专利名称：利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种发酵生产果聚糖的方法，特别涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖(Ievan)的方法。
背景技术：
Ievan (莱万)是一种具有广泛用途的胞外多糖，是果聚糖的一种，是由果糖残基包在球状结构里组成，以β _2，6糖苷键相连的D-果糖构成的多糖，分子式为(C18H32O16)ntl许多微生物在自然环境中都能产生胞外多聚物(EPS)，果聚糖(Ievan)只不过是被发现的其中一种，这些胞外多聚物多数存在于湍急的小溪中。它们可以保护微生物避免干燥和毒性的侵蚀损害，并且可以储存碳源。果聚糖(Ievan)也可以从商品生产中的细胞碎片中被分离出来。在医药上，果聚糖(Ievan)可用作皮下注射用胆固醇，抗肿瘤、免疫调节剂、抗炎类药物和血浆的替代品。在食品上被用作双呋喃果糖、果糖、低聚果糖，还可用作乳化剂、包封剂、色素和香味剂及脂肪的替代品。Ievan早在100多年前就被发现了，由于它的性质区别于其他多糖，所以引起了人们极大的兴趣。一开始只是用在医学上并且用量很少，因为成本很高，人们致力于大规模生产果聚糖(Ievan)，实现最大经济利益。目前主要是利用运动单胞杆菌和枯草芽孢杆菌发酵生产果聚糖(Ievan)，生长周期较长，一般在M-72个小时，菌种耐受底糖浓度低，转化率低，造成成本较高，给应用推广带来很大阻力。因此，提供一种工艺简单、效果显著的利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖(Ievan) 的方法，成为该领域技术人员急待着手解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足之处，提供一种高效可行并可降低果聚糖(Ievan)生产成本，减小投资，易于生产应用的利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法。为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g、酵粉5g、蛋白胨 10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌TJZKBA10658 ；
(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于30-40°C、转速为120-200rpm的摇床上培养M小时，得到液体种子；
(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL 蔗糖 100-500g、酵母粉 4-8g、蛋白胨 5-10g ;MgS04 0. 1-0 . 4g、NaCl 0. 5-2. 0g, K2HPO4 2-4g,KH2PO4 2-4g，MnSO4 0. 2-lg, FeCl2 0. 2_lg，用蒸馏水定容至 3L，pH值 5. 0-8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-1 的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40°C，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30小时；
(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量 6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan)的产量为40_240g/L。本发明的有益效果是本发明利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖(levan)，可以大大减短发酵周期，常见的使用枯草芽孢杆菌或运动单胞杆菌发酵工艺周期约是7 左右，但是地衣芽孢杆菌发酵周期可以降至20-M小时，可将生产效率提高有效的提高生产效率。并且不需要复杂的设备，处理方法简单，发酵过程简单易行，大大提高了各种底物的利用率。因此降低了生产成本，利于果聚糖(Ievan)的开发应用的推广。该方法具有很高的实际应用价值，市场优势非常明显，且适于工业化生产。
具体实施例方式以下结合实施例，对依据本发明提供的具体实施方式
详述如下 实施例1
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位IL 葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖60g，酵母粉5g，蛋白胨10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为 160rpm的摇床上培养M小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 1L:蔗糖 100g，酵母粉 4g，蛋白胨 IOg5MgSO4 0. 2g, NaCl 1. Og，K2HPO4 1. 5g, KH2PO4 2. 0g, MnSO4 0. 5g，FeCl2 lg，用蒸馏水定容至3L，pH值7. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度40°C，溶氧控制在30%，发酵时间14小时；
(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 143. 2g。实施例2
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖40g，酵母粉4g，蛋白胨6g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养M小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位IL 蔗糖 250g，酵母粉 5g，蛋白胨 8g ;MgS04 0. 3g,NaCl 1. 5g, K2HPO4 2. OgjKH2PO4 3. OgjMnSO4 0. 2g，FeCl2 0. 5g，用蒸馏水定容至3L，pH值6. 5，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比10%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度35°C，溶氧控制在40%，发酵时间20小时；
(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 326. Sg。实施例3
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L:蔗糖60g，酵母粉7g，蛋白胨7g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养M小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 1L:蔗糖 400g，酵母粉 6g，蛋白胨 8g ;MgS04 0. 15g，NaCl 0. 5g, K2HPO4 2. Og, KH2PO4 2. 5g， MnSO4 lg，FeCl2 0. 2g，用蒸馏水定容至3L，pH值8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比8%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度37°C，溶氧控制在30%，发酵时间M小时；
(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量8000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 483. lg。实施例4
(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g，酵母粉5g，蛋白胨10g，琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) TJZKBA10658 ；
(2)上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位1L:蔗糖50g，酵母粉8g，蛋白胨5g，用蒸馏水定容至lL，pH值7.0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比10%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于35°C、转速为160rpm 的摇床上培养M小时，得到液体种子；
(3)上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 1L:蔗糖 500g，酵母粉 8g，蛋白胨 IOg ;MgS04 0. 2g, NaCl 1. Og，K2HPO4 3. Og，KH2PO4 3. Og, MnSO4 0. 4g、FeCl2 0. 6g，用蒸馏水定容至3L，pH值7. 5，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比12%的接种量将液体培养基接入上述冷却的发酵罐培养基中， 发酵温度40°C，溶氧控制在40%，发酵时间30小时；
(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000 道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖(Ievan) 683. 4g。 上述参照实施例对利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖(Ievan)的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可根据所限定范围例举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，其特征在于实施步骤如下(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30°C 恒温培养2-4天，加入质量浓度为0. 75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为IO5-IO6个，待用；斜面培养基组成包括，单位1L:葡萄糖2g、酵粉5g、蛋白胨 10g、琼脂15g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；其中所用菌种地衣芽孢杆菌TJZKBA10658 ；(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，液体种子培养基组成包括，单位IL 蔗糖20-60g、酵母粉4-8g、蛋白胨5-10g，用蒸馏水定容至1L，pH值7. 0 ；将液体种子培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积百分比5-12%的接种量将孢子菌悬液接入上述冷却的液体种子培养基中，500ml规格的摇瓶装液量是100ml，摇瓶于 30-40°C、转速为120-200rpm的摇床上培养24小时，得到液体种子；(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵罐培养基组成包括，单位 IL 蔗糖 100-500g、酵母粉 4-8g、蛋白胨 5-10g ;MgS04 0. 1-0 . 4g、NaCl 0. 5-2. 0g, K2HPO4 2-4g、KH2PO4 2-4g,MnSO4 0. 2_lg、FeCl2 0. 2_lg，用蒸馏水定容至 3L，pH 值 5. 0-8. 0，将发酵罐培养基于121°C、15分钟灭菌再冷却；然后按照体积比5-1 的接种量将液体种子接入上述冷却的发酵罐培养基中，发酵温度30-40°C，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30小时；(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量 6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖levan。
全文摘要
本发明涉及一种利用地衣芽孢杆菌发酵生产果聚糖的方法，实施步骤如下(1)孢子菌悬液的制备将地衣芽孢杆菌TJZKBA10658接种到培养基斜面上，于30℃恒温培养2-4天，加入质量浓度为0.75%的生理盐水洗涤菌丝体，获得孢子菌悬液，悬液中孢子含量约为105-106个，待用；(2)将上述孢子菌悬液用于接种至灭菌后的液体种子培养基中，得到液体种子；(3)将上述液体种子用于接种至灭菌后的5L发酵罐中，发酵温度30-40℃，溶氧控制在30-40%，发酵时间14-30h；(4)发酵结束后，将发酵液6000转/分钟离心15分钟除菌体，取上清液过分子量6000-8000道尔顿超滤膜，截留液浓缩喷粉，得到果聚糖产量为40-240g/L。本发明工艺简单，效率高、成本低，利于果聚糖的开发应用的推广。
文档编号C12P19/04GK102168121SQ201010542460
公开日2011年8月31日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者刘云, 刘晓鸥, 国华, 徐勇虎, 李睿颖, 王永乐, 胡娅君 申请人:天津实发中科百奥工业生物技术有限公司