专利名称：一个水稻PHD-finger家族蛋白基因KT496在提高植物耐逆性能上的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物生物工程和植物改良基因工程技术领域，特别涉及来源于水稻的 与抗逆相关的KT496基因在提高植物耐高盐、低温和干旱中的应用。
背景技术：
水稻、玉米和小麦是我国重要的粮食作物，三大作物的产量、品质对于我国的粮食 生产和粮食安全都至关重要。干旱、盐碱、高温和冻害等非生物逆境会直接影响粮食作物的 正常生长和产量。利用现代农业生物技术，如转基因技术培育具有耐逆性和广泛适应性的 农作物新品种，可以使农作物在逆境条件下保持稳定高产。随着转基因研究的深入，已经陆 续分离克隆了一些与抗逆相关的基因，包括代谢过程中的关键调控基因，渗透调节蛋白、小 分子物质，还有参与调控各种逆境应答途径的转录因子等。PHD-f inger是一类特征为Cys4-His_Cys3的锌指蛋白结构域，长约50 80 个氨基酸，大小及氨基酸的排列方式均与RING-fnger (Cys3-His-Cys4)和LIM结构域 (Cys-His-Cys)相似，而蛋白质3D结构差别却较大，其中PHD_f inger和RING以交替支持捆 绑方式结合2个锌原子，即2个锌原子结合位点分别由第1、第3对和第2、第4对金属配基 组成；而LIM采用连续锌原子结合方式，即2个锌原子结合位点依此由第1、第2对与第3、 第4对金属配基形成。此外，PHD-f inger的疏水中心比RING多1个保守的色氨酸残基。Schindler等最早观察拟南芥同源域蛋白(Homeodomain)HAT3和玉米Zmhoxl蛋 白中均有一富含半胱氨酸的结构域，并将其命名为PHD-f inger。随后证明PHD-f inger并 非植物特有，它也广泛存在于酵母、线虫与哺乳动物中，亦称白血病关联蛋白(Leukemia associated protein，LAP)。PHD-finger具有重要的生物学功能，主要存在于两类蛋白 中1)转录调节蛋白，如激活子、抑制子或协因子(cofactors)等；幻染色质调节复合物 (chromatin modulating complexes)相关蛋白或包含乙酰转移酶的复合物蛋白，如p300 或CBP，它可能是蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA或蛋白质与RNA相互作用区。已发现数种 具PHD-finger的拟南芥蛋白质，如参与抗病相关基因表达调控的PRHA蛋白；花粉成熟的 核信号分子MSl蛋白；发育和减数分裂过程中基因表达调控的SHL和MMDl蛋白等，并克隆 了它们的编码基因。研究发现，从水稻幼胚cDNA文库中克隆的PHD-finger家族蛋白基因HAZl具有标 识球形+胚径向轴分化的作用。从水稻中分离克隆PHD-finger家族蛋白基因，并研究其在 水稻生长发育和逆境信号传导途径中的作用，直接为农作物的性状改良提供了重要的基因 资源，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一个与耐逆性相关的水稻PHD-finger家族转录因子及其基 因KT496，以用于提高植物的耐逆性能。
发明所提供的与耐逆性相关的KT496基因，来源于稻属水稻(Oryza sativa L.)， 编码具有下述氨基酸序列的蛋白质1)序列表中的 SEQ ID NO 1 ；序列表中的SEQ ID NO :1由689个氨基酸残基组成，为蛋白KT496。本发明中水稻与耐逆性相关的KT496的编码基因既可为所述基因的cDNA序列， 也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与所述基因具有90%以上同源性且编码相同功 能蛋白的DNA序列。具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的编码基因可以具有序列表中SEQ IDNO 2的核苷酸序列。含有本发明基因的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增KT496任一片段的引物对也在本发明的保护范围之内。本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。本发明所提供的提高植物耐逆性的方法，是将编码本发明与耐逆性相关的基因导 入植物组织、细胞或器官，植物耐逆性获得提高。在上述提高植物耐逆性的方法中，本发明中水稻与耐逆性相关的KT496基因既可 为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组基因序列；与所述基因具有90%以上同 源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组基因序列用已知的方 法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列 中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例 如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变 化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知 的。本发明水稻与耐逆性相关KT496基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植 物组织、细胞或器官；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农 杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如PBin系列载 体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如pBI 101等)WatewayTW系列载体(如pH2GW7等)、 pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发 载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTER-TOPO、pUC系列载体或pBluescript系 列载体等。使用本发明中水稻与耐逆性相关的KT496基因或其同源序列构建植物表达载体 时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型(ABA、干 旱、盐碱或化学诱导等)启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒(CAMV)35S 启动子，玉米WDiquitin启动子或水稻actinl启动子等；所述组织特异性表达启动子可 为根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子、维管特异性表达启动子、种子特异性表 达启动子、花特异性表达启动子或花粉特异性表达启动子，如2S1启动子(GenBank号 NM_118848. 2, GI :30687489)和 NapinA (GenBank 号:M64633. 1，GI :349405)启动子等；所述 诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单 独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还 可使用增强子，包括翻译增强子和/或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子 或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起 始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行 加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、 GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、 潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、庆大霉素标记物或卡那霉素 标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。所述含新霉素磷酸转移酶 (NPTII)基因的宿主植物细胞、组织或器官可由卡那霉素或其替代衍生物如G418等进行筛 选，含潮霉素磷酸转移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植物细胞、组织或 器官可由潮霉素进行筛选。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接 以逆境筛选转化植株。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检 测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。其中，本发明以PCAMBIA1300为出发载体，构建的含有本发明水稻与耐逆性相关 的KT496基因的植物表达载体命名为pCactF-KT496。携带有本发明水稻与耐逆性相关的 KT496基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、 Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌 介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将 转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组 织、茎尖、叶片和种子等。此外，通过将转化有本发明水稻与耐逆性相关的KT496基因或其同源序列的转基 因植株进行继代培养后，可从中进一步筛选出基因纯合的转基因植株。此外，还可对该转基 因植株进行扩繁，可使转基因植物的耐逆性进一步改善和提高。所述转基因植物的扩繁包 括无性繁殖和/或种子繁殖。本发明的方法对双子叶植物和单子叶植物均适用，因此，所述被转化的植物细胞、 组织或器官既可来源于烟草、油菜、棉花、大豆、杨树、桉树、马铃薯或牧草等双子叶植物，也 可来源于水稻、玉米、小麦、大麦、高梁、谷子或草坪草等单子叶植物。本发明提供了一个与耐逆性相关的PHD-finger蛋白转录因子家族基因KT496。实 验证明，将本发明的基因转化水稻可提高水稻对高盐、干旱和低温逆境胁迫的耐受性，且对 水稻的正常生长和经济性状没有明显的影响。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机 制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植 物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1KT496基因的逆境表达谱分析。“CK”为对照；“D1”为干旱处理至叶片微卷时； “D2”为干旱处理至叶片半卷时；“D3”为干旱处理至叶片全卷时；“Si”为盐处理至叶片微 卷；“S2”为盐处理至叶片半卷；“S3”为盐处理至叶片全卷；Actin为水稻内参基因。图2表达载体pCactF的T-DNA区图谱。LB和RB分别为T-DNA的左边界和右边 界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的启动子；T35S表示35S基因的终止子；pAct
5表示Actin基因的启动子；3flag表示3倍的flag标签序列；OCS表示ocs基因的终止子； HindIII、KpnI、SpeI、)(bal、SalI和I3StI分别表示限制性内切酶的酶切位点。图IT496转基因株系的耐旱性分析及存活率统计。A 旱处理前苗生长状态；B 复水前苗生长状态；C 复水一周后苗生长状态；D 旱处理后的存活率统计。图4KT496转基因株系的耐盐性分析及存活率统计。A 盐处理前苗生长状态；B 盐处理后苗生长状态；C 正常培养一周后苗生长状态；D 盐处理后的存活率统计。图^^496转基因株系的耐低温分析及存活率统计。A 低温处理前苗生长状态；B 低温处理后苗生长状态；C 正常培养一周后苗生长状态；D 低温处理后的存活率统计。图6KT496转基因株系的表达分析。“1”为质粒对照；“2”为野生型日本晴对照； “3”为转空载体对照；“4-8”为KT496转基因株系；“KT496”为KT496基因的扩增产物； “Actin”为水稻内参基因Actin的扩增产物。
具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物 技术公司合成，测序由北京华大基因完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自 宝生物工程有限公司，pEASY-Tl连接试剂盒购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶 购自Promega公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pHPG由本实验 改造所得，基本骨架来自于CAMBIA公司的pCAMBIA1303。 1、KT496基因的表达谱分析1. 1植物材料及处理选取两叶期的日本晴材料进行逆境处理。其中干旱处理的材料和样品在以下阶段 收集期I(Dl)叶轻微卷，相对含水量(RWC)在90%-95% ；期2(拟)叶半卷，相对含水 量(RWC)在80%-85% ；期3(D!3)叶完全卷，相对含水量在70%-75%。D1、D2和D3代表 干旱处理的三个阶段。对每个处理阶段，取样三份。采样完毕，样品立即用液氮冷冻保存 于-80 0C ο200mM高盐处理的材料和样品也分以上三个时期进行收集和保存。KT496 基因的 RT-PCR 分析KT496基因的RT-PCR检测引物引物 1 5，-gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG-3‘引物 2 5，-ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC-3，KT496基因的RT-PCR扩增片段是基因全长2067bp。Actin 基因的 RT-PCR 引物 引物 3 5，-TGTTCCTGCCATGTATGT-3，引物 4 5，-ATGTCCCTCACAATTTCC-3，ACTIN基因的RT-PCR扩增片段是252bp。以上引物分别以经过步骤1. 1处理后的水稻幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正 常生长的中花11幼苗CDNA，检测这些基因在盐处理和干旱处理中的表达变化，PCR检测体 系和程序为IOXbuffer2
IOmM dNTP0. 4IOM 引物 F0.4IOM 引物 R0.4Taq polymerase0. 4cDNA1ddH2015. 4PCR反应条件为预变性95 °C，5分钟；变性94°C，30秒，，退火55°C，30 秒，延伸:72°C，2min，沘个循环；72 °C，10 分钟。反应结束后，对PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图1，其 中D表示干旱处理；S表示盐处理；字母后的数字1、2和3分别指干旱处理和盐处理的三个 程度。KT496指该基因的扩增产物；Actin指水稻actin基因的扩增产物。可见，KT496基 因在水稻幼苗中呈干旱和高盐诱导性。2、0496基因的分离从基因的编码起始位点ATG开始设计5’端引物，于终止密码处设计3’端引物引物 5 :5，gtcgacATGAATGTCTTGTGTGAAGTG 3，引物 6 :5，ctgcagCTAAAGCATCGATAACTTCGTATC 3，引物1中gtcgac序列为限制性内切酶MlI的酶切位点，下划线标识的序列为 KT471基因的编码序列；引物2中ctgcag序列为限制性内切酶I^stI的酶切位点，下划线标 识的序列为KT496基因的编码序列。提取幼苗期的日本晴水稻的总RNA，通过反转录得到cDNA，RT-PCR方法，用以上引 物扩增得到全长基因，基因长度为2067bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，所 编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。具体反应为取约2 μ g 的总 RNA，加入 1 μ 1 IOXDNase buffer, 1 μ 1 的 DNase， 补DEPC处理过的水至10 μ 1体系，混勻，37 0C温育30min后，力卩入1 μ 1的RQ DNase stop solution，65°C 温育 IOmin 以终止反应后，加入 2μ 1 Oligo (dT) 18primer (0. 1 μ g/ μ 1),4 μ 1 5X First-strand buffer,1 μ 1 Ribonuclease inhibitor(40U/μ 1) , 2 μ 1 4Χ dNTP (各 IOmM)，1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，小心混勻，37°C保温 1 小时。然后90°C处理5分钟，冰上冷却，离心收集即获得相应的反转录产物cDNA。将得到 的cDNA稀释10倍，取1 μ 1作为PCR反应的模板，上、下游引物(10 μ Μ)各1 μ 1，LATaq酶 (5U/y 1)0. 5 μ l，4XdNTPs (各 IOmM) 1 μ 1，2XGC buffer (Mg2+) 25 μ 1，H20 20. 5 μ 1。PCR 反应条件为预热95°C 5min,变性94°C lmin,退火56°C 30sec,延伸72°C 2minl0sec, 34个循 环。反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，经扩增获得了大小与预期 结果相符的DNA片段。回收并纯化上述片段，将其连接入载体pEASY-Tl (全式金公司)中， 通过热激法转化大肠杆菌(E. coli) T0P10菌株，挑选阳性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉 素的LB液体培养基中，37°C、200rpm的摇床中培养12-16小时，提取质粒，得到含有目的片 段的重组质粒，测序验证正确后，用MlI和I3StI双酶切，切下目的片段，连入同样进行双酶 切的pCactF植物表达载体，得到pCactF-KT496，挑取菌落PCR鉴定为阳性的菌落进行测序验证。植物表达载体PCactF的T-DNA区图谱如图2所示。3、KT496转基因水稻的获得用农杆菌介导法将按具体实施方式
2获得的与耐逆性相关的基因KT496转化水 稻，具体方法如下利用热激法将上述重组载体pCactF-KT496转入农杆菌AGLO菌株(中国科学院遗 传所赠送)，利用农杆菌对水稻进行共转化。将获得的水稻转基因植株的部分叶片，按常规方法提取总DNA，在正向引物 5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3，和反向引物 5，-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3，的引导下，PCR 扩增 潮霉素磷酸转移酶基因，经扩增获得1009bp DNA片段的为阳性转基因植株，检测结果表明 用上述方法获得了转化有pCactF-KT496的转基因水稻。4、KT496转基因植株的耐旱性鉴定收获KT496T1代转基因水稻种子，选取5个系进行干旱胁迫。用水浸种培养3天 使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛 选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性 分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3 1的株系，结果表明获得了具有单位点插 入的KT496的Tl转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每 瓶10株，三个重复。培养至三叶期时(第3片叶完全舒展)，进行急性干旱处理。旱筛前 将苗根部洗净，选生长状态(粗细、株高)一致的苗(图3A)，用吸水纸将根部水吸干，放入 干燥的新三角瓶中。每瓶详细记录干旱起始时间，筛选至对照茎秆部分九成干或以上。旱 筛过程大约9个小时左右(视表型而定)，然后复水，三角瓶中的营养液2天更换一次，以 保持营养液的新鲜状态。干旱处理后的苗生长状态如图3B所示，复水正常培养一周后苗恢 复状态如图3C所示。最后统计各株系的苗存活率，如图3D的柱形图所示，CK的存活率为 16. 7 %，而转KT496基因的株系的存活率均在65 %及以上，存活率远高于对照。在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐旱性实验，结果与 上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐旱性的作用。5、KT496转基因植株耐盐性鉴定收获ΚΤ496Τ1代转基因水稻种子，选取5个系进行盐胁迫。用水浸种培养3天使 其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛选5 天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性分离 比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3 1的株系，结果表明获得了具有单位点插入的 KT496的Tl转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每瓶10 株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图4A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液进行盐筛，约3天左右，对照出现叶尖发黄泛白，叶片下垂或半卷甚至 全卷时(图4B)，洗去盐溶液，正常培养。期间每1.5天更换一次盐溶液。复水第二天再更 换一次营养液，以去除剩余的盐分。三角瓶中的营养液2天更换一次，以保持营养液的新鲜 状态。一周后照相(图4C)，统计成活苗数，计算耐盐苗比例，结果如图4D(横坐标为不同的 转基因株系编号，纵坐标为耐盐苗百分比)。实验结果显示，Tl代转基因水稻植株对盐的耐 受能力明显高于未转基因水稻植株，经盐处理后，KT496转基因水稻Tl代阳性株系的植株 恢复培养后能够继续生长，转空载体的中花11对照(CK)植株的叶片发黄、卷曲、干枯，茎杆不能直立，恢复培养后很快死亡(图4C)。在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐盐性实验，结果与 上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐盐性的作用。6、KT496转基因植株耐低温性鉴定收获KT496 Tl代转基因水稻种子，选取5个系进行低温胁迫。用水浸种培养3天 使其萌发，然后用50mg/L潮霉素进行抗性筛选，同时以转空载体的水稻中花11作对照，筛 选5天后，对照植株全部死亡，统计转基因植株抗性苗与死亡苗数，分析转基因植株的抗性 分离比，选择抗性苗与无抗性苗的分离比约为3 1的株系，结果表明获得了具有单位点插 入的KT496的Tl转基因株系，待苗长到8cm左右时，将小苗从培养皿中转移到三角瓶中，每 瓶10株，三个重复。培养至三叶期(第3片叶完全舒展)，其生长状态如图5A。开始4。C 冷筛，当对照新叶、老叶全卷后1至2天(图5B)，重新正常培养，期间三角瓶中的营养液2 天更换一次，以保持营养液的新鲜状态。低温筛选结果如图5C所示，转空载体对照株系大 部分都已发黄、萎蔫、死亡，而转基因植株表现出很强的低温耐受力和恢复能力，恢复一周 后的存活率统计如图5D，转基因株系的存货率均比对照要低。在获得KT496转基因水稻T2代的种子后，我们再一次进行了耐低温性实验，结果 与上述实验结果相一致。此实验说明KT496基因具有增强水稻耐受低温的能力。7、KT496转基因植株的表达分析KT496基因的RT-PCR检测引物引物 7 5 ‘ GATAAAGTCGAGGGGGGGCC 3 ‘引物 8 5 ‘ CACTTGCGAAATGCTTA 3 ‘KT496基因的RT-PCR扩增片段是381bp。以上引物分别以水稻KT496转基因各株系的幼苗cDNA为模板，阴性对照模板为正 常生长的日本晴幼苗cDNA，检测KT496基因在转基因水稻中的表达情况，PCR检测体系和程 序为IOXbuffer2IOmM dNTP0. 4IOM 引物 F0.4IOM 引物 R0.4Taq polymerase 0. 4cDNA1ddH2015. 4PCR反应条件为预变性95°C，5分钟；变性94°C，30秒，，退火55°C，30 秒，延伸:72°C，2min，沘个循环；72 °C，10 分钟。反应结束后，对PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR检测结果见图6，其 中，KT496指该基因的扩增产物；Actin指水稻actin基因的扩增产物。可见，KT496基因在 转基因水稻幼苗中均有不同程度的表达。
权利要求
1.一种增强植物抗逆性的方法，其特征是将植物抗逆相关蛋白的编码基因插入表达载 体，获得含有植物抗逆相关蛋白编码基因的重组表达载体，将该重组表达载体导入目的植 物，从表达所述植物抗逆相关蛋白的植株或所述植物抗逆相关蛋白表达量增加的植株中筛 选得到抗逆性增强的植株；其中，所述植物抗逆相关蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示ο
2.权利要求1所述的增强植物抗逆性的方法，其特征在于所述植物抗性相关蛋白的 编码基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；2)与SEQID NO :2序列具有90%以上相似性且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
3.权利要求1所述的方法，其特征在于将所述抗逆相关蛋白编码基因导入植物组织、 细胞或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，得到耐逆性提高的转基因植 物。
4.权利要求1所述的方法，其中所述表达载体的特征是用于构建所述植物表达载体 的出发载体是一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微 弹轰击的载体，或者是可在原核生物中复制的载体。
5.权利要求4所述的方法，其中所述表达载体的特征是用所述抗逆相关蛋白编码基 因构建植物表达载体时，用一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子来驱动其表 达。
6.权利要求4所述的方法，其中所述出发载体为pCAMBIA系列载体，优选为 PCAMBIA1300。
7.权利要求1所述的方法，其中所述增强植物的抗逆性是指增强植物耐受低温、干旱 和高盐的能力。
8.权利要求1所述的方法，其中所述抗逆相关蛋白可用于增强转基因水稻的耐逆性。
9.权利要求8所述的方法，其中所述增强转基因水稻的耐逆性是指增强了水稻对低 温、干旱和高盐的耐受性。
全文摘要
本发明公开了一个来源于水稻的与耐逆性相关的PHD-finger家族转录因子基因KT496。实验证明，将本发明的基因转化水稻可显著提高水稻对低温、高盐和干旱胁迫的耐受性。本发明的蛋白及其编码基因对于植物耐逆机制的研究，以及提高植物的耐逆性及相关性状的改良具有重要的理论及实际意义，将在植物(特别是禾谷类作物)的耐逆基因工程改良中发挥重要作用，应用前景广阔。
文档编号C12N15/29GK102127551SQ20101056604
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月25日 优先权日2009年11月25日
发明者刘春霞, 刘雨, 周君莉, 李早霞, 李晓娟, 王喜萍 申请人:北京未名凯拓作物设计中心有限公司