专利名称：BGIos101基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因，特别是涉及BGIoslOl基因，及其促进植物、特别是单子叶 植物籽粒变大的用途及方法。
背景技术：
水稻(Oryza sativa)是全世界最重要的粮食作物之一，全世界约30多亿人口以 稻米为主食(Delseny M et al，2001)。水稻也是我国第一大粮食作物，其面积、单产和总产 量均居首位，水稻生产在我国国民经济中具有举足轻重的地位。随着人口增长和人民生活 水平的提高，市场对优质稻米有更大需求。粮食生产不但要提高品种的产量潜力，更要注重 品质的改良，而水稻粒型(粒长、粒宽和长宽比)和千粒重会影响稻米外观、产量及市场价 值。因此，选育大粒优质的水稻新品种已成为水稻育种的一个主要目标，发掘控制水稻粒型 和千粒重的主要基因是当前遗传学家和育种家们共同关注的焦点。这对提高稻谷产量和稻 米市场的竞争力具有重要意义。水稻产量主要由千粒重、有效穗数和每穗粒数决定。据国内外研究，在构成水稻 产量的三要素中，千粒重也即谷粒重量的遗传比较稳定，其变异系数为40% 60%。菲律 宾国际水稻研究所研究认为，增加粒重可提高水稻产量30%以上(姚国新和卢磊，安徽农 业科学，2007，35 07) :8468-8478)。从代谢生理和形态学上看，高产必须具备两个条件， 即高水平的代谢源和足够大的贮藏库，其中后者表现在粒数多和谷粒大，即对光合产物有 较大的容纳力。基于以上分析，想实现水稻产量的进一步飞跃，提高粒重的途径是值得重 视的，提高粒重是提高粮食产量的有效途径(熊振民和孔繁林，江苏农业科学4，1981，48 25-30)。水稻千粒重由谷粒长度、宽度和厚度三者决定，是一个典型的受多基因控制的数 量性状遗传。克隆控制粒重的主要基因并加以改造利用是提高粮食产量的有效方法。目前 水稻的全基因组测序工作已经完成，在水稻上已经积累了相当详细的资料，为水稻重要性 状基因的定位克隆提供了便利。但是关于水稻粒重的基因定位克隆任务依然艰巨(姚国新 和卢磊，安徽农业科学，2007，35 07) =8468-8478)。当前，已经定位的粒重数量性状位点多达89个，分布于水稻的所有12条染色体上 (玛丽莲，中国农业科学院，硕士学位论文，2007)。徐建龙等(中国水稻科学，2002，16(3) 6-10)应用292个Lemont/特青的重组自交系(RILs)检测到影响千粒重的11个作物数量性 状位点(quantitativetraitlocus，QTL)，分别位于第1、2、3、4、5、10和12染色体上，联合贡 献率为53.9%。林荔辉和吴为人(分子植物育种，2003(1) =337-342)利用以两个釉稻品种 H359和Acc8558为亲本杂交建立的重组自交系群体检测到16个与粒重有关的QTL，可解释 81. 40%的表型变异，分布在8条不同的染色体上，其中有5个分布在第3染色体上。美国康 奈尔大学选用热带粳稻品种为轮回亲本，与普通野生稻材料配制组合，构建了 353个株系 组成的BCZF2 2群体，在千粒重性状上检测到8个QTL，其中位于水稻第3染色体的近中心 粒区间的gw3. 1表现最稳定，贡献率也较高(Li et al，Genetics 2004，168 :2187-2195)。Li et al(Genetics 1997，145 :453-465)、Guo LB等(plant breeding 2005，124 :127-132) 和 Ishimaru(Plant Physiology 2003，133 :1083-1090)等利用不同的遗传群体也将一个 粒重QTL定位在第6染色体上。虽然已经定位的粒重QTL有89个，但是能够将粒重基因精细定位的很少。根据现 有文献，关于粒重基因的精细定位仅有gw3. 1 (Li et al,Genetics 2004，168 :2187-2195)、 Lk-4 (t) (ZHOU LQ et al, Acta Genet Sin, 2006, 33 :72-79) > gw8. 1 (Xie et al, Theor Appl Genet，2006，113 :885-894)、GS3 (FAN CC et al, Theor Appl Genel，2006，12 (6) 1164-1171)和 GW2 (XIAN-JUN S et al, Nature Genetic，2007，39 :623-630)。克隆的粒重 基因仅有 GS3 粒长(FAN CC et al, Theor Appl Genel，2006，12 (6) :1164-1171)禾口 GW2 粒 宽(XIAN-JUN S et al, Nature Genetic, 2007, 39 :623-630)基因。所以精细定位和克隆更 多的粒重基因成为当前提高水稻产量的重要工作。
发明内容
发明人在已完成的水稻全基因组测序的基础上，克隆了 517个基因，并分别进行 转基因验证其功能，通过与对照组比较，发现转化了 BGIoslOl基因的转基因植株所产谷粒 明显比对照组大，即转基因植株的千粒重大大提高了。由此初步验证了 BGIoslOl基因是与 控制颗粒大小的数量性状相关的功能基因，完成了本发明。具体地，本发明包括以下几方面本发明的一个方面涉及一种具有促进植物籽粒变大功能的核苷酸序列，所述核苷 酸序列含有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，即BGIoslOl基因，所述基因的序列如下ATGTTGCAGCGGAACTTCCGCGAGGGTGGAGGTGAAGATGGTGCAGGGGAGATGGAGGGTTGTGATGCA GAAAAGAAGCCCCGGATGCCACACATGTTCTGCAAAACTCTCACAGCATCTGATACAAGCACCCATGGAGGTTTCTC TGTTCCTCGCCGGGCTGCAGAGGACTGTTTCCCACCTTTGGACTATAAGACAGTTAGACCTTCTCAAGAGCTGATTG CCGTGGACTTACATGGCACACAATGGAAGTTCAGGCATATTTATAGAGGCCAGCCTCGTAGGCATCTTCTAACGATT GGATGGAGCTCATTTGTCAATAGGAAAAAACTAGTCTCAGGGGATGCTGTCTTGTTTCTTAGAGGTGATGATGGCCA ACTAAGATTGGGTGTAAGGAGAGCAGTTCAACTTAGAAATGAGGCCCTCTTTGAACCTGTCAACAGCAGCGATTCAA AGCTACGCATTCTATCTTCTGTTGCCAGTTCCTTGGAAAATAAAAGTGTTTTCCACATTTGTTTCAACCCAAGGAGT GGTGCGTCAGAATTCATTGTACCGTATTGGAGATTATTGAAGAGCCTGAACCATCCATTTTCCATTGGAATGAGGTT CAGAGTTTGCTATGAGAGTGAAGATGCTAATGAGAGGTCCGCTGGATTAATTTCAGGCATTAGTGAAGTTGACCCCA TAAGATGGCCTGGATCAAGATGGAAATGCCTACTGGTAAGATGGGATGATAGTACAGATAGCAGCCACCAAAACAGA GTTTCTCCATGGGAGATCGAGAGAGTTGGTGGCAGTGTCTCGGTTACCCATTCCTTGTCATCTGGGTCTAAGCGAAC CAAATTGCACTTTCCTCAAGGCAGTTTGGATACTCCATTTCTTAATGGAAATGGTCACCCGGACTCCATGGGAACTG AAAATTTCCACAGGGTCTTGCAAGGTCAAGAATTTAGGGGTTCTAGGTCCCATGGTGTTGTATGCTCTGAATCACCT GGTGTACCAAACTTTCAATCTCCTGACAATAGGAGATTTTCTGCTGATATGCGGGGCTACATGATGCCAGCAAGTGG GCCCCCACAGCGGAACACAGAGTTTACTTATCAGCCCATAGGCTTCAGTGAGTCTCTTGGATTCCCAGAGGTCTTGC AAGGTCAAGAAATGTCACAAGTAGTTCCTTTGTTCCGAGGAGCTACTTTTGGCGCTCGTACACAGAATGACAGAGTT GTCTCTGCTAATTCTGTGCATAGATCAGCTGCACAGAGTGGATTGCTAGCTTCAACTCTAGGGCATCCCATCTCGCA GTTTACTCTGTCATCGTCAAAGGTATCTTCTCCCTCGTCGGTTCTGATGTTTAACCAAGCGACAGCTCCAAATCATG AAACAGTAAGCGGAACCAACAACAAAGGTATGCATGTCAGCCAGTTTGCTTCCCAGGAGATGCTCTCAGAAACTGTA
4ACCTGGCCCGGCACACAACGTCAAACGCCGAGCGAAATCACGAGCAACCAGTTCGCCCTGGCGAGAATCCCAGCTCC TCCAAGCGGAGCTGAATCCGGATTGCCCAAGAGGGATGCCGGGAGAAGCAGCTGCAGACTGTTTGGCTTCTCCCTGA CAGGCAACATGCTGGGAGAAGATGGAGAAGGCCTAGATGATGGAGCCATTGAAGCTGGTTGCGAAAACCCGCCCGTG CTGGAGCTGTTTGGGCACAGCCATTCTACTCCCGGTGCTCTTCATGCCCTGTGTGCTGCTGCTCCCCTGGGAATGTG A (SEQ ID NO 1)本发明还涉及与SEQ ID NO 1所示序列互补的核苷酸序列，或其具有促进植物籽 粒变大功能的选自如下的变体1)在高等严紧条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修 饰的核苷酸序列，和3)与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用条件的“严紧性”程度来分类。严紧性 程度可以以例如核酸结合复合物或探针的解链温度(Tm)为依据。例如，“最大严紧性”典 型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性”发生在Tm以下约5_10°C;“中等 严紧性”发生在探针Tm以下约10-20°C ；“低严紧性”发生在Tm以下约20_25°C。作为替 代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或离子强度条件和/或一或多次的严紧性洗 涤为依据。例如，6XSSC =极低严紧性；3XSSC =低至中等严紧性；IXSSC =中等严紧性； 0. 5XSSC =高等严紧性。从功能上说，可以采用最大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一 或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件确定与该探针有约80%或更多序列同 一性的核酸序列。对于要求高选择性的应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如， 选择相对低的盐和/或高温度条件。Sambrook等(Sambr00k，J.等(1989)分子克隆，实验 室手册，Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y.)提供了包括中等严紧性和高等严紧 性在内的杂交条件。为便于说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中度严紧 条件包括用 5XSSC、0. 5% SDS、1. OmM EDTA(ρΗ8· 0)溶液预洗；在 50-65°C下在 5XSSC 中 杂交过夜；随后用含0. SDS的2X、0. 5X和0. 2XSSC在65°C下各洗涤两次20分钟。 本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂 交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在 于杂交温度升高到例如60-65°C或65-70°C。在本发明中，所述在高等严紧条件下与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列杂交的核 苷酸序列，其具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。在本发明中，所述对SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、 缺失、添加修饰的核苷酸序列，是指分别或同时在所述核苷酸序列的5’端和/或3’端，和 /或序列内部进行例如不超过2-45个，或者不超过2-30个，或者不超过3-20个，或者不超 过4-15个，或者不超过5-10个，或者不超过6-8个的分别用逐个连续整数表示的碱基的取 代、缺失、添加修饰。在本发明中，所述对SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列进行如上述一个或多个碱基 的取代、缺失、添加修饰的核苷酸序列具有与SEQ IDNO 1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。通过一种多核苷酸进行说明，其所具有的核苷酸序列例如与SEQ ID NO 1的参考 核苷酸序列至少具95%的“同一性”是指在SEQ ID NO :1的参考核苷酸序列之每100个 核苷酸中，该多核苷酸的核苷酸序列除了含有多达5个核苷酸的不同外，该多核苷酸之核 苷酸序列与参考序列相同。换句话说，为了获得核苷酸序列与参考核苷酸序列至少95%相 同的多核苷酸，参考序列中多达5%的核苷酸可被删除或被另一核苷酸替代；或可将一些 核苷酸插入参考序列中，其中插入的核苷酸可多达参考序列之总核苷酸的5% ；或在一些核 苷酸中，存在删除、插入和替换的组合，其中所述核苷酸多达参考序列之总核苷酸的5%。参 考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’末端位置，或在这些末端位置之间 的任意地方，它们或单独散在于参考序列的核苷酸中，或以一个或多个邻近的组存在于参 考序列中。在本发明中，用于确定序列同一性和序列相似性百分数的算法是例如BLAST和 BLAST 2.0 算法，它们分别描述在 Altschul 等(1977)Nucl. Acid. Res. 25 :3389-3402 和 Altschul等(1990) J. Mol. Biol. 215 :403_410。采用例如文献中所述或者默认参数，BLAST 和BLAST 2.0可以用于确定本发明的核苷酸序列同一性百分数。执行BLAST分析的软件可 以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一 性的核苷酸序列包括与SEQ ID NO :1所公开序列基本同一的多核苷酸序列，例如当采用本 文所述方法(例如采用标准参数的BLAST分析)时，与本发明多核苷酸序列相比含有至少 90%序列同一性、优选至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更高的 序列同一性的那些序列。在本发明中，所述与SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性 的核苷酸序列具有与SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列相同或相似的促植物籽粒变大活性。在本发明中，所述的BGIoslOl基因来源于普通野生稻元江(其种子于2010年9 月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心 (CCTCC)，保藏编号为 CCTCC P201011)。本发明的另一方面涉及一种载体，其特征在于，所述载体含有本发明所述的核苷 酸序列，所述载体可以通过例如将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得到，或者 可以通过人工合成得到。本发明的另一方面涉及一种重组载体，其特征在于所述重组载体含有本发明所述 的核苷酸序列，所述重组载体可以通过将上述核苷酸序列插入克隆载体或表达载体而得 到。适于构建本发明所述重组载体的克隆载体包括但不限于，例如pUC18、pUC19、 pUC118、pUC119、pMD19-T、pMD20-T、pMD18-T Simple Vecter、pMD19_T Simple Vecter 等。适于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，例如pBI121、pl3W4、pGEM等。在本发明的一个实施方案中，所述载体为p6+BGIosl01载体。本发明的另一方面涉及一种含有本发明所述载体的重组细胞，所述重组细胞可以 通过将含有本发明所述的载体转化至宿主细胞而得到。适于构建本发明所述重组细胞的宿主细胞包括但不限于，例如根癌农杆菌细胞LBA4404、EHA105、GV3101 等。在本发明的一个实施方案中，所述重组细胞为重组农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105_p6+BGIosl01。本发明的还一方面涉及一种单子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转 化有本发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染有本发明的重组细胞。本发明的还一方面涉及一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有本 发明的核苷酸序列和/或载体和/或感染本发明的重组细胞。本发明的还一方面涉及本发明的核苷酸序列和/或载体和/或重组细胞用于促进 植物籽粒变大的用途，以及用于制备转基因植物或用于植物育种的用途。本发明的还一方面涉及本发明的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种 的用途。本发明的还一方面涉及一种促进植物籽粒变大的方法，所述方法包括将本发明的 核苷酸序列和/或载体转化入植物，或用本发明的重组细胞感染植物。所述方法包括用本发明的核苷酸序列转化单子叶植物的愈伤组织的步骤。在本发 明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化利用了含有本发明的核苷酸序列的 重组细胞。在本发明的一个实施方案中，所述单子叶植物愈伤组织的转化过程中利用了前 述的重组农杆菌EHA105-p6+BGIoS101。在本发明的一个具体实施方案中，所述单子叶植物 的愈伤组织为水稻愈伤组织，具体地，所述水稻为日本晴。在本发明中，可采用植物基因转化技术将目的基因插入到植物基因组中，包括农 杆菌介导转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、基因枪转化和电穿孔等。本领域周 知，农杆菌介导的基因转化常被用于单子叶植物和双子叶植物的基因转化，但其它转化技 术也可用于本发明所述单子叶植物的基因转化。当然，适于本发明的转化单子叶植物的另 一种方法是粒子轰击(显微金或钨粒子包覆转化的DNA)胚性愈伤组织或胚胎开发。另外， 还可以采用的转化单子叶植物的方法是原生质体转化。基因转化后，采用通用的方法来筛 选和再生整合有表达单元的植株。本发明的还一方面涉及一种产生籽粒变大的转基因植物的方法，所述方法包括以 下步骤1)将本发明的核苷酸序列和/或载体转化入植物愈伤组织，或用本发明的重组细 胞感染植物愈伤组织；2)利用所述愈伤组织再生转基因植物。在本发明中，所述植物优选是单子叶植物，所述单子叶植物包括但不限于水稻、谷 子、小麦、高粱、玉米，特别优选为水稻，所述水稻包括但不限于，中花9、中花10、中花11、台 北309、丹江8号、云稻2号、汕优63、汕优608、丰优22，黔优88、II优416、II优107、II优 128、II优718、准两优527、川农1号、杂0152、皖稻88、皖稻90、皖稻92、皖稻94、皖稻96、 皖稻185、皖稻187、皖稻189、皖稻191、皖稻193、皖稻195、皖稻197、皖稻199、皖稻201、皖 稻203、皖稻205、皖稻207，以及津原101 (上述水稻品种均可购自安徽徽商农家福有限公 司)。在本发明的一个实施方案中，所述水稻为日本晴。在本发明中，所述籽粒变大是指在饱满程度相当的情况下，籽粒体积变大，千粒重 增加。
7
在本发明的一个实施方案中，发明人从水稻元江中扩增得到基因BGIoslOl，将该 基因重组入新构建的p6载体中得到含有该基因的重组表达载体，转化根癌农杆菌，利用重 组农杆菌转化水稻愈伤组织，通过水稻愈伤组织的GUS染色、转基因小苗根、叶GUS染色及 转基因水稻籽粒的性状观察，并与未转入BGIoslOl基因的组织或植物对比，证明BGIoslOl 基因能够促进植物籽粒变大。发明的有益效果本发明利用高通量测序技术，通过基因的遗传转化，挖掘出促进籽粒变大的 BGIoslOl基因，所述基因能够大大提高转基因植物的千粒重，证明了 BGIoslOl基因是与控 制水稻颗粒大小的数量性状相关的功能基因，这将有利于在分子水平上更深入探讨该性状 形成的生理机理和机制，达到对产量和品质的合理调控作用，对水稻的遗传育种产生重大 的意义。关于牛物材料保藏的说明本发明涉及以下生物材料普通野生稻元江种子，其于2010年9月6日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉 大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC P201011。
图1ρ6载体示意图。图2经转化的水稻愈伤组织的⑶S染色结果。其中，由带有本发明所述BGIoslOl 基因的重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101转化的水稻愈伤组织(右)经⑶S染色后呈 现蓝色；不带有本发明BGIoslOl基因的重组根癌农杆菌EHA105-p6质粒的水稻愈伤组织 (对照，左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图3经转化的转基因水稻苗的根的⑶S染色结果。其中，经含有p6+BGIosl01重 组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(图3右)、经染色后呈现蓝色，阴性对照(图 3左)经⑶S染色后颜色未发生变化。图4转基因水稻的籽粒观察。其中，经含有p6+BGIosl01重组载体的根癌农杆菌 介导转化的水稻籽粒(图4右)与阴性对照(图4左)相比，籽粒更大。
具体实施例方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市购获得的常规产品。实施例1 BGIoslOl基因的PCR扩增和pMD18_T+BGIosl01重组载体的构建PCR 扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目录 号DP320-(^)提取普通野生稻元江(Oryza. rifupongon Yuanjiang)的基因组DNA，根据该 基因在gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩增引物(上游引物Fl，加限制性 酶切位点KpnI和保护碱基，下游引物R1，加限制性酶切位点BamHI和保护碱基)。以上述提取的元江的gDNA为模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表
1所示。
表1目的基因扩增的PCR体系
组成体积(μ )
基因组DNA0. 2
dNTPs(2. 5mM)2
IOXEx Buffer (含镁离子)2. 5
引物 Fl (50 μ M)1
引物 Rl (50 μ Μ)1
Ex taq0. 2
(MH2O补充至总体积25 μ 1
PCR扩增程序为94°C预变性5min，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸
90s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7min。其中，上游引物Fl :GCGGTACCGAGATGTTGCAGCGGAACTT (SEQ ID NO :2)，含 KpnI 酶切 位点。下游引物 Rl GCGGATCCGTACTGCAGCAGCATCACAT (SEQ ID NO 3)，含 BamHI 酶切位点。PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离，得到大小为1760bp左右的条带，使用 TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209-03)进行纯化回收。pMD18-T+BGIosl01 重组载体的构建将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大 肠杆菌，挑取阳性克隆测序，证明准确。其中，T/A克隆的连接条件如下T/A 连接体系 10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I 5μ 1PCR扩增产物(回收插入片段)10-20ng，根据其浓度定ddH20补齐至 10 μ 1于16 °C在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接他以上，得到 pMD18-T+BGIosl01重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯化 钙法制备的感受态细胞100μ 1 DH5a (中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从例 如上海生工购得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的连接产物，即pMD18-T+BGIosl01 重组载体，轻轻搅勻，冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C预冷的SOC培 养基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37°C 220rpm复苏45min， 8000rpm离心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重悬沉淀后的混合物，轻轻吹 勻，玻璃珠涂布LB(加卡那霉素，Kan)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版， 科学出版社)，37°C倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+BGIosl01克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5a -BGIoslOl。深圳华大基因科技有限公司对pMD18-T+BGIosl01克隆载体中 的BGIoslOl进行测序，测序结果与SEQ ID NO :1—致。表明获得的pMD18_T+BGIosl01克 隆载体中BGIoslOl基因序列正确。实施例2 p6重组载体的构建1)玉米WDiquitin启动子片段的PCR扩增和pMD18_T+Ubi重组载体的构建Ubi启动子PCR扩增使用植物基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN新型植物基因组DNA提取试剂盒，目 录号DP320-02)提取玉米品种 B73(ka mays mays cv. B73)的基因组 DNA (http://www. maizegdb. org/)，根据该启动子在玉米B73 gDNA中的序列，分别在首尾设计一对PCR特 异性扩增引物(上游引物 F2 GGCTGCAGTGCAGCGTGACCCGGTCGT(SEQ ID NO :4)，力口限制性 酶切位点 Pst I 和保护碱基，下游引物 R2 :GGCTGCAGAAGTAACACCAAAC (SEQ ID NO :5)，力口 限制性酶切位点I3St I和保护碱基)。以上述提取的玉米B73的gDNA为模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表2所示。
0089]表2 Ubi启动子扩增的PCR体系0090]0091]组成体积(μ )0092]0093]基因组DNA0. 20094]dNTPs(2. 5mM)20095]IOXEx Buffer (含镁离子)2. 50096]引物 F2(50yM)10097]引物 R2 (50 μ Μ)10098]Ex taq0. 20099](MH2O补齐至25 μ 10100]0101]PCR扩增程序为94°C预变性5min，然后以94°C变性45s，55°C退火50s，72°C延伸
90s，进行35个反应循环，最后72°C延伸7min。PCR扩增产物经1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离后，使用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收 试剂盒(目录号:DP209-03)纯化回收。pMD18~T+Ubi重组载体的构建将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大 肠杆菌，挑取阳性克隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。其中，T/A克隆的连接条件如下T/A 连接体系10 μ 1pMD18-T1 μ 12 X solution I5μ 1PCR扩增产物10-20ng，根据其浓度定ddH20补齐至 10 μ 1于16 °C在节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接他以上，得到pMD18-T+Mhi重组载体。将经过上述连接后的产物按照如下方法转化大肠杆菌从超低温冰箱中取出按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)所示氯 化钙法制备的感受态细胞100μ 1 DH5a (中国科学院昆明动物研究所董杨提供；或者可从 例如上海生工购得)，冰上融化后，加入10 μ 1如上所得的连接产物，即pMD18-T+Ubi重 组载体，轻轻搅勻，冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，加入600 μ 1 4°C预冷的SOC培养 基(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)，37°C 220rpm复苏45min， 8000rpm离心30s，去上清，留取150 μ 1，用剩下的150 μ 1上清重悬沉淀后的混合物，轻轻 吹勻，玻璃珠涂布LB(卡那霉素)平板(具体配方详见《分子克隆实验指南》，第三版，科学 出版社)，37°C倒置培养16-24h。获得含有pMD18-T+Ubi克隆载体的重组大肠杆菌，命名为 DH5a -Ubi02)pCAMBIA-1301+Ubi 重组载体的构建按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号DP103_03)的操作手册，从步骤1)构 建的转化有启动子W^i的大肠杆菌DH5a-Ubi中提取带有玉米W^i启动子序列的克隆载体 pMD18-T+Ubi ；纯化后用相应的限制性内切酶I3St I (NEB)进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖 凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209-03)回收相应的启动子片段。同时用限制性内切酶I3St I酶切pCAMBIA-1301质粒(中国科学院昆明动物研究 所董杨提供；或者可从例如上海国瑞基因科技有限公司购得，该公司的pCAMBIA-1301质粒 白勺帛女台JfeiJIiThe CAMBIA Bios (biological open source) Licensee，Australia)酶切体系50 μ 1ddH2034. 9 μ 110*buffer 35μ 1Pst I0. 1 μ I(IOU)克隆载体pMD18-T+Ubi 或 pCAMBIA-1301 质粒 10 μ 1 ( < 1000ng)将回收的启动子片段W^i与回收的载体片段根据T4连接酶(TaKaRa，D2011A)操 作说明，按照如下条件进行连接连接体系10 μ 110ΧΤ4 buffer1 μ 1回收的 pCAMBIA-1301 质粒 1 μ 1 (20ng)回收的启动子W^i插入片段 10-20ng，根据其浓度定ddH20补齐至 9. 5μ1Τ4 ligase (TaKaRa, D2011A) 0. 5 μ 1于16°C节能型智能恒温槽(宁波新芝，SDC-6)中连接他以上。将100 μ 1氯化钙法制得的感受态细胞DH5 α从超低温冰箱取出，冰上融化后，加 入10 μ 1上面的连接产物，轻轻搅勻，冰浴30min，42°C热激60s，冰浴5min，加入600μ 1 4°C预冷的S0C，37°C下220rpm复苏45min，8000rpm离心30s，去上清，留取150 μ 1，轻轻吹 勻，玻璃珠涂布LB(Kan)，37 °C倒置培养16_24h。得到重组载体pCAMB IA-1301+Ub i。分别以F2和R2为引物对所得重组载体pCAMBIA-1301+Ubi进行PCR检测，以确证 所得重组载体pCAMBIA-1301+WDi中含有所需启动子Ubi0 3) NOS终止子的PCR扩增和pMD18_T+N0S重组载体的构建
11
根据pCAMBIA-1301质粒中NOS终止子的序列，分别在首尾设计一对PCR特异性扩 增引物(上游引物 F3 GGGAGCTCGAATTTCCCCGATCGTTCAA (SEQ ID NO 6),加限制性酶切位 点 c I 和保护碱基，下游引物 R3 GGGAATTCCCGATCTAGTAACATAGAT (SEQ ID NO 7)，加限 制性酶切位点EcoR I和保护碱基)。以上述提取的pCAMBIA-1301质粒为模板，高保真Ex Taq (TaKaRa, DRR100B)聚合酶进行PCR扩增。如表3所示。表3 NOS终止子扩增的PCR体系_组成 体积(μ )--- 基因组DNA 0. 2 dNTPs (2. 5mM) 2IOXEx Buffer (含镁离子) 2. 5 引物 F3(50yM) 1
引物 R3 (50 μ Μ) 1Ex taq 0. 2
ddH20 补齐至25 μ 1_将上述得到的PCR扩增产物进行T/A克隆(pMD18-T质粒，TaKaRa，D103A)，转化大 肠杆菌，获得含有PMD18-T+N0S克隆载体的重组大肠杆菌，命名为DH5 α -NOS0挑取阳性克 隆由深圳华大基因科技有限公司测序，证明准确。4)pCAMBIA-1301+Ubi+N0S 即 p6 重组载体的构建按照TIANGEN普通质粒小提试剂盒(目录号DP103_03)的操作手册，提取步骤3) 构建的克隆载体PMD18-T+N0S ；纯化后用相应的限制性内切酶Me I (NEB)和EcoR I (NEB) 进行酶切，然后用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(目录号DP209_03)回收相应的NOS 终止子片段。同时用限制性内切酶Me I和EcoR I酶切pCAMBIA-1301+Ubi质粒并回收。酶切体系50 μ 1ddH2034. 9 μ 110*buffer 15 μ 1Sac I0. 1 μ 1 (IOU)EcoRI0.1 μ I(IOU) 载体 pMD18-T+N0S 或 pCAMBIA-1301+Ubi 质粒 10 μ 1 ( < IOOOng) 将回收的终止子片段NOS与回收的载体片段用T4连接酶进行连接，转化感受态细 胞DH5 α得到重组载体pCAMBIA-1301+Ubi+NOS，即p6 (参见图1)。实施例3 p6+BGIosl01重组载体的构建提取pMD18_T+BGIosl01质粒，并用限制性内切酶KpnI/BamHI酶切后回收 BGIoslOl基因片段，同时提取p6质粒，并用相应的限制性内切酶KpnI/BamHI酶切后回收大 片段，将回收产物进行连接，随后转化感受态细胞DH5 α得到重组载体p6+BGIosl01。筛选 阳性克隆进行PCR检测后测序确定。实施例4重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIosl01细胞的制备
将如实施例3所述方法构建的p6+BGIosl01重组载体质粒，转化按照《分子克隆实验指南》(第三版，科学出版社)中所述氯化钙方法制备的根癌农杆菌EHA105感受态细胞， 具体方法如下将根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)感受态细胞EHA105 (根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)EHA105 已在申请号为 200910238992. O、发明名称为“一种 启动子BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开， 保藏编号为CCTCC M 209315)于超低温冰箱中取出，至于冰上解冻。融化后，加入5μ1的 p6+BGIosl01重组载体，轻轻混勻，冰浴lOmin，放入液氮中冷冻5min，37°C解冻5min，加 入800 μ 1常温的LB液体培养基，28°C 160rpm复苏3h，8000rpm离心30s，吸去上清，留下 200 μ 1吹勻，涂布于加有kan-rif (卡那霉素-利福平)双抗的YM培养基平板上(50mg/l Kan, 10mg/l Rif，具体配方参见表4)。28°C倒置培养2_3天。以Fl和Rl为引物进行PCR检测和通过Kpn I/BamHI酶切筛选转化子。PCR扩增 出约1760bp左右条带和酶切出约1760bp左右条带的为重组载体p6+BGIosl01的重组根癌 农杆菌。本发明中，按照如上述方法得到的带有重组载体p6+BGIosl01的重组农杆菌，命 名为重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101 ；同时设立带有空载体p6的重组根癌农杆菌，即 EHA105-p6作为本发明的阴性对照，用于后续实验。实施例5水稻愈伤组织的诱导和转化按照如下步骤诱导水稻愈伤组织，并分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101 转化所述愈伤组织。1)将水稻日本晴种子(已在申请号为200910238992. O、发明名称为“一种启动子 BgIosP587、其制备方法及用途”的发明申请中保藏，并于2010年9月22日公开，保藏编号为 CCTCC P200910)去壳，70%乙醇表面消毒30s，然后用有效氯1. 5%的次氯酸钠消毒30min， 期间剧烈摇动，消毒后用灭菌水清洗5次；将消毒后的种子置于N6D培养基(具体配方参见 表4)上，用封口膜封口 ；29. 5°C光照培养3-4周；2)选取活跃生长的愈伤组织(黄白色，干燥，直径l_3mm)，在新N6D培养基上 29. 5°C光照培养3天；3)分别挑取如实施例4所构建的重组根癌农杆菌单菌落(重组根癌农杆菌 EHA105-p6+BGIosl01)，于添加抗生素(50mg/l Kan，1 Omg/IRif)的YM培养基(具体配方参 见表5、表6)上划线培养3天，培养温度28°C ；分别刮取上述重组根癌农杆菌置于添加了 30 μ 1 IOOmM的AS (Acetosyringone，乙酰丁香酮)的30ml AAM培养基(具体配方参见表 7)中，温和重悬所述重组根癌农杆菌细胞(重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101)；4)将继代培养的愈伤组织置于灭菌培养皿中；将如步骤3)制备的重组根癌农杆 菌悬液倒入培养皿中，将愈伤组织浸入其中15min ；5)倒掉重组根癌农杆菌悬液，将愈伤组织用灭菌吸水纸吸掉多余的液体；于 N6-AS培养基(配方参见表8)上放一张灭菌滤纸，加Iml如上述含AS的AAM培养基，将愈 伤组织转移至滤纸上；密封培养皿，28°C暗培养48-60h ；6)将受感染的愈伤组织置于50ml灭菌管中，用灭菌水摇动清洗，直至上清液变 澄清；将愈伤组织浸泡于含500mg/l羧苄青霉素(Carb)的无菌水中以杀死重组根癌农杆菌；用灭菌吸水纸除去愈伤组织上多余的水分，然后将其转移至含lmg/1潮霉素B(HmB)和 50mg/l Carb的N6-AS培养基上；用封口膜密封培养皿，29. 5°C光照培养3_4周。实施例6水稻愈伤组织中的⑶S的表达为检测经过实施例5所述转化的水稻愈伤组织中目的基因⑶S的表达情况，按照 Chen S Y 等在 Journal of Integrative Plant Biology, 2008, 50 (6) :742_751 所述的方 法，对分别用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101转化的水稻愈伤组织进行染色。GUS 染色液的配方(Iml) :610μ1 0. 2Μ Na2HPO4 溶液(ρΗ = 7. 0) ；390 μ 1 0. 2Μ NaH2PO4 溶液和 10 μ 1 0. IM X-gluc。将用重组根癌农杆菌EHA105-p6+BGIoS101转化的水稻愈伤组织浸泡在⑶S染色 液中，37°C保温至出现蓝色，拍照记录，结果如图2所示，含有p6+BGIosl01重组载体的根癌 农杆菌介导转化的水稻愈伤组织(图2右)经染色后呈现蓝色，阴性对照(图2左)经⑶S 染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明p6+BGIOS101转入水稻愈伤组织。实施例7 转基因水稻苗中⑶S的表达将实施例5中得到的愈伤组织转移至含50mg/l潮霉素B (HmB)的MS-R分化培养 基(具体配方见表9)分化苗；用封口膜密封培养皿，29. 5°C光照培养3-4周；待幼苗长至 3-4cm时转移到含50mg/l潮霉素B(HmB)的1/2MS生根培养基(具体配方参见表10)进行 生根筛选。转基因水稻苗的GUS染色过程同实施例6中愈伤组织的染色过程。结果如图3 所示，经含有p6+BGIosl01重组载体的根癌农杆菌介导转化的水稻苗的根(图3右)、叶经 染色后呈现蓝色，阴性对照(图3左)经⑶S染色后颜色未发生变化。结果显示，本发明 p6+BGIosl01转入水稻苗中。实施例8 转基因水稻籽粒的性状观察待实施例7的转基因水稻幼苗和对照幼苗在培养基中生长20天后，平行条件移栽 入大田，平行条件培养，直至收获籽粒。转基因水稻性状观察了 28株，阴性对照组观察了 28 株，结果显示转基因水稻的籽粒饱满，且其中24株的籽粒均比对照大(参见图4，其中右侧 为含有BGIoslOl基因的转基因水稻籽粒，左侧为阴性对照)。本发明实施例中所使用的相关培养基配方说明如下
以下有关培养基中所称的“常规灭菌”是指如下条件的灭菌121下蒸气灭菌 20mino表4N6D培养基
权利要求
1.一种具有促进植物籽粒变大功能的核苷酸序列，所述核苷酸序列含有SEQ ID NO 1 所示的核苷酸序列或与其互补的核苷酸序列，或其具有促进植物籽粒变大功能的选自如下 的变体1)在高等严紧条件下与SEQID NO :1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，2)对SEQID NO :1所示的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、添加修饰的 核苷酸序列，和3)与SEQID NO :1所示的核苷酸序列具有至少90%的序列同一性的核苷酸序列。
2.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求1所述的核苷酸序列，例如所述载体 为 p6+BGIosl01 载体。
3.一种含有权利要求2所述载体的重组细胞，例如所述重组细胞为重组农杆菌 EHA105-p6+BGIosl01o
4.一种单子叶植物愈伤组织，其特征在于，所述愈伤组织转化有权利要求1的核苷酸 序列和/或权利要求2的载体和/或感染有权利要求3的重组细胞；具体地，所述单子叶植 物为水稻、谷子、小麦、高粱、玉米；更具体地，所述单子叶植物为水稻，例如为日本晴。
5.一种转基因植物，其特征在于，所述转基因植物转化有权利要求1的核苷酸序列和 /或权利要求2的载体和/或感染有权利要求3的重组细胞；具体地，所述植物为单子叶植 物，特别是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米；更具体地，所述单子叶植物为水稻，例如为日本晴。
6.权利要求1的核苷酸序列和/或权利要求2的载体和/或权利要求3的重组细胞 用于促进植物籽粒变大的用途；所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高 粱、玉米，特别优选是水稻，例如为日本晴。
7.权利要求1的核苷酸序列和/或权利要求2的载体和/或权利要求3的重组细胞用 于制备转基因植物或用于植物育种的用途；所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷 子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻，例如为日本晴。
8.权利要求4的愈伤组织用于制备转基因植物或用于植物育种的用途；所述植物优选 是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻，例如为日本晴。
9.一种促进植物籽粒变大的方法，所述方法包括将权利要求1的核苷酸序列和/或权 利要求2的载体转化入植物，或用权利要求3的重组细胞感染植物；所述植物优选是单子叶 植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻，例如为日本晴。
10.一种产生籽粒变大的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤1)将权利要求1的核苷酸序列和/或权利要求2的载体转化入植物愈伤组织，或用权 利要求3的重组细胞感染植物愈伤组织；2)利用所述愈伤组织再生转基因植物；所述植物优选是单子叶植物，更优选是水稻、谷子、小麦、高粱、玉米，特别优选是水稻， 例如为日本晴。
全文摘要
本发明涉及BGIos101基因及其用途。本发明的BGIos101基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列，或其具有促进植物籽粒变大功能的变体。本发明还涉及转化有BGIos101基因或其变体的转基因植物。本发明还涉及所述BGIos101基因或其变体用于促进植物籽粒变大的用途以及促进植物籽粒变大的方法。
文档编号C12N5/10GK102127537SQ201010565829
公开日2011年7月20日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者倪雪梅, 全志武, 夏秋菊, 杨爽 申请人:深圳华大基因科技有限公司