专利名称：石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的pcr-dgge分析方法
技术领域：
本发明属于土壤微生物群落多样性分析技术领域，具体针对石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的PCR-DGGE分析方法，即通过对微生物群落多样性的PCR-DGGE实验条件进行改进和优化得到最佳的试剂用量及实验条件。本发明主要应用于石油污染土壤生物修复过程中分子生态学研究，也可为其他环境样品的分子生态学研究提供参考。
背景技术：
石油作为重要的工业能源，对经济的发展起着重大的决定作用，但同时在石油的生产、运输、储存、使用过程中又对自然环境特别是土壤和地下水造成了重大污染，对人类健康造成很大的威胁，使未来的经济发展面临着巨大的挑战。目前，为了减小石油污染引起的当地生态风险和改善被污染的环境，国际公认的最有效的处理方法——生物修复技术得到了极大的关注。在生物修复的生态系统中，微生物在与受污染的环境发生作用的过程中， 不同种类的微生物执行着不同的功能，共同承担着污染物的分解和氧化，它们之间存在着内在的相互依存、相互作用的微生态关系。同时微生态系统与周围的环境有着密切的联系， 微生物种群之间的相互关系以及环境因子决定了微生态系统的结构和功能。由多种微生物组成的微生物生态系统的结构和功能直接关系到生物修复的处理效能，处理效果的好坏及运行中出现的问题都与微生态系统的结构密切相关。因此，微生物生态学的研究是生物修复的理论基础，目前已经成为环境生物修复技术理论研究的新方向。由于聚合酶连式反应-变性梯度凝胶电泳(Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis,简禾尔 PCR-DGGE)技术能够在分子生物学水平对微生物进行快速精确的分析，可以用来监测微生物多样性、群落的动态变化和富集、筛选过程中菌株的分析与跟踪等，在各种环境微生物生态学的研究中也得到广泛地应用，如海洋、湖泊、土壤、活性污泥、生物膜等，它已经成国内外研究微生物生态的重要技术。虽然严格地参照操作说明书和相关参考文献能获得比较理想的实验结果，但是， 由于可供研究的样品种类繁多，并且PCR-DGGE技术针对不同的样品均需通过实际试验来确定相关重要试剂用量以及把握一些实验细节，且多数文献没有具体说明重点试剂用量， 因此有必要对典型的样品给出已经摸索出的最佳条件，以期为后续研究提供技术指导，避免繁琐的大量实验条件尝试。
发明内容
本发明的目的是提供改进的优化的石油污染土壤的PCR-DGGE技术研究条件和关键试剂的用量。本发明是通过如下方案实现的将取自胜利油田某油井旁的石油污染土壤样品进行风干、除杂、细化、添加高效石油降解菌剂和营养物，保持一定的土壤湿度、温度、PH值，进行石油污染土壤生物修复小试。小试实验进行7周，每周定期取样，测定其土壤石油含量，计算石油降解率。针对修复前期(15天)、中期(30天)、后期(45天)的土壤进行PCR-DGGE试验， 考察土壤中微生物的群落结构和动态变化，以及系统中的微生物多样性。对前期的土壤样品，进行PCR-DGGE试验条件改进和优化，并采用优化的条件处理中期和后期样品。有益效果本发明所涉及的石油污染土壤中石油含量为160_200g/(kg干土)，含盐量为 9-20g/(kg干土)，修复采用的菌剂能在6% -10%盐浓度环境下良好生长，保证了石油污染土壤生物修复的顺利进行；应用于分析该土壤样品的PCR-DGGE改进方法及优化条件和试剂用量为1)称取0. 4g石油污染土壤采用改进的生物-化学裂解法即可直接提取其足量的基因组DNA，其中在只加入DNA抽提液后增加涡旋振荡步骤可得到更佳的效果，提取的 DNA沉淀采用IOOyL TE缓冲液溶解即可。土壤样品使用越多获得的DNA产量越多，相应消耗试剂量越多，成本越高，操作越耗时；幻采用离心柱式胶回收试剂盒纯化DNA产品，回收的DNA沉淀采用50 μ LTE缓冲液溶解；3)该纯化后的DNA产品可直接用于PCR反应，引物采用16S rRNA基因V3区的通用引物GC341f/534r，DNA模板用量最佳为1 μ L，即得到单一整齐亮度高的PCR产物；参考PCR程序为起始95°C预变性10min，94°C变性30s，53°C引物复性30s，72°C引物延伸30s，30个循环，72°C终延伸IOmin ；4)得到的PCR产物纯度高，产量充足，无需纯化，采用3 5μ L即可直接用于DGGE实验并获得清晰整齐的指纹图谱；5) DGGE实验制胶时，宜用9 μ L TEMED, 40 μ L 10% APS投加到18mL的变性丙烯酰胺胶溶液中， 该用量恰好能灌满胶板；6)灌胶后，在顶端用保鲜膜覆盖以隔离空气，并防止TEMED、APS的挥发影响胶凝固；隔夜放置(约10h)，使其完全凝固，能获得比短时间(1 2h)更为优良的变性胶；7)设置电压120V，电泳温度60°C，电泳时间5h，即可获得良好的DGGE图谱，较长 (约12h以上)的电泳时间对电泳效果改善不明显，甚至会使得DNA样品完全解链而跑出胶外；8)银染时，固定时间为15min，染色时间15min，显色1 2min，每次间隔均用去离子水快速清洗两遍，终止液可以不予使用；9)少量合理的试剂用量可以大大地节约实验成本和时间，并能得到理想的实验效果。应用领域本发明所得到的PCR-DGGE实验改进方法和优化条件主要应用于石油污染土壤的生态学研究，对其他的如农业土壤、活性污泥、生物膜、石化废水等环境样品亦有可靠的借鉴作用。
图1 本发明中土壤样品中基因组总DNA的粗提图；图2 本发明中土壤样品中基因组总DNA的纯化图；图3 本发明中土壤样品16S rDNA V3区PCR扩增图；图4 本发明中土壤样品土样V3区PCR产物的DGGE电泳图谱。
具体实施例方式
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下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。1.石油污染土壤样品及其预处理对修复前期(15天)的土壤进行PCR-DGGE分析，考察土壤中微生物的群落结构和动态变化，以及系统中的微生物多样性。用于石油污染土壤生物修复小试试验的土壤取自胜利油田某油井旁，经除杂、风干、散碎、过200目筛、混勻后，取等量分装于10个小花盆中，并投加重离子诱变后筛选驯化的菌种。其中石油污染土样的基本理化性质如表1所示，土壤含油量高达194. 5g/(kg干土 )远超出临界值500mg/kg，含盐量高达8. 26g/ (kg干土 )，氮含量不足仅为25. 52mg/ (kg 干土)。由于C N P = 15. 27 0.025 0. 34 = 611 1 12，但是正常的微生物生长需要的C N P = 100 5 10 1，故修复过程中外加投入10. IOg KNO3/(kg干土) 补充氮源。修复实验过程中每天早晚洒水并翻动土壤，保证土壤含水率为30%左右及良好的充氧。表1石油污染土样的基本理化性质
权利要求
1.采用的石油污染土壤生物修复过程中微生物多样性的PCR-DGGE分析方法，提取土壤样品DNA的最佳土壤样品量为0. 4g，得到的DNA沉淀采用100 μ LTE缓冲液溶解，纯化后的DNA沉淀采用50 μ L TE缓冲液溶解。
2.根据权利要求1所述的DNA提取方法，其纯化后的DNA产品取1μ L即可直接用于 PCR反应，参考PCR程序为起始94°C预变性5min，94°C变性45s，55°C引物复性45s, 72°C 引物延伸90s，25个循环，72°C终延伸IOmin。
3.根据权利要求2所述的PCR反应方法，取3 5μL PCR产物即可直接用于DGGE实验。
4.DGGE制胶时，宜用9 μ LTEMED, 40 μ L 10% APS投加入18mL的变性丙烯酰胺胶溶液中；增大试剂用量会导致胶凝固时间快而使浓度梯度不均勻。
5.根据权利要求4所述的制胶方法，灌胶后，在顶端用保鲜膜覆盖，隔夜放置(约 IOh)，能获得比短时间(1 2h)更为优良的变性胶。
6.根据权利要求5所述的制胶方法，设置电压120V，电泳温度60°C，电泳时间5h，即可获得良好的DGGE图谱，较长(约12h以上)的电泳时间对电泳效果改善不明显。
7.根据权利要求6所述的电泳方法，银染时，固定时间为15min，染色时间15min，显色 1 2min，每次间隔均用去离子水快速清洗两遍，终止液可以不予使用。
8.根据权利要求1 7所述的实验方法，发现少量合理的试剂用量可以大大地节约实验成本和时间，并能得到理想的实验效果。
全文摘要
本发明属于土壤微生物群落多样性分析技术领域，公开了PCR-DGGE法分析石油污染土壤微生物群落多样性的最佳条件和试剂用量。主要体现在①取0.4g土样可提取足量的DNA；②取1μL纯化DNA直接用于PCR反应；③取3～5μL PCR产物用于DGGE实验；④制胶时宜用9μL TEMED，40μL 10％APS投加到18mL变性丙烯酰胺胶溶液中；⑤灌胶后在顶端用保鲜膜覆盖，隔夜放置，能获得优良的变性胶；⑥设置电压120V，电泳温度60℃，电泳时间5h，可获得良好的DGGE图谱；⑦银染时终止液可不予使用。本发明主要应用于石油污染土壤生物修复过程中分子生态学研究，也可为其他环境样品的分子生态学研究提供参考。
文档编号C12Q1/04GK102174648SQ20101060900
公开日2011年9月7日 申请日期2010年12月17日 优先权日2010年12月17日
发明者杨玉楠, 郭若勤 申请人:北京航空航天大学