一种生物法合成异戊二烯的方法、酶系统和重组细胞及其应用的制作方法

专利名称：一种生物法合成异戊二烯的方法、酶系统和重组细胞及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生产异戊二烯化合物的领域，具体涉及一种利用生物法合成异戊二烯化合物的领域。
背景技术：
异戊二烯又名2-甲基-1，3-丁二烯，是一种共轭二烯烃，分子式(^8。作为一种萜类化合物，异戊二烯为不溶于水的无色液体，但能与乙醇、乙醚、丙酮和苯等溶剂混溶。自身易聚合，也易与别的不饱和化合物共聚合。若在齐格勒-纳塔催化剂下聚合，则会产生聚异戊二烯，即天然橡胶成分，具有优秀的弹性、张力等。少量异戊二烯与异丁烯共聚，会产生丁基橡胶。异戊二烯作为一种非常重要的合成单体，主要用于生产性能接近天然橡胶的聚异戊二烯橡胶，其用量占异戊二烯总产量的95%。其次，还可以用作合成丁基橡胶的一种共聚单体，以改进丁基橡胶的硫化性能，异戊二烯还用于合成树脂、液体聚异戊二烯橡胶等。此外，还用于制造农药、医药、香料及黏结剂等。目前异戊二烯的生产主要通过化学法来进行，主要的合成路线有异戊烷，异戊烯脱氢法，异丁烯-甲醛法，乙炔-丙酮法，丙稀二聚法以及裂解C5馏分萃取蒸馏法等(岳鹏， 2006)。化学法生产异戊二烯的原料主要来源于石油基产品，具有不可再生性，且对环境具有较大的污染性。因此，为这种有价值的化合物的生产提供更有效更绿色的方法将是本技术领域的进步。一种有可能的解决方法是利用生物合成途径来生产异戊二烯。目前已报道的异戊二烯生物合成途径都是通过生物体中存在的两种天然代谢途径，即甲羟戊酸(MVA)途径和甲基赤藓糖-4-磷酸(MEP)途径进行合成的，如Pia Lindberg等利用蓝藻的MEP途径进行异戊二烯的生产，取得了 50微克/克干细胞/天的产率(Pia Lindberg等，2009) ；Genencor 和Goodyear公司利用MVA途径在工程大肠杆菌中进行异戊二烯的生产，取得了最高60g/L 的产量(美国专利公开，2009/0203102)。目前通过MEP途径在工程蓝藻中进行异戊二烯的生物合成只能取得很低的产量， 而在工程大肠杆菌中通过MVA途径进行异戊二烯的生产虽然取得了较高的产物浓度，但是该方法已经申请了专利保护，技术引进需要大量的资金，会使得生产企业产品成本过高，且缺乏核心竞争力，不利于企业长期的健康可持续发展。因此开发不同于以上两种代谢途径， 具有我国自主知识产权的异戊二烯合成新方法，对于我们打破国外技术垄断，摆脱在异戊二烯生物合成领域的被动局面，提高我们在该领域的核心竞争力，促进我国异戊二烯生物合成工业走到健康的可持续的发展道路上来，具有十分重要的意义。

发明内容
本发明提供一种制备异戊二烯的新型方法，即从简单碳源，诸如葡萄糖的简单起始材料开始，在生物体内直接合成2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3- 丁烯-1-醇，再将上述三种醇经过脱水后最终制备成异戊二烯的方法、酶和重组细胞。本发明利用亮氨酸的生物合成途径、亮氨酸降解途径以及甲羟戊酸脱羧途径，构建重组细胞并表达相应酶系统，进行2-甲基-1，4- 丁二醇，3-甲基-1，3- 丁二醇和3-甲基-3- 丁烯-1-醇的生物合成。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯中的应用；以及所制备的异戊二烯。所述的酶系统、重组细胞和方法在制备异戊二烯衍生物的应用。所述的酶系统、重组细胞、方法、异戊二烯、或者衍生物在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物例如异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯一异戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂等。一种合成3-甲基-1，3-丁二醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括氨基转移酶，烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶；所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。一种合成3-甲基-3- 丁烯-1-醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括HMG-CoA 合成酶，HMG-CoA还原酶，甲羟戊酸脱羧酶，所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母，假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。一种同时合成2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇的酶系统或重组细胞，所述酶系统包括乙酰乳酸合成酶，酮酸还原异构酶，二羟酸脱水酶，2-异丙基苹果酸合成酶，3-异丙基苹果酸异构酶，3-异丙基苹果酸脱氢酶，酮异戊酸脱羧酶，醇脱氢酶和P450 单加氧酶，所述重组细胞是通过代谢工程野生型细胞获得的，可表达上述酶的重组细胞，这些野生型细胞为微生物细胞，包括细菌、真菌或酵母菌，例如埃希氏杆菌，芽孢杆菌，酵母， 假单胞菌，链霉菌，曲霉菌等。本发明是在野生菌中过量表达了控制2-甲基-1，4-丁二醇，3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3- 丁烯-1-醇生物合成的一系列关键酶基因，得到的2-甲基-1，4- 丁二醇， 3-甲基-1，3-丁二醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇经脱水后得到异戊二烯。本发明提供的方法，突破了传统采用MEP和MVA途径进行异戊二烯生产的束缚，另辟蹊径，巧妙地利用了宿主细胞产生的代谢中间物进行异戊二烯的生产，是具有开创性的异戊二烯生产新方法。具体的合成途径示意图参见附图1-4。具体内容如下1、一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括通过生物法合成二醇或烯醇和对合成的二醇或烯醇进行脱水以获得异戊二烯的步骤。2、根据以上1所述的方法，其中所述二醇选自2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基_1， 3- 丁二醇，所述烯醇是3-甲基-3- 丁烯-1-醇。3、根据以上1所述的方法，其中所述二醇或烯醇是通过酶系统或通过培养重组细胞生物合成的。4、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且所述3-甲基-1，3- 丁二醇是使用包括氨基转移酶、烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶的酶系统合成的。5、根据以上1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且所述3-甲
6基-3- 丁烯-1-醇是使用包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸脱羧酶的酶系统合成的。6、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基_1， 4- 丁二醇，且所述3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4- 丁二醇是使用包括乙酰乳酸合成酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-异丙基苹果酸合成酶、3-异丙基苹果酸异构酶、
3-异丙基苹果酸脱氢酶、酮异戊酸脱羧酶、醇脱氢酶和P450单加氧酶的酶系统合成的。7、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且通过培养具有生产3-甲基-1，3- 丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3- 丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3-丁二醇的能力的重组细胞表达氨基转移酶基因、烯酰-CoA水解酶基因和醇醛脱氢酶基因，优选地，其中所述氨基转移酶基因是来源于大肠杆菌的ilvE基因，或和ilvE基因同源性超过 70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvE基因没有明显的同源性，但和ilvE基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述烯酰-CoA水解酶基因是来源于I^seudomonas aeruginosa的phajl基因，或和phajl基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和phajl基因没有明显的同源性，但和PhaJl基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述醇醛脱氢酶基因是来源于Clostridium acetobutylicum的adhE基因，或和 adhE基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和adhE基因没有明显的同源性，但和adhE基因具有相同或相似功能的核酸序列。8、根据以上1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且通过培养具有生产3-甲基-3- 丁烯-1-醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-3- 丁烯-1-醇，所述具有生产3-甲基-3- 丁烯-1-醇的能力的重组细胞表达HMG-CoA合成酶基因、HMG-CoA 还原酶基因和甲羟戊酸脱羧酶基因，优选地，其中所述HMG-CoA合成酶基因是来源于Saccharomyces cerevisiae的HMGS基因，或和HMGS基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和HMGS基因没有明显的同源性，但和HMGS基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述HMG-CoA还原酶基因是来源于S. cerevisiae的tHMGR基因，或和tHMGR基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和tHMGR基因没有明显的同源性，但和 tHMGR基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述甲羟戊酸脱羧酶基因是来源于S. cerevisiae的mvdl基因，或和mvdl基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和mvdl基因没有明显的同源性，但具有甲羟戊酸脱羧功能的核酸序列。9、根据以上1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基_1，
4-丁二醇，且使用具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4- 丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞表达乙酰乳酸合成酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟酸脱水酶基因、2-异丙基苹果酸合成酶基因、3-异丙基苹果酸异构酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、酮异戊酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和P450单加氧酶基因，优选地，其中
所述乙酰乳酸合成酶基因是来源于Bacillus subtilis的alsS基因，或和alsS 基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和alsS基因没有明显的同源性， 但和alsS基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述酮酸还原异构酶基因是来源于E. coli的ilvC基因，或和ilvC基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvC基因没有明显的同源性，但和ilvC基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述二羟酸脱水酶基因是来源于E. coli的ilvD基因，或和ilvD基因同源性超过 70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvD基因没有明显的同源性，但和ilvD基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述2-异丙基苹果酸合成酶基因是来源于E. coli的IeuA基因，或和IeuA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和IeuA基因没有明显的同源性，但和 IeuA基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述3-异丙基苹果酸异构酶基因是来源于E. coli的Ieu⑶基因，或和Ieu⑶基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和IeuCD基因没有明显的同源性，但和IeuCD基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述3-异丙基苹果酸脱氢酶基因是来源于E. coli的IeuB基因，或和IeuB基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和IeuB基因没有明显的同源性，但和 IeuB基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述酮异戊酸脱羧酶基因是来源于Lactococcus Iactis的kivd基因，或和kivd 基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和kivd基因没有明显的同源性， 但和kivd基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述醇脱氢酶基因是来源于S. cerevisiae的ADH2基因，或和ADH2基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ADH2基因没有明显的同源性，但和ADH2基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述P450单加氧酶基因是来源于化学合成的P450-BM3-J基因(序列见SEQ ID NO. 1)，或和P450-BM3-J基因同源性超过70 %的核酸序列，或来源于其它生物体，和 P450-BM3-J基因没有明显的同源性，但和P450-BM3-J基因具有相同或相似功能的核酸序列。10、根据以上1-6中任一项所述的方法，其中所述简单碳源包括生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合。11、根据以上7-9中任一项所述的方法，其中所述培养利用简单碳源，优选生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；和/或所述培养优选利用摇瓶或萃取发酵方法来实施；和/或所述重组细胞优选是由微生物，包括酵母菌、真菌和细菌，如埃希氏菌属大肠杆菌(E. coli)、埃希氏杆菌、芽孢杆菌、酵母、假单胞菌、链霉菌、曲霉菌通过基因工程技术构建而成的。12、根据前述以上任一项所述的方法，其中所述脱水包括生物法脱水或化学法脱水，所述化学法脱水优选以Al2O3作为催化剂，在加热的情况下进行。13、一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的酶系统，所述酶系统为在根据以上4-6 中任一项所述的方法中使用的酶系统。
14、一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的重组细胞，所述重组细胞为在根据以上 7-12中任一项所述的方法中使用的重组细胞。15、根据以上1-12中任一项所述的方法、根据以上13所述的酶系统和根据以上14 所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯一异戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物弹性体、集成橡胶、 光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。


图1是利用亮氨酸降解途径生产3-甲基-1，3- 丁二醇的代谢途径示意图。图2是利用甲羟戊酸脱羧途径生产3-甲基-3- 丁烯-1-醇的代谢途径示意图。图3是利用亮氨酸生物合成途径生产2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基_1，3_ 丁二醇的代谢途径示意图。图4是3-甲基-1，3-丁二醇，3-甲基_3_ 丁烯醇和2_甲基_1，4_ 丁二醇脱水生成异戊二烯过程示意图。图5是pISPOl重组质粒的构建流程图。图6是pISP012重组质粒的构建流程图。图7是pISP03重组质粒的构建流程图。图8是pISP21重组质粒的构建流程图。图9是pISP212重组质粒的构建流程图。图10是pISPM重组质粒的构建流程图。图11是pISPll重组质粒的构建流程图。图12是pISPl 12重组质粒的构建流程图。图13是pISP13重组质粒的构建流程图。图14A和图14B分别是3_甲基_1，3- 丁二醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图15A和图15B分别是3_甲基_3_ 丁烯醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图16A和图16B分别是2_甲基_1，4_ 丁二醇标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图17A和图17B分别是异戊二烯标准品通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图18A和图18B分别是E. coli ISP0123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图19A和图19B分别是E. coli ISP2124工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图20A和图20B/图20C分别是E. coli ISPl 123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图21A和图21B分别是E.coli ISP0123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物3-甲基-1，3- 丁二醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS
9测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图22A和图22B分别是E. coli ISP2124工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物3-甲基-3- 丁烯-1-醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS 测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。图23A和图2 分别是E.coli ISP1123工程菌株经过摇瓶或发酵罐培养后所获得的中间产物2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇在氧化铝的催化下加热反应生成的终产物通过GC-MS测定时采集到的总离子流色谱图和质谱图。序列表说明SEQ ID NO. 1是P450-BM3-J基因的核苷酸序列。
具体实施例方式以下将以实施例方式，以工程大肠杆菌生产异戊二烯为例，详细描述本发明实施例1通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达来源于Ε. coli的氨基转移酶基因 (ilvE)，P. aeruginosa 的烯酰-CoA 水解酶基因(phajl)和 C. acetobutylicum 的醇醛脱氢酶基因(adhE)，以利用亮氨酸降解途径来生物合成中间产物3-甲基-1，3-丁二醇，生成的 3-甲基-1，3-丁二醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。1.1外源基因的克隆和表达载体的构建1. 1. 1外源基因的克隆1. 1. 1. 1 E. coli氨基转移酶基因的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取E.coli K-12(购自ATCC，ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物， PCR扩增氨基转移酶基因ilvE，Gene ID :6058370。PCR扩增采用的引物序列如下iIvE-F 5' -CATGCCATGGGCATGACCACGAAGAAAGCTGiIvE-R 5' -CGGGATCCTTATTGATTAACTTGATCTAACPCR反应条件如下94°C预变性3分钟，然后94°C变性30秒，48_58°C退火30秒， 72°C延伸1分钟，以上变性、退火、延伸三步重复进行35个循环后，最后72°C延伸10分钟。 利用胶回收试剂盒(购自i^rmentasCat.No.KOeg〗)回收目的基因片段。1. 1. 1. 2 P. aeruginosa的烯酰-CoA水解酶基因的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤， 提取 P. aeruginosa(Schroeter)Migula(购自 ATCC，ATCC No. 10197)的基因组 DNA，根据 GenBank序列设计引物，PCR扩增烯酰-CoA水解酶基因phajl，GeneID :7176431。PCR扩增采用的引物序列如下phaJl-F 5' -GGAATTCCATATGAGCCAGGTCCAGAACATTCphaJl-R 5' -CACGATATCTTATCAGCCGATGCTGATCGGCGPCR反应条件如1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。1. 1. 1. 3 C. acetobutylicum的醇醛脱氢酶基因的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取 C. acetobutylicum ATCC 824 (ATCC No. 824TM)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增醇醛脱氢酶基因adhE，GeneID :1116040。PCR扩增采用的引物序列如下adhE-F 5' -CATGCCATGGGCATGAAAGTTACAAATCAAAAAGadhE-R 5' -CGGGATCCTTAAAATGATTTTATATAGATATCPCR反应条件如1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。1. 1.2表达载体的构建1. 1. 2. 1 pISPOl 载体的构建将胶回收后的phajl基因与pACYCDuet-Ι载体(购自Novagen)分别用Nde I和 EcoR V进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 6h，连接产物42°C热激转化E. coli DH5 α感受态细胞(购自TaKafci，TaKafci Code D9057)， 然后涂布加有34μ g · mL—1氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为 PhaJl-F和phaJl-R(见上)，反应条件如1. 1. 1. 1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自 OMEGA, Cat. No. D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISPOl (图5)后， 再通过限制性酶切和测序验证。1. 1. 2. 2 pISP012 载体的构建将胶回收后的ilvE基因与pISPOl载体用Nco I和BamH I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他，连接产物42°C热激转化 E.coli DH5a 感受态细胞(购自 TaKaRa, TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有；34 μ g · ml/1 氯霉素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增采用的引物序列如下DuetUPl :5，-GGATCTCGACGCTCTCCCTDuetDOffNl :5，-GATTATGCGGCCGTGTACAAPCR反应条件如1. 1. 1. 1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP012 (图6)后，再通过限制性酶切和测序验证。1. 1. 2. 3 pISP03 载体的构建将胶回收后的adhE基因与pET48a(+)载体(购自Novagen)用Nco I和BamH I进行双酶切，载体与外源片段按摩尔比1 5的比例，4°C连接过夜或16°C连接4 他， 连接产物42°C热激转化E. coli DH5a感受态细胞(购自TaKaRa，TaKaRa Code D9057)，然后涂布加有50yg ^mL-1卡那霉素素的LB固体平板，PCR筛选阳性克隆。PCR扩增引物为 adhE-F和adhE-R (见上)，PCR反应条件如1. 1. 1. 1。按照细菌质粒小量提取试剂盒(购自 OMEGA, Cat. No. D6942-02)提供的操作步骤，从阳性克隆中提取重组质粒pISP03 (图7)后， 再通过限制性酶切和测序验证。1.2 E.coli ISP0123 重组菌株的构建pISP012和pISP03两个重组质粒共同42°C热激转化E. coli BL21 (DE3)感受态细胞(购自Invitrogen，SKU#C6000_0;3)，涂布加有氯霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体平板，通过PCR分别对E. coli ISP0123中的phajl，iIvE和adhE等三个基因进行验证，PCR 反应所采用的引物和反应条件同实施例1. 1.2. 1,1. 1.2.2和1. 1.2. 3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有PISP012和pISP03两个表达载体的工程大肠杆菌 Ε. coli ISP0123。1.3工程大肠杆菌Ε. coli ISP0123的摇瓶培养将E. coli ISP0123按1 100的比例接种到装有M9液体培养基(0. 6%磷酸氢二钠，0. 3 %磷酸二氢钾，0. 1 %氯化铵，0. 05 %氯化钠，0. 025 %硫酸镁，2 %葡萄糖)的摇瓶中，培养基中含有50μ g · ml/1的卡那霉素和34μ g · ml/1氯霉素，37 °C，225rpm条件下振荡培养，当OD6tltlnm为0. 6-0. 8时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度0. Immol · L—1 1. Ommol · Γ1，然后在25 30°C, 180 225rpm条件下，继续诱导培养24_72h。1. 4工程大肠杆菌E. coli ISP0123的发酵罐培养将E. coli ISP0123按1 100的比例接种到装有M9液体培养基的发酵罐中，培养基中含有50 μ g -mr1的卡那霉素和!Myg -πιΓ1氯霉素，在温度为37°C，溶氧为10%~30%, PH为6. 0-8. 0条件下培养，当OD6tltlnm为1. 0 3. 0时，在菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度 0. 1 匪ol 'Γ1 1. (toimol ·Ι^，然后在温度为 25°C _37°C，溶氧为 10% -30%，pH 为 6. 0-8. 0 条件下，继续诱导培养对-7池，期间不断补加葡萄糖，并控制残糖量在0. 1% -0.3%。1. 5 3-甲基-1，3-丁二醇产物分离在发酵液中加入50 400ppm的非离子型絮凝剂丙烯酰胺-甲基丙烯酸_2_羟基丙酯基三甲基氯化铵共聚物(也可以使用聚α-氰基丙烯酸甲酯或聚烷基酚-环氧乙烷等)，除去菌体固形物和蛋白质，用酸调节发酵液的PH为1 3。发酵液用15% 40%的丙醛、丁醛、异丁醛或异戊醛进行反应萃取，醇与醛发生缩醛反应形成缩醛，并被萃取到有机相。萃取相中加入5% 15%的水，通过填有固体酸的精馏塔进行反应精馏，醛类分离出后使得缩醛水解反应得以正向进行，得到3-甲基-1，3-丁二醇，同时回收醛类。1.6 3-甲基-1，3-丁二醇产物测定得到的3-甲基-1，3-丁二醇通过Agilent 5975C气相色谱-质谱联用仪(GC-MS) 对其进行分析测定。采用毛细管色谱柱(Agilent HP-INNO Wax 30m，0. 32mm，0. 25 μ m.)，方法为50°C维持2分钟，然后10°C /分钟程序升温至，240°C维持3分钟。实验结果显示， 样品峰的保留时间(图18A)和3-甲基-1，3-丁二醇标准品(购自阿拉丁，货号1105718) 峰的保留时间(图14A) —致，而且样品峰的质谱图(图18B)和3-甲基-1，3-丁二醇标准品的质谱图(图14B) —致，证明工程大肠杆菌E. coli ISP0123可以生产3-甲基-1，3-丁二醇。1.7异戊二烯的生产以Al2O3作为催化剂，将3-甲基-1，3- 丁二醇在300°C以上的温度下进行加热脱水，即可以获得异戊二烯。得到的异戊二烯通过Agilent 5975C GC-MS系统对其进行分析。 采用Agilent DB-5毛细管色谱柱(50m，0. 25mm，0. 25 μ m)，方法为40°C维持1分钟，然后 5°C /分钟程序升温至80°C，继续25°C /分钟升温至300°C，300°C维持5分钟。实验结果显示，样品峰的保留时间(图21A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码10160)峰的保留时间(图17A) —致，而且样品峰的质谱图(图21B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B) —致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。实施例2通过在大肠杆菌(E. coli)中共同过量表达来源于&iccharomyces cerevisiae的
12HMG-CoA合成酶基因(HMGS)，来源于S. cerevisiae的HMG-CoA还原酶基因(tHMGR)和来源于S. cerevisiae的甲羟戊酸脱羧酶基因(mvdl)，以利用甲羟戊酸脱羧途径来生物合成中间产物3-甲基-3- 丁烯-1-醇，生成的3-甲基-3- 丁烯-1-醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。2.1外源基因的克隆和表达载体的构建2. 1. 1外源基因的克隆2. 1. 1. 1 S. cerevisiae HMG-CoA 合成酶基因的克隆按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat. No. D3370-01)提供的操作步骤，提取 S. cerevisiae M4054(购自 ATCC，ATCC No. 200528)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA合成酶基因HMGS，Gene ID 8549130 PCR扩增采用的引物序列如下HMGS-F 5，-GGAATTCCATATGAAACTCTCAACTAAACTTTGHMGS-R 5 ’ -CACCTCGAGTTATTTTTTAACATCGTAAGATCPCR反应条件如1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。2. 1. 1. 2 S. cerevisiae HMG-CoA 还原酶基因的克隆按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat. No. D3370-01)提供的操作步骤，提取 S. cerevisiae M4054(购自 ATCC，ATCC No. 200528)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增HMG-CoA还原酶基因tHMGR，Gene ID :854900o PCR扩增采用的引物序列如下tHMGR-F 5，-CATGCCATGGACCAATTGGTGAAAACTGAAGtHMGR-R 5' -CGGGATCCTTAGGATTTAATGCAGGTGACGPCR反应条件如1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。2. 1. 1. 3 S. cerevisiae甲羟戊酸脱羧酶基因的克隆按照酵母基因组提取试剂盒(OMEGA，Cat. No. D3370-01)提供的操作步骤，提取 S. cerevisiae M4054(购自 ATCC，ATCC No. 200528)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计弓丨物，PCR扩增甲羟戊酸脱羧酶基因mvdl，Gene ID :855779. PCR扩增采用的引物序列如下mvdl-F 5' -GGAATTCCATATGACCGTTTACACAGCATCCmvdl-R 5' -CGGAATTCTTATTCCTTTGGTAGACCAGTCPCR反应条件如1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。2. 1.2表达载体的构建2. 1. 2. 1 pISP21 载体的构建(图 8)将胶回收后的HMGS基因与pACYCDuet-Ι载体(购自Novagen)分别用Nde I和 Xho I进行双酶切，连接、转化、提取及验证过程参见1. 1. 2. 1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为HMGS-F和HMGS-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP21。2. 1. 2. 2 pISP212 载体的构建(图 9)
将胶回收后的tHMGR基因与pISP21载体用Nco I和BamH I进行双酶切，连接、 转化、提取及验证过程参见1. 1.2. 2，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为tHMGR-F和 tHMGR-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP212。2. 1. 2. 3 pISP24 载体的构建(图 10)将胶回收后的mvdl基因与pET_30a(+)载体(购自Novagen)用Nde I和EcoR I 进行双酶切，连接、、提取转化及验证过程参见1. 1. 2. 3，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为mvdl-F和mvdl-R(见上)。获得的重组质粒称为pISPM。2. 2 Ε. coli ISP2124 重组菌株的构建ρ ISP212和ρ ISPM两个重组质粒共同42 °C热激转化E. co 1 i BL21(DE3)感受态细胞anvitrogen，SKU #C6000_03)，涂布加有氯霉素和卡那霉素两种抗生素的LB固体平板， 通过PCR分别对E. coli ISP2124中的HMGS，tHMGR和mvdl等三个基因进行验证，PCR反应所采用的引物和反应条件同实施例2. 1. 1. 1,2. 1. 1.2和2. 1. 1. 3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有PISP212和pISPM两个表达载体的工程大肠杆菌 E. coli ISP2124。2. 3工程大肠杆菌E. coli ISP2124的摇瓶培养，方法参见1. 3。2. 4工程大肠杆菌E. coli ISP2124的发酵罐培养，方法参见1. 4。2.5 3-甲基-3-丁烯-1-醇产物分离，方法参见1.5。2. 6 3-甲基-3- 丁烯-1-醇产物测定检测方法参见1. 6。实验结果显示，样品峰的保留时间(图19A)和3_甲基_3_ 丁烯-1-醇标准品(购自TCI，产品编码M0726)峰的保留时间(图15A) —致，而且样品峰的质谱图(图19B)和标准谱库中3-甲基-3-丁烯-1-醇标准品的质谱图(图15B) —致，证明工程大肠杆菌E. coli ISP21M确实可以生产3-甲基-3-丁烯-1-醇。2.7异戊二烯的生产方法参见1.7。实验结果显示，样品峰的保留时间(图22A)和异戊二烯标准品(购自TCI，产品编码10160)峰的保留时间(图17A) —致，而且样品峰的质谱图(图22B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B) —致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。实施例3通过在大肠杆菌(E.coli)中共同过量表达相关基因，生物合成中间产物3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇，产生的3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基_1，4_ 丁二醇再在Al2O3的催化下加热脱水生成终产物异戊二烯。3.1外源基因的克隆和表达载体的构建3. 1. 1外源基因的克隆3. 1. 1. 1 B. subtilis乙酰乳酸合成酶基因alsS的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取 B. subtilis BU169(购自 ATCC，ATCC No. 10774)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增来源于B. subtilis的乙酰乳酸合成酶基因alsS，Gene ID :936852。PCR扩增采用的引物序列如下alsS-F 5' -CTCAGATCTATGACAAAAGCAACAAAAGAAC
alsS-R :5’ -AGCCATGGTATATCTCCTTATTAAACTAGAGAGCTTTCGTTTTCATGAGT反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas,Cat. No. K0692)回收目的基因片段。3. 1. 1. 2 E. coli酮酸还原异构酶基因ilvC的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取E. coli K-12(购自ATCC，ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物， PCR扩增酮酸还原异构酶基因ilvC，GeneID :948286. PCR扩增采用的引物序列如下i IvC-F 5’-ACTCATGAAAACGAAAGCTCTCTAGTTTAATAAGGAGATATACCATGGCTAACTACTTC AATACACTGiIvC-R 5，-CACCTCGAGTTAACCCGCAACAGCAATACGTTTCPCR反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。3. 1. 1. 3 E. coli的二羟酸脱水酶基因ilvD的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取E. coli K-12(购自ATCC，ATCC No. 10798)的基因组DNA，根据GenBank序列设计引物， PCR扩增二羟酸脱水酶基因ilvD，GeneID :948277. PCR扩增采用的引物序列如下i 1 vD-F 5’-CAAAACAACCTGCGTTTATGAATTAATTTAATAAGGAGATATACCATGCCTAAGTACCG TTCCGCCACCAiIvD-R 5' -CATCGTCGACTTAACCCCCCAGTTTCGATTTATCGPCR反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。3. 1. 1.4 E. coli的2_异丙基苹果酸合成酶基因leuA，3_异丙基苹果酸异构酶大亚基基因leuC，3-异丙基苹果酸异构酶小亚基基因leuD，3-异丙基苹果酸脱氢酶基因IeuB 的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自OMEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取 E. coli K-12(购自 ATCC, ATCC No. 10798)的基因组 DNA。leuA, IeuB, IeuC 禾口 IeuD 共同位于一个基因簇IeuAB⑶，因此将四个基因作为一个整体进行克隆，leuA，IeuB, IeuC和 IeuD 四个基因的 GeneID 依次分别为 947465，944798，945076，945642。根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增IeuAB⑶。PCR扩增采用的引物序列如下IeuABCD-F :5’ -CAGAGCTCATGAGCCAGCAAGTCATTATTTTCGIeuABCD-R :5’ -AGGCATGGTATATCTCCTTATTAAATTAATTCATAAACGCAGGTTGTTTTGPCR反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。3. 1. 1. 5 L. Iactis酮异戊酸脱羧酶基因kivd的克隆按照细菌基因组提取试剂盒(购自0MEGA，Cat. No. D3350-01)提供的操作步骤，提取 L. Iactis subsp. Lactis (购自 ATCC，ATCC No. 11007)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增酮异戊酸脱羧酶基因kivd，GeneID :8678808。PCR扩增采用的引物序列如下kivD-F 5’ -CATGCCATGGATGTATACAGTAGGAGATTACCTAT
kivD-R :5’ -AGACATGGTATATCTCCTTATTAAATTATGATTTATTTTGTTCAGCAAATPCR反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。3. 1. 1. 6 S. cerevisiae 醇脱氢酶基因 ADH2 的克隆按照酵母基因组提取试剂盒(购自0MEGA，Cat. No. D3370-01)提供的操作步骤，提取 S. cerevisiae M4054(购自 ATCC，ATCC No. 200528)的基因组 DNA，根据 GenBank 序列设计引物，PCR扩增醇脱氢酶基因ADH2，GeneID :855349. PCR扩增采用的引物序列如下ADH2-F 5’-ATTTGCTGAACAAAATAAATCATAATTTAATAAGGAGATATACCATGTCTATTCCAGAA ACTCAAAAAGADH2-R 1 :5，-TTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATPCR反应条件同1. 1. 1. 1。利用胶回收试剂盒(购自Fermentas, Cat. No. K0692) 回收目的基因片段。3. 1. 1. 7 P450单加氧酶基因P450-BM3-J的克隆P450-BM3-J基因通过化学合成(合成自上海捷瑞生物工程有限公司)获得，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。3. 1.2融合基因的构建3. 1. 2. 1 alsS-ilvC 融合基因的构建将切胶回收后的al sS基因和i 1 vC基因等摩尔混合后互为引物进行PCR反应条件同1. 1. 1. 1。扩增得到的产物作为模板，以alsS-F和ilvC-R作为引物扩增全长的 alsS-ilvC融合基因，PCR反应条件同1. 1. 1. 1。3. 1. 2. 2 leuABCD-ilvD 融合基因的构建将切胶回收后的IeuAB⑶基因和ilvD基因等摩尔混合后互为引物进行PCR扩增， PCR反应条件同1. 1. 1. 1。扩增得到的产物作为模板，以IeuAB⑶-F和ilvD-R作为引物扩增全长的IeuAB⑶-ilvD融合基因，PCR反应条件同1. 1. 1. 1。3. 1. 2. 3 kivD-ADH2-P450-BM3-J 融合基因的构建将切胶回收后的kivD基因和ADH2基因等摩尔混合后互为引物进行PCR扩增，反应条件同1. 1. 1. 1。扩增得到的产物作为模板，以kivD-F和ADH2-R1作为引物扩增全长的 kivD-ADH2-l融合基因，PCR反应条件同1. 1. 1. 1。以kivD-ADH2-l为模板，kivD-F和ADH2-R2作为引物扩增获得kivD-ADH2_2，以全基因合成产物为模板，BM3-J-F和BM3-J-R为引物扩增获得P450-BM3-J基因。引物序列如下ADH2-R2 :5， -TGTCATGGTATATCTCCTTATTAAATTATTTAGAAGTGTCAACAACGTATBM3-J-F 5’-ATACGTTGTTGACACTTTCAAATAATTTAATAAGGAGATATACCATGACAATTAAAGA AATGCCTCAGC,BM3-J-R CACCTCGAGTTACCCAGCCCACACGTCTTTTGCG将得到的kivD-ADH2_2基因与P450-BM3-J基因等摩尔混合后互为引物进行PCR 扩增，PCR反应条件同1. 1. 1. 1。扩增得到的产物作为模板，以kivD-F和BM3-J-R作为引物扩增全长的kivD-ADH2-P450-BM3-J融合基因，PCR反应条件同1. 1. 1. 1。3. 1.3表达载体的构建
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3. 1. 3. 1 pISPll 载体的构建(图 11)将alsS-ilvC 与 pACYCDuet-Ι 载体(购自 Novagen)分别用 Bgl II 和 Xho I 进行双酶切，连接、转化、提取及验证参见1. 1.2. 1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为 alsS-F和iIvC-R(见上)。获得的重组质粒称为pISPll。3. 1. 3. 2 pISP112 载体的构建(图 12)将leuACDB-ilvD融合基因与pISPll载体分别用I和Ml I进行双酶切， 连接、转化、提取及验证同1. 1. 2. 1，其中PCR筛选阳性克隆时使用的引物为IeuAB⑶-F和 iIvD-R(见上)。获得的重组质粒称为pISP112。3. 1. 3. 3 pISP13 载体的构建(图 13)将kivD-ADH2-P450-BM3-J 融合基因与 pTrcHis2B 载体(购自 hvitrogen)分别用Nco I和》!0 I进行双酶切，连接、转化、提取及验证同1.1. 2. 3，仅筛选用抗生素变为 50 μ g · mL—1氨苄青霉素。并且PCR筛选阳性克隆时使用的引物为kivD_F和BM3-J-R(见上。获得的重组质粒称为PISP13。3. 2 E. cloi ISP1123 重组菌株的构建pISP112和pISP13两个重组质粒共同42°C热激转化E. coli BL21(DE3)感受态细胞(Invitrogen，SKU #C6000_03)，涂布加有氯霉素和氨苄青霉素两种抗生素的 LB 固体平板，通过 PCR 分别对 E. coli ISP1123 中的 alsS-ilvC，leuACDB-ilvD 和 kivd-ADH2-P450-BM3-J等三个基因进行验证，PCR反应所采用的引物和反应条件同实施例 3. 1. 2. 1,3. 1. 2. 2和3. 1. 2. 3中所采用的引物和反应条件。三个PCR反应均为阳性的克隆即为含有PISP112和pISP13两个表达载体的工程大肠杆菌E. coli ISP1123。3. 3工程大肠杆菌E. coli ISPl 123的摇瓶培养，参见1. 3。3. 4工程大肠杆菌E. coli ISP1123的发酵罐培养，参见1. 4。3.5 2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇产物分离，参见1. 5。3.6 2-甲基-1，4-丁二醇和3-甲基-1，3-丁二醇产物测定参见1.6。实验结果显示，样品峰的保留时间(图20A)分别和3_甲基_1，3_ 丁二醇标准品(购自阿拉丁，货号1105718)峰(图14A)和2-甲基_1，4-丁二醇标准品(购自TCI，产品编码M1234)峰(图16A)的保留时间一致，而且样品峰的质谱图(图20B和图20C)分别和3-甲基-1，3-丁二醇标准品的质谱图(图14B)和2-甲基-1，4-丁二醇标准品的质谱图(图16B) —致，证明工程大肠杆菌E. coli ISP1123确实可以生物合成3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇。3. 7异戊二烯的生产参见1. 7。实验结果显示，样品峰的保留时间(图23A)和异戊二烯标准品(购自 TCI，产品编码10160)峰的保留时间(图17A) —致，而且样品峰的质谱图(图23B)和标准谱图库中异戊二烯标准品的质谱图(图17B) —致，因此证明了异戊二烯的产生，同时也说明了该方法确实能够利用糖类原料来合成异戊二烯。
权利要求
1.一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括通过生物法合成二醇或烯醇和对合成的二醇或烯醇进行脱水以获得异戊二烯的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇选自2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基-1，.3-丁二醇，所述烯醇是3-甲基-3- 丁烯-1-醇。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇或烯醇是通过酶系统或通过培养重组细胞生物合成的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且所述3-甲基-1，3- 丁二醇是使用包括氨基转移酶、烯酰-CoA水解酶和醇醛脱氢酶的酶系统合成的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且所述3-甲基-3- 丁烯-1-醇是使用包括HMG-CoA合成酶、HMG-CoA还原酶和甲羟戊酸脱羧酶的酶系统合成的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，.4-丁二醇，且所述3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4- 丁二醇是使用包括乙酰乳酸合成酶、酮酸还原异构酶、二羟酸脱水酶、2-异丙基苹果酸合成酶、3-异丙基苹果酸异构酶、 3-异丙基苹果酸脱氢酶、酮异戊酸脱羧酶、醇脱氢酶和P450单加氧酶的酶系统合成的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇，且通过培养具有生产3-甲基-1，3- 丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3- 丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3- 丁二醇的能力的重组细胞表达氨基转移酶基因、烯酰-CoA水解酶基因和醇醛脱氢酶基因，优选地，其中所述氨基转移酶基因是来源于大肠杆菌的ilvE基因，或和ilvE基因同源性超过70% 的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvE基因没有明显的同源性，但和ilvE基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述烯酰-CoA水解酶基因是来源于I^seudomonas aeruginosa的phajl基因，或和 PhaJl基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和phajl基因没有明显的同源性，但和phajl基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述醇醛脱氢酶基因是来源于Clostridium acetobutylicum的adhE基因，或和adhE 基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和adhE基因没有明显的同源性， 但和adhE基因具有相同或相似功能的核酸序列。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述烯醇是3-甲基-3-丁烯-1-醇，且通过培养具有生产3-甲基-3- 丁烯-1-醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-3- 丁烯-1-醇，所述具有生产3-甲基-3- 丁烯-1-醇的能力的重组细胞表达HMG-CoA合成酶基因、HMG-CoA 还原酶基因和甲羟戊酸脱羧酶基因，优选地，其中所述HMG-CoA合成酶基因是来源于Saccharomyces cerevisiae的HMGS基因，或和 HMGS基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和HMGS基因没有明显的同源性，但和HMGS基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述HMG-CoA还原酶基因是来源于S. cerevisiae的tHMGR基因，或和tHMGR基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和tHMGR基因没有明显的同源性，但和 tHMGR基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述甲羟戊酸脱羧酶基因是来源于S. cerevisiae的mvdl基因，或和mvdl基因同源性CN 102533870 A超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和mvdl基因没有明显的同源性，但具有甲羟戊酸脱羧功能的核酸序列。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述二醇是3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1， 4-丁二醇，且使用具有生产3-甲基-1，3-丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞来合成所述3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4- 丁二醇，所述具有生产3-甲基-1，3- 丁二醇和2-甲基-1，4-丁二醇的能力的重组细胞表达乙酰乳酸合成酶基因、酮酸还原异构酶基因、二羟酸脱水酶基因、2-异丙基苹果酸合成酶基因、3-异丙基苹果酸异构酶基因、3-异丙基苹果酸脱氢酶基因、酮异戊酸脱羧酶基因、醇脱氢酶基因和P450单加氧酶基因，优选地，其中所述乙酰乳酸合成酶基因是来源于Bacillus subtilis的alsS基因，或和alsS基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和alsS基因没有明显的同源性，但和 alsS基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述酮酸还原异构酶基因是来源于E. coli的ilvC基因，或和ilvC基因同源性超过 70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvC基因没有明显的同源性，但和ilvC基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述二羟酸脱水酶基因是来源于E. coli的ilvD基因，或和ilvD基因同源性超过70% 的核酸序列，或来源于其它生物体，和ilvD基因没有明显的同源性，但和ilvD基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述2-异丙基苹果酸合成酶基因是来源于E. coli的IeuA基因，或和IeuA基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和IeuA基因没有明显的同源性，但和IeuA 基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述3-异丙基苹果酸异构酶基因是来源于E. coli的IeuCD基因，或和IeuCD基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和Ieu⑶基因没有明显的同源性，但和 IeuCD基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述3-异丙基苹果酸脱氢酶基因是来源于E. coli的IeuB基因，或和IeuB基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和IeuB基因没有明显的同源性，但和IeuB 基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述酮异戊酸脱羧酶基因是来源于Lactococcus Iactis的kivd基因，或和kivd基因同源性超过70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和kivd基因没有明显的同源性，但和 kivd基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述醇脱氢酶基因是来源于S. cerevisiae的ADH2基因，或和ADH2基因同源性超过 70%的核酸序列，或来源于其它生物体，和ADII2基因没有明显的同源性，但和ADH2基因具有相同或相似功能的核酸序列，所述P450单加氧酶基因是来源于化学合成的P450-BM3-J基因(序列见SEQ ID NO. 1)， 或和P450-BM3-J基因同源性超过70 %的核酸序列，或来源于其它生物体，和P450-BM3-J基因没有明显的同源性，但和P450-BM3-J基因具有相同或相似功能的核酸序列。
10.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述简单碳源包括生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合。
11.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其中所述培养利用简单碳源，优选生物质碳源，如糖类、木质素、纤维素、半纤维素、淀粉或其组合；和/或所述培养优选利用摇瓶或萃取发酵方法来实施；和/或所述重组细胞优选是由微生物，包括酵母菌、真菌和细菌，如埃希氏菌属大肠杆菌(E. coli)、埃希氏杆菌、芽孢杆菌、酵母、假单胞菌、链霉菌、曲霉菌通过基因工程技术构建而成的。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述脱水包括生物法脱水或化学法脱水，所述化学法脱水优选以Al2O3作为催化剂，在加热的情况下进行。
13.一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的酶系统，所述酶系统为在根据权利要求4-6 中任一项所述的方法中使用的酶系统。
14.一种由简单碳源合成二元醇或烯醇的重组细胞，所述重组细胞为在根据权利要求 7-12中任一项所述的方法中使用的重组细胞。
15.根据权利要求1-12中任一项所述的方法、根据权利要求13所述的酶系统和根据权利要求14所述的重组细胞在制备化合物或组合物中的应用，所述化合物或组合物包括异戊二烯、聚异戊二烯、异戊橡胶、丁基橡胶、苯乙烯一异戊二烯一苯乙烯嵌段共聚物弹性体、 集成橡胶、光盘胶、粘合剂、农药、香料、润滑油添加剂、橡胶硫化剂和催化剂。
全文摘要
本发明提供了一种生物法合成异戊二烯的方法，所述方法包括通过生物法由简单碳源合成二醇或烯醇和对合成的二醇或烯醇进行脱水以获得异戊二烯的步骤，其中所述二醇可以选自2-甲基-1，4-丁二醇、3-甲基-1，3-丁二醇，所述烯醇可以是3-甲基-3-丁烯-1-醇。本发明还涉及在本发明所述合成异戊二烯化合物方法中使用的酶系统和重组细胞。
文档编号C12N9/14GK102533870SQ20101060918
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者咸漠, 张新志, 张英伟, 杨建明, 武悦, 郑艳宁 申请人:中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 北京旭阳化工技术研究院有限公司