专利名称：利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产甘露三糖和蜜二糖的方法，特别是涉及一种利用大豆糖蜜发 酵生产甘露三糖和密二糖的方法。
背景技术：
大豆糖蜜是生产大豆浓缩蛋白过程中得到的副产品，大豆糖蜜中含有丰富的大豆 低聚糖，可作为功能性大豆低聚糖的生产原料。其中主要成分含量为总糖54. 64%(其中蔗 糖32. 17 %，棉籽糖4. 27%，水苏糖17. 54%)，总类脂18. 00%,总甾甙3. 06%,总磷脂8. 79%，粗 蛋白8. 71%，灰分8. 69%ο蜜二糖(melibiose)是一种由D-半乳糖和D-葡萄糖1，6_结合成的二糖。化学 的系统名称用0-α-半乳吡喃糖基-(1 —6)-D_葡萄吡喃糖。它是自然界中存在的一种 低聚糖，很多植物中都含有，但含量很少，单独提纯比较困难。甘露三 ft (manninotriose, 0_a_D_gal_(l — 6) _0_ a _D_gal_ (1 — 6)-a -D-glc)是地黄寡糖成分之一，在熟地中含量较高，具有促进造血细胞的增殖、提高免疫 力、降血糖、抗肿瘤等作用。目前大多数是用沸水从熟地黄中提取甘露三糖，也有文献记载用水苏糖水解提取 甘露三糖，分为酸水解和酶水解两种，但都成本较高，操作复杂，不适合大量生产。因此，提供一种工艺简单、效果显著的利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖 的方法，成为该领域技术人员急待着手解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低甘 露三糖和蜜二糖生产成本，减小投资，降低成本，易于生产应用的方法。为实现上述目的本发明所采用的实施步骤如下
一种利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖的方法，其特征在于其实施步骤如下
(1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母(distilleryyeast)TJZKBA10598接种到斜面上， 于28-37°C恒温培养2-4天，加入0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中 孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成按单位IL计包括蔗糖20g、酵母粉5g、 KH2PO4 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg、尿素 3g、琼脂 15g，用蒸馏水定容至 1L，ρΗ5· 5 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基 组成按单位IL计包括蔗糖含量20-60g，酵母粉4-8g，KH2PO4 0. 5_lg，FeSO4 · 7H20 0.01-0. 03g，尿素3-5g，用蒸馏水定容至1L，pH值5. 5 ；将液体种子培养基于121°C、15min 灭菌再冷却；然后按照体积比2-10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养 基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于28_37°C、转速为100_150rpm的摇床上培养 24h，得到一级液体种子；
(3)上述一级液体种子培养基用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子培养基相同，装液量3L ；将发酵罐培养基于121°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比 2-10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28-37°C，溶氧控 制在30%，培养时间24h，作为二级液体种子培养基；
(4)上述二级液体种子培养基用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释 1-5倍作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH值；将发酵罐培养基于12rC、15min 灭菌再冷却；然后按照体积比2-10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基 中，发酵温度28-37°C，溶氧控制在30%，发酵时间16-36h，制得发酵液；
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性炭柱分离层析，合 并含同一单组分的收集液55°C真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少量甘露三糖晶体和 蜜二糖晶体后，室温静置20-30h后，开始有明显晶体生成；沸水浴下缓慢加入85%乙醇溶 液3ml后，迅速得到大量晶体；室温静置24h后，过滤，滤饼即晶体用少量85%乙醇溶液冲 洗，合并滤液浓缩进行二次结晶；两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒重后，得到甘露三 糖22-70g/L和蜜二糖晶体5-15g/L。本发明的有益效果是本发明是一种利用酒精酵母发酵后再结晶产甘露三糖和 蜜二糖的方法，即利用大豆糖蜜这种廉价原料，进行发酵生产甘露三糖和蜜二糖，即解决了 废糖蜜的利用问题，同时又大大降低了成本，其工艺简单，产率高，质量好，不需要复杂的设 备，处理方法简单，为大豆糖蜜的加工开辟了新的途径；有利于甘露三糖和蜜二糖的开发应 用。本发明产品实用效果非常显著，且适于工业化生产。
具体实施例方式以下结合较佳实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下 实施例1
(1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母(distillery yeast)TJZKBA10598接种到斜面上， 于30°C恒温培养3天，加入0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含 量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括(IL)蔗糖20g ，酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g ，FeSO4 · 7H20 0. Olg，尿素3g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，ρΗ5· 5。(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组 成包括(1L):蔗糖含量20g，酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g, FeSO4 · 7H20 0. Olg，尿素3g，用蒸馏 水定容至1L，pH值5. 5。将液体种子培养基于12rC、15min灭菌再冷却；然后按照体积比 5%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是 100ml)，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子。(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子 培养基相同，装液量3L。将发酵罐培养基于121°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5% 的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30°C，溶氧控制在30%， 培养时间24h，作为二级液体种子。(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释1倍 作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH。将发酵罐培养基于12rC、15min灭菌再冷 却；然后按照体积比2-10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵 温度30°C，溶氧控制在30%，发酵时间36h，制得发酵液。
(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性炭柱层析分 离，合并含同一单组分的收集液55°C真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少量甘露三糖 晶体和蜜二糖晶体后，室温静置24h后，开始有明显晶体生成。沸水浴下缓慢加入85%乙醇 溶液3ml后，迅速得到大量晶体。室温静置24h后，过滤，滤饼(即晶体)用少量85%乙醇溶 液冲洗，合并滤液浓缩进行二次结晶。两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒重后，得到甘 露三糖晶体16879g和蜜二糖晶体4128g。实施例2
(1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母(distillery yeast)TJZKBA10598接种到斜面上， 于30°C恒温培养3天，加入0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含 量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括(IL)蔗糖20g，酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g， FeSO4 · 7H20 0. Olg，尿素3g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH5. 5。(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组 成包括(1L)蔗糖含量20g,酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg,尿素3g，用蒸馏 水定容至1L，pH值5. 5。将液体种子培养基于12rC、15min灭菌再冷却；然后按照体积比 5%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是 100ml)，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子。(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子 培养基相同，装液量3L。将发酵罐培养基于121°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5% 的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30°C，溶氧控制在30%， 培养时间24h，作为二级液体种子。(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释2倍 作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH。将发酵罐培养基于12rC、15min灭菌再冷 却；然后按照体积比5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度 30°C，溶氧控制在30%，发酵时间30h。(5 )发酵结束后，发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性 炭柱层析分离，合并含同一单组分的收集液55°C真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少 量甘露三糖晶体和蜜二糖晶体后，室温静置24h后，开始有明显晶体生成。沸水浴下缓慢加 入85%乙醇溶液3ml后，迅速得到大量晶体。室温静置24h后，过滤，滤饼(即晶体)用少量 85%乙醇溶液冲洗，合并滤液浓缩进行二次结晶。两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒 重后，得到甘露三糖晶体12027g和蜜二糖晶体2764g。实施例3
(1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母(distillery yeast)TJZKBA10598接种到斜面上， 于30°C恒温培养3天，加入0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含 量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括(IL)蔗糖20g，酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g， FeSO4 · 7H20 0. Olg，尿素3g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH5. 5。(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组 成包括(1L)蔗糖含量20g,酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg,尿素3g，用蒸馏 水定容至1L，pH值5. 5。将液体种子培养基于12rC、15min灭菌再冷却；然后按照体积比 5%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是100ml)，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子。(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子 培养基相同，装液量3L。将发酵罐培养基于121°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5% 的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30°C，溶氧控制在30%， 培养时间24h，作为二级液体种子。(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释4倍 作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH。将发酵罐培养基于12rC、15min灭菌再冷 却；然后按照体积比5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度 30°C，溶氧控制在30%，发酵时间24h。(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性炭柱层析分 离，合并含同一单组分的收集液55°C真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少量甘露三糖 晶体和蜜二糖晶体后，室温静置24h后，开始有明显晶体生成。沸水浴下缓慢加入85%乙醇 溶液3ml后，迅速得到大量晶体。室温静置24h后，过滤，滤饼(即晶体)用少量85%乙醇溶 液冲洗，合并滤液浓缩进行二次结晶。两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒重后，得到甘 露三糖7853g和蜜二糖晶体1621g。实施例4
(1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母(distillery yeast)TJZKBA10598接种到斜面上， 于30°C恒温培养3天，加入0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含 量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括(IL)蔗糖20g，酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g， FeSO4 · 7H20 0. Olg，尿素3g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，ρΗ5· 5。(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组 成包括(1L)蔗糖含量20g,酵母粉5g，KH2PO4 0. 5g，FeSO4 · 7H20 0. Olg,尿素3g，用蒸馏 水定容至1L，pH值5. 5。将液体种子培养基于12rC、15min灭菌再冷却；然后按照体积比 5%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中(500ml规格的摇瓶装液量是 100ml)，摇瓶于30°C、转速为150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子。(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子 培养基相同，装液量3L。将发酵罐培养基于121°C、15min灭菌再冷却；然后按照体积比5% 的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30°C，溶氧控制在30%， 培养时间24h，作为二级液体种子。(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释5倍 作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH。将发酵罐培养基于12rC、15min灭菌再冷 却；然后按照体积比5%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度 37°C，溶氧控制在30%，发酵时间16h。(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性炭柱层析分 离，合并含同一单组分的收集液55°C真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少量甘露三糖 晶体和蜜二糖晶体后，室温静置24h后，开始有明显晶体生成。沸水浴下缓慢加入85%乙醇 溶液3ml后，迅速得到大量晶体。室温静置24h后，过滤，滤饼(即晶体)用少量85%乙醇溶 液冲洗，合并滤液浓缩进行二次结晶。两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒重后，得到甘 露三糖晶体6584g和蜜二糖晶体1367g。
上述参照实施例对利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖的方法进行的详细 描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离 本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
一种利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖的方法，其特征在于其实施步骤如下 (1)孢子菌悬液的制备将酒精酵母TJZKBA10598接种到斜面上，于28 37℃恒温培养2 4天，加入0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105 106个，待用；斜面培养基组成按单位1L计包括蔗糖20g、酵母粉5g、KH2PO4 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g 、尿素3g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH5.5；(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成按单位1L计包括蔗糖含量20 60g，酵母粉4 8g，KH2PO4 0.5 1g， FeSO4· 7H2O 0.01 0.03g，尿素3 5g，用蒸馏水定容至1L，pH值5.5；将液体种子培养基于121℃、15min灭菌再冷却；然后按照体积比2 10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于28 37℃、转速为100 150rpm的摇床上培养24h，得到一级液体种子；(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中，培养基与上述液体种子培养基相同，装液量3L；将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却；然后按照体积比2 10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28 37℃，溶氧控制在30%，培养时间24h，作为二级液体种子；(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的500L发酵罐中，将大豆糖蜜稀释1 5倍作为培养基，装液量定容至300L，无需调节pH值；将发酵罐培养基于121℃、15min灭菌再冷却；然后按照体积比2 10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度28 37℃，溶氧控制在30%，发酵时间16 36h，制得发酵液；(5)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心20分钟除菌体，用活性炭柱分离层析，合并含同一单组分的收集液55℃真空浓缩至过饱和糖浆之后，分别加入少量甘露三糖晶体和蜜二糖晶体后，室温静置20 30h后，开始有明显晶体生成；沸水浴下缓慢加入85％乙醇溶液3ml后，迅速得到大量晶体；室温静置24h后，过滤，滤饼即晶体用少量85％乙醇溶液冲洗，合并滤液浓缩进行二次结晶；两次所得晶体放置于干燥器中干燥至恒重后，得到甘露三糖22 70g/L和蜜二糖晶体5 15g/L。
全文摘要
本发明涉及一种利用大豆糖蜜发酵生产甘露三糖和密二糖的方法，实施步骤如下(1)孢子菌悬液的制备；(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中；(3)上述一级液体种子用于接种至灭菌后的5L种子罐中发酵培养作为二级液体种子；(4)上述二级液体种子用于接种至灭菌后的发酵罐中，将大豆糖蜜稀释作为培养基进行发酵培养；(5)将发酵液离心除菌体，用活性炭柱分离层析，进一步制备得到甘露三糖和蜜二糖晶体。本发明方法利用大豆糖蜜这种廉价原料，进行发酵生产甘露三糖和蜜二糖，有效解决了废糖蜜的利用问题；其工艺简单，产率高，质量好，成本低，不需要复杂的设备，有利于甘露三糖和蜜二糖的开发应用。
文档编号C12R1/645GK101974582SQ20101054252
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者刘云, 刘晓鸥, 国华, 徐勇虎, 李睿颖, 王永乐, 胡娅君 申请人:天津实发中科百奥工业生物技术有限公司