引物，其序列分别为SEQ ID No 1- -SEQ ID No 13 。
6.用于如权利要求1一4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的PCR引物，其特征在 于，该PCR引物包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的PCR引物，其序列分别为SEQ ID No 14— SEQ ID No 43。
7.用于如权利要求1一4之一所述检测多种呼吸道病毒的方法的核酸探针，其特征在 于，包括针对14种呼吸道病毒和1种内对照基因的探针，其序列分别为SEQ ID No 44--SEQ ID No :58ο
8.一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，其特征在于包括如权利要求5所述的一组检测 多种呼吸道病毒的反转录引物组、如权利要求6所述的一组检测多种呼吸道病毒的PCR引 物组和如权利要求7所述的一组检测多种呼吸道病毒的核酸探针微球组。
全文摘要
本发明属于生物芯片和诊断试剂技术领域，具体公开了一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针。本发明对腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒(HKU1、NL63和SARS)、副流感病毒(I型、II型、III型和IV型)共14种呼吸道病毒核酸序列进行分析，设计相应的反转录引物、PCR引物和特异性探针；以反转录和多重不对称PCR的方法扩增特定基因片段；采用液相芯片技术将偶联有病毒特异性探针的荧光编码微球组与PCR扩增产物温育杂交，最后用Bio-PlexTM200进行检测。本发明的检测方法具有通量大，特异性及灵敏度高，结果稳定，重复性好，且操作简单，检测速度快。
文档编号C12Q1/68GK101985665SQ20101054285
公开日2011年3月16日 申请日期2010年11月12日 优先权日2010年11月12日
发明者姜丽娟, 李瑶, 肖海潮, 裘敏燕, 陈沁 申请人:复旦大学;联合基因(上海)健康管理服务有限公司