专利名称：黄杆菌胞内酶提取和快速转化甜菊糖为甜茶甙的方法
技术领域：
本发明涉及黄杆菌所产胞内β -葡萄糖苷酶将甜菊糖转化为甜茶甙的方法，特别 是黄杆菌所产胞内酶的制备及使用该酶将甜菊糖转化为甜茶甙的方法。属于生物转化领 域。
背景技术：
甜菊糖是从菊科甜叶菊(份Mia rebaudiana bertoni)中提取的一种天然甜 味剂，含量占甜菊叶干重的 4%-20% (Geuns JMC. Stevioside. Phytochemistry, 2003， 64: 913 - 921.)。我国是世界上最大的甜菊糖生产国，资源量巨大(倪军明，李军平. 甜菊糖工业发展现状与前景.广州食品工业科技，2004，20(3): 156-158.)。甜菊苷 (Stevioside, SS)常态下为白色或微黄色松散粉末或结晶，常温下稳定，甜度约为蔗糖的 300倍，味感与蔗糖相似，热量仅为蔗糖的三分之一，非酵解，热稳定性好，毒性低而且适用 范围广，被称为是继蔗糖、甜菜糖之后的第三种天然糖源(李晓瑜.甜菊糖苷的安全性研究 进展.中国食品添加剂，2003，2: 5-11.)。甜菊糖主要含甜菊苷和莱鲍迪甙A(Rebaudi0Side A，RA)两种成份。RA甜味品质最 好但含量比SS低，SS含量高但其甜味成份有一定的后苦味(Starrat AN, Kirby Cff, Pocs R, Brandle JE. Rebaudioside F, a diterpene glycoside from Stevia rebaudiana. Wiytochemistry，2002, 59: 367 - 370.)。因此许多学者对SS进行了改性研究以期改善 甜菊糖的甜味品质。甜茶甙(Rubusoside，RS)也是一种天然甜味剂，来源于蔷薇科悬钩子属多年生植 物甜茶Oft/tos Mari^i^As),含量占甜茶干叶重的2. 0%左右，化学结构与甜菊苷相似，甜 度是蔗糖的300倍，但热值低、甜度高、耐高温、食用极为安全，对高血压、糖尿病等有一定 的辅助疗效，并能促进新陈代谢，治疗胃酸过多等疾病(何伟平.天然甜味剂-甜茶甙的工 业化试验.广西轻工业，1999，(1): 1-5.)。甜茶主要分布在我国南方丘陵地区，主产广 西，通常生长于海拔500 m-1000 m，所以RS的来源受资源量和产地的限制(梁坚.甜茶的 研究进展.广西医学，2004，26(6): 845 - 847.)。利用甜菊苷特异转化产生甜茶甙，将大 大减少甜茶种植对生态环境的压力，提高甜菊的资源利用率，并为甜菊糖的改性研究提供 一条新的思路。β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)存在于许多植物、昆虫、酵母、霉菌及细菌体内，特 别是植物的种子和微生物中尤为普遍，从黑樱桃、水稻、大豆、木薯作物中纯化出β-葡萄 糖苷酶。对微生物中的葡萄糖苷酶的研究主要在酵母、细菌、真菌、链霉菌等(李远华. β-葡萄糖苷酶的研究进展.安徽农业大学学报，2002，29(4): 421-425.)。β -葡萄糖 苷酶能参与生物体的糖代谢，对维持生物体的正常生理功能起着重要作用，能够水解结合 于底物末端的非还原性β-D-葡糖苷键，释放出β-D-葡萄糖和相应的配基。β-葡萄糖苷 酶的生物学功能使它在生产中有着广泛的应用。如作为食品风味酶应用，另外葡萄糖 苷酶还在青梅脱苦、降解纤维素、水解大豆异黄酮方面有着应用(许晶，张永忠，孙艳梅.β-葡萄糖苷酶的研究进展.食品研究与开发，2005，26 (6) 183-186.)。常见的细胞破壁方式主要有物理法，如冻融法、超声法、高压破碎法等；化学 法，常用化学试剂有表面活性剂、有机溶剂等；生物法(酶法)等(郑雪松，李道棠，杨 虹.不同破壁方法对活性污泥总DNA提取效果的影响.上海交通大学学报，2004，38 (5) 815-818.)。高压破碎细胞的原理是在高压作用下，样品从高压室高速喷出，速度 可达每秒几百米。这种高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管 流出。细胞在这一系列过程中经历了高速剪切、碰撞和空穴效应等，从而造成细胞的破 碎。表面活性剂具有双亲结构，能通过其疏水基团与细胞膜脂质结合，并以其亲水基团与 水互溶，在合适的浓度范围之内能达到较好的破碎效果。胆盐是一类重要的生物表面活 性剂，它能够结合到类脂双层膜中并改变膜的性质。胆盐可分配到泡囊中甚至溶解泡囊， 还能与脂质体作用，在脂质双分子层上形成小孔(王建国，杨薇薇，江黎丽，吕慧，孙 巧花，马勇，姜玉春，臧树.胆酸钠与支撑磷脂双层膜作用的电化学研究.高等学校 化学学报，2007，28(5) :859-861.)。十二烷基硫酸钠SDS、十六烷基三甲基溴代氨CTAB, Triton-IOO分别为阴离子、阳离子、非离子型表面活性剂，这些表面活性剂都能改变细胞膜 表面通透性，从而使细胞内物质溶出。利用黄杆菌所产的胞内β -葡萄糖苷酶对甜菊糖苷的糖基进行选择性切除，使之 结构发生改变，即可获得大量甜茶甙，从而扩大甜茶甙生产的原料来源。因为甜叶菊的产量 比甜茶高得多，且甜叶菊中甜菊苷含量(有的高达15%)比甜茶中甜茶苷含量(3-5%)高，故 利用甜菊苷生产甜茶甙具有重要的应用价值。利用黄杆菌直接对甜菊糖进行转化产生甜茶甙，转化效率较胞内葡萄糖苷酶 低，1%的甜菊糖用菌液进行转化需要72 h才能达到完全转化(陈育如，姜中玉，刘虎. 一种由甜菊糖苷制备甜茶甙的方法.CN101701238A)，而本发明的工作表明，用经分离纯化 的胞内酶转化率4 h即可达到96%，具有高效快速的特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速制备甜茶甙的方法。本发明具体的技术方案包括以下步骤
(1)将黄杆菌活化，得到的活化菌液经4°c、12000r/min离心12 min，弃去上清，收集 菌体，并将菌体用PH4-10缓冲液洗涤两次，然后用少量缓冲液重新悬浮，将重悬菌液冰浴 后采用高压细胞破碎仪或表面活性剂对菌体进行破碎，将破碎后的菌液于4°C、8000 r/min 离心10 min，去除沉淀，上清用pH 7. 0磷酸盐缓冲液定容，即为初始胞内酶液；
(2)取初始胞内液，用pH4-10缓冲液定容至30 mL，加甜菊糖使其溶解制成转化液，对 甜菊苷(SS)进行转化，获得甜茶甙。上述方法中所说的菌体重悬液冰浴时间为0. 05 h，优选0. 5 h。上述方法中所说的高压破碎压力为3000 KPa 15000 KPa，优选5000 KPa 10000 KPa0重复破碎次数为2 10次，优选；Γ6次。当用表面活性剂对细胞进行破碎时，表面活性剂包括胆酸钠、SDS、CTAB, Triton-IOO 等，表面活性剂的添加量为 0. 01°/Tl0%(W/W)，优选 0. 05°/T5%(W/W)。上述方法中所说的破碎细胞后所得胞内酶定容至10 mL 100 mL，优选20 m广50mL作为初始胞内酶液。上述方法中所说的甜菊糖是甜菊苷、莱鲍迪甙A、莱鲍迪甙或它们的混合物。上述方法中所说的转化液是由甜菊糖直接加入经稀释的初始胞内酶液制成。转化 液中甜菊糖的浓度可为0.广10% (W/W)，优选0. 5 6% (W/W)。上述方法中为防止杂菌，可在转化液中添加适量抗生素。所说的抗生素可以是利 福平或青霉素或氯霉素，添加的抗生素溶液的浓度为0.019Γ0. 1%(V/V)，体积为0.01 mL~10mL。上述方法中转化体系中初始胞内酶液的添加量为19Tl00%(V/V)，优选 10% 70%(V/V)。上述方法中转化时间为1 h、8 h ；优选4 1Γ24 h ；转化温度为30°C 60°C，优选 37°C 50°C ；转化体系的pH值为4.0 12.0，优选？!1 6· 0 10· 0。本发明将菌体破碎获得胞内酶液，并将甜菊糖直接加入经稀释的胞内酶液中，通 过加入、利福平、青霉素或其他抗生素抑制杂菌及黄杆菌JH的生长，在适当的温度和pH下 转化，即可获得甜茶甙转化液。将黄杆菌JH经离心破壁后所得胞内酶液作为初始胞内酶液，加入PH4-10的缓冲 液，其中酶液量为40%(V/V)。加入甜菊糖使其在转化液中浓度为1%(W/W)，然后加入0. 05% (W/W)的利福平或其他抗生素后转化。甜菊糖原液组成见图1，经胞内酶液转化4 h后的组 成见图2，转化12 h后的组成见图3，SS转化率的时间曲线见图4。分别制备同样的活化菌 液，分别加入 0. 6% (W/W)胆酸钠，0. 2% (ff/ff) SDS, 1% (ff/ff) CTAB, 1% (ff/ff) Triton-IOO 进行破 壁得酶液，对SS转化的效率见图5所示。将胞内酶进行分离纯化，酶的凝胶电泳图见图6。本发明的优点体现在将甜菊糖经黄杆菌JH CCTCC N0:M209202所产的β -葡萄 糖苷酶转化后得到甜茶甙，解决了甜茶甙制备中原料来源有限的问题，使甜茶甙生产可以 不受地域限制，同时为甜菊糖的利用提供了新的途径，也为SS转变为RA提供了重要中间步 骤与解决方法。由于本发明操作简便，转化效率极高，提取的胞内酶液在15 h转化率可达 100%，如果酶经初步分离纯化后，4 h转化率即可达到96%，转化迅速，具有极强的应用价值。
图1 :1% (ff/ff)甜菊糖转化原液HPLC图
图2 1% (ff/ff)甜菊糖胞内酶转化4 h的HPLC图 图3 1% (ff/ff)甜菊糖胞内酶转化12 h的HPLC图 图4 高压破碎细胞制备的胞内酶转化时间曲线图 图5 不同表面活性剂制备的胞内酶液转化率时间曲线图 图6 胞内酶提取后的凝胶电泳图谱。
具体实施例方式黄杆菌JH的培养
中国
发明者夏文静, 姜中玉, 张玉千, 玄燕, 陈育如 申请人:南京师范大学