专利名称：一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方 法。
背景技术：
饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物的耐药性的产生。由 于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临重大挑战。面向未来，必须开拓全新路 径。溶菌酶是被认为替代抗生素的最有前途的产品。它是一种具有杀菌和免疫功能的无毒 蛋白质。它可选择性地分解微生物细胞壁的同时不破坏其他组织，且本身无毒无害，因而它 是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于饲料加工、医学、食品工业、畜 牧业、啤酒工业、水产养殖等领域；可替代抗生素在饲料中应用，具有庞大的市场。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有 限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。另一方面，溶菌酶只能破坏G+细菌的细 胞壁，而对G-细菌作用不大，原因在于G+细菌与G-细菌结构差别和细胞壁中肽聚糖含量 不同G+细菌细胞壁几乎全部由肽聚糖组成，而G-细菌内壁层为肽聚糖，外面还有一层脂 多糖和脂蛋白保护膜，阻止了溶菌酶分子进入内层。杀菌谱太窄，活性较低和不能进行大规 模工业化生产制约了溶菌酶应用。因此，面向未来，必须开拓全新路径。海洋环境独特，其高压、高盐、低营养、低温的特点，这种生命活动的极端环境环境 造就了微生物种类及代谢途径特异性，可产生完全不同于陆地微生物的新颖生物活性物 质。海洋微生物将是今后获得新的医用、农用抗菌素的重要资源。近年来，借助于海洋生物高新技术手段，海洋酶研究得到了快速发展而成为各国 优先发展的新领域。而就酶蛋白合成的调控而言，海洋微生物生长环境所起的作用是巨大 的，从"有实际或潜在用途或价值"的观点看，海洋微生物是一类种类繁多的可再生的遗 传基因库，是获取新型酶的重要资源。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。海洋链霉菌菌株是从近海污泥中分离纯化获得的，该菌株最适生长温度为观 300C，最适pH值为6 7，最适生长NaCl浓度为3 7%。本发明方法的具体步骤为步骤(1)发酵菌种的准备取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养 基中，在观 30°C条件下培养96 120小时，选取单菌落作为种子液菌种；固体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉0. 1 0. 5%,NaCl 3 4%、MgS04,0. 01 0. 05%、 KH2PO4O 0. 5%、KNO3O 0. 2%、FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 1%、CuS040. 002 0. 01%、琼脂 粉2 3 %，余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6. 5 7. 0，最后在115 121°C条件下灭菌15 20分钟，冷却至常温，得到固体培养基。步骤( 制备海洋链霉菌的种子液将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养 基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1 3 100，容器置于转速为140 200转/分钟的摇床中，在观 30°C条件下培养36 48小时，培养至对数生长期，制成细 菌浓度为IO8 IO9CfVL(colony forming units，指每升发酵液中含有的细菌群落总数) 的种子液；液体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉0. 1 0. 5%,NaCl 3 4%、MgS04,0. 01 0. 05%、 KH2PO4O 0. 5%、KNO3O 0. 2%、FeSO4. 7Η20 0. 01 0. 1%、CuS040. 002 0. 01%、余量 为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6. 5 7. 0，最后在115 121 °C条件 下灭菌15 20分钟得到液体培养基。步骤( 将种子液进行放大发酵取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基 中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1 3 100，发酵罐中搅拌器的转速为140 200 转/分钟，在观 30°C条件下培养60 72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度 为IO8 109cfu/L (colony forming units，指每升发酵液中含有的细菌群落总数)。发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤 液通过超滤浓缩截流分子量10 30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓 缩液；将浓缩液置于kphedex G-50层析柱中，再用pH值为6. 5 7. 0、摩尔浓度为0. 1 0. 5M的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0. 1 0. 3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液， 冷冻干燥后获得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Millipore超滤膜。本发明方法制备的溶菌酶的理化性质如下分子量为16800道尔顿，等电点为 9. 2，最适温度为45°C，最适pH值为7，其化学性质非常稳定，pH值在2 11剧烈变化时， 结构仍稳定不变。遇热也很稳定，在PH值6 8，100°C处理lmin，仍保持原酶活性。在碱 性环境中对热稳定性较差。其一级结构由136个氨基酸组成，维持其结构的主要作用力为 二硫键、氢键和疏水键。本发明方法制备的溶菌酶具有安全、广谱、高效等特性。在饲料加工、医学、食品工 业、畜牧业、啤酒工业、水产养殖等领域有广泛应用前景。该产自链霉菌的溶菌酶具有高活 性(酶活比目前市售的蛋清溶菌高10倍)和比蛋清溶菌酶更宽的抑菌谱(能杀灭蛋清溶 菌酶不能杀灭的大肠杆菌(Escherichia coli)、伤寒沙门氏菌(Salmonella)等革兰氏阴 性菌等革兰氏阴性菌)的特点。本发明方法用陶瓷膜微滤串连切向超滤浓缩工艺，将分离和浓缩同步进行，显著 缩短了浓缩时间和生产周期，降低了能耗和生产成本，提高了酶比活与产出效益，具有传统 工艺无法比拟的优势，适合于产业化生产。
具体实施例方式从近海污泥中分离纯化获得海洋链霉菌菌株，该菌株最适生长温度为观 30°C， 最适PH值为6 7，最适生长NaCl浓度为3 7%。利用该链霉菌菌株发酵制备溶菌酶。实施例1
步骤(1)发酵菌种的准备取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养 基中，在条件下恒温培养120小时，选取单菌落作为种子液菌种。固体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4I %、甘油 2%、酵母粉 0.5%、NaC14 %、MgSO4,0. 02 KNO3O. 2%, FeSO4. 7H20 0. 05%,CuS040. 008%、琼脂粉2%，余量为人工海水；然后用NaOH将基液的pH值调至7. 0， 最后在121°C条件下灭菌15分钟，冷却至常温，得到固体培养基。步骤( 制备海洋链霉菌的种子液将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养 基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1 100，容器置于转速为140转/分 钟的摇床中，在条件下恒温培养48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为IO8Cfu/ L的种子液。液体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4I %、甘油 2%、酵母粉 0.5%、NaC14 %、MgSO4,0. 02 KNO3O. 2%, FeSO4. 7H20 0. 05%, CuS040. 008%，余量为人工海水；然后用NaOH将基液的pH值调至7.0，最后在 115°C条件下灭菌20分钟得到液体培养基。步骤( 将种子液进行放大发酵取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基 中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为3 100，发酵罐中搅拌器的转速为200转/分钟， 在30°C条件下恒温培养60小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为1. 5 X IO8Cfu/ L。发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体， 滤液通过超滤浓缩截流分子量10 30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得 浓缩液；将浓缩液置于kphedex G-50层析柱中，再用pH值为6. 5、摩尔浓度为0. IM的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0. lml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获 得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Mi 11 ipore超滤膜。实施例2步骤(1)发酵菌种的准备取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养 基中，在30°C条件下恒温培养96小时，选取单菌落作为种子液菌种；固体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (NH4)2S042%、甘油 3%、酵母粉 0.1%, NaCl 3%, MgSO4 0. 01%, KH2PO4O. 3%, FeSO4.7H20 0. 01%,CuS040. 01 %、琼脂粉3%，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6. 5，最 后在115°C条件下灭菌20分钟，冷却至常温，得到固体培养基。步骤( 制备海洋链霉菌的种子液将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养 基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为3 100，容器置于转速为200转/分 钟的摇床中，在30°C条件下恒温培养36小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为IO9Cfu/ L的种子液。液体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (NH4)2S042%、甘油 3%、酵母粉 0.1%, NaCl 3%, MgSO4jO. 01%, KH2PO4O. 3%, FeSO4. 7H20 0. 01%,CuS040. 01 %、琼脂粉3%，余量为人工海水；然后用HCl将基液的pH值调至6. 5，最 后在121°C条件下灭菌15分钟得到液体培养基。步骤( 将种子液进行放大发酵取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1 100，发酵罐中搅拌器的转速为140转/分钟， 在条件下恒温培养72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为108cfu/L。发 酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体， 滤液通过超滤浓缩截流分子量10 30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得 浓缩液；将浓缩液置于kphedex G-50层析柱中，再用pH值为7. 0、摩尔浓度为0. 3M的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0. 2ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获 得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Mi 11 ipore超滤膜。实施例3步骤(1)发酵菌种的准备取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养 基中，在^rc条件下恒温培养loo小时，选取单菌落作为种子液菌种；固体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4L 5%、甘油 4%、酵母粉 0. 3%、NaCl 3. 5 MgSO4jO. 05 KH2PO4O. 5 KNO3O. 1%, FeSO4. 7H20 0.1%, CuS040. 002%、琼脂粉 2. 5%，余量为人工海水；然后用 HCl 将基液的PH值调至6. 8，最后在118°C条件下灭菌18分钟，冷却至常温，得到固体培养基。步骤( 制备海洋链霉菌的种子液将种子液菌种接种于置于容器中的液体培 养基中进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1 50，容器置于转速为160转 /分钟的摇床中，在^TC条件下恒温培养40小时，培养至对数生长期，制成细菌浓度为 1. 5XlO8CfVL的种子液。液体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为 (MM)2SO4L 5%、甘油 4%、酵母粉 0. 3%、NaCl 3. 5 MgSO4jO. 05 KH2PO4O. 5 KNO3O. 1%, FeSO4. 7H20 0.1%, CuS040. 002%、琼脂粉 2. 5%，余量为人工海水；然后用 HCl 将基液的PH值调至6. 8，最后在118°C条件下灭菌18分钟得到液体培养基。步骤( 将种子液进行放大发酵取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基 中，种子液菌种与发酵培养基的重量比为1 50，发酵罐中搅拌器的转速为160转/分钟， 在^TC条件下恒温培养66小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为109cfu/L。发 酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同。步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体， 滤液通过超滤浓缩截流分子量10 30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得 浓缩液；将浓缩液置于kphedex G-50层析柱中，再用pH值为6. 8、摩尔浓度为0. 5M的 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0. 3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻干燥后获 得溶菌酶产品。超滤浓缩采用Mi 11 ipore超滤膜。本发明方法制备的溶菌酶与现有相关产品优势性能比较如下表
权利要求
1. 一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法，其特征在于该方法具体步骤为 步骤(1)发酵菌种的准备取保存在液氮罐中的海洋链霉菌菌种接种于固体培养基 中，在观 30°C条件下培养96 120小时，选取单菌落作为种子液菌种；固体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉 0. 1 0. 5%、NaCl 3 4%、MgSO4,0. 01 0. 05%, KH2PO4O 0. 5%,KNO3O 0. 2%,FeSO4. 7H20 0. 01 0. 1%,CuS040. 002 0. 01%、琼脂粉 2 3%， 余量为人工海水；然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6. 5 7. 0，最后在115 121°C 条件下灭菌15 20分钟，冷却至常温，得到固体培养基；步骤( 制备海洋链霉菌的种子液将种子液菌种接种于置于容器中的液体培养基中 进行培养，种子液菌种与液体培养基的重量比为1 3 100，容器置于转速为140 200 转/分钟的摇床中，在观 30°C条件下培养36 48小时，培养至对数生长期，制成细菌浓 度为IO8 IO9CfVL的种子液；液体培养基的配置方法是首先配置基液，基液中各组分的重量含量为(MM)2SO4I 2%、甘油 2 4%、酵母粉 0. 1 0. 5%、NaCl 3 4%、MgSO4,0. 01 0. 05%, KH2PO4O 0. 5%,KNO3O 0. 2%,FeSO4. 7H20 0. 01 0. 1%,CuS040. 002 0. 01%、余量为人工海水； 然后用NaOH或HCl将基液的pH值调至6. 5 7. 0，最后在115 121°C条件下灭菌15 20分钟得到液体培养基；步骤C3)将种子液进行放大发酵取上述种子液接种置于发酵罐中的发酵培养基中， 种子液菌种与发酵培养基的重量比为1 3 100，发酵罐中搅拌器的转速为140 200转 /分钟，在观 30°C条件下培养60 72小时，培养至对数生长期，发酵液中的细菌浓度为 IO8 109cfu/L ；发酵培养基的配置方法与液体培养基的配置方法相同；步骤(4)发酵液中溶菌酶的分离纯化将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通 过超滤浓缩截流分子量10 30kDa之间的组分，去除色素、杂蛋白和无机盐，获得浓缩液； 将浓缩液置于kphedex G-50层析柱中，再用pH值为6. 5 7. 0、摩尔浓度为0. 1 0. 5M 的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液以0. 1 0. 3ml/min的流速对层析柱进行洗脱，收集洗脱液，冷冻 干燥后获得溶菌酶产品。
全文摘要
本发明涉及一种利用海洋链霉菌发酵制备溶菌酶的方法。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，产量有限。本发明方法首先将海洋链霉菌菌种接种于固体培养基中进行恒温培养，将种子液菌种接种于液体培养基中进行培养，制成种子液；然后将种子液进行放大发酵获得发酵液；将发酵液通过陶瓷膜微滤法除去菌体，滤液通过超滤浓缩截流分子量10～30kDa之间的组分，获得浓缩液，将浓缩液层析纯化并进行洗脱，洗脱液冷冻干燥后获得溶菌酶产品。本发明方法制备的溶菌酶具有安全、广谱、高效等特性。在饲料加工、食品工业、畜牧业、水产养殖等领域有广泛应用前景。本发明方法显著缩短了浓缩时间和生产周期，降低了能耗和生产成本，适合于产业化生产。
文档编号C12R1/465GK102102095SQ20101056892
公开日2011年6月22日 申请日期2010年11月30日 优先权日2010年11月30日
发明者王首锋, 赵小立 申请人:浙江大学