专利名称：含内参照的新德里金属β内酰胺酶-1基因检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种单管双波长荧光PCR检测新德里金属β内酰胺酶-I(NDM-I)基因和内参照DNA的试剂盒。
背景技术：
2010年，在印度、巴基斯坦等南亚国家出现的一种新型细菌变种基因有可能在全球蔓延，拥有这种基因的细菌对包括头孢类、碳青霉烯类、氨基糖苷类等绝大部分抗生素都有耐药性(目前仅对替家环素和多粘菌素两种抗生素敏感)，因此医学专家将这种基因命名为新德里金属β内酰胺酶_l(New Delhimetallo-^-Iactamase 1，简称NDM-1)基因， 它起初存在于大肠杆菌等细菌的质粒上，表达产生的酶能分解上述抗生素，NDM-I基因能随着质粒在细菌间的转移而传播，造成获得该基因的细菌对大部分抗生素的耐药性Wong D, et al. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,2009,53(12) :5046-5054. Rolain JM, et al, Clinical Microbiology and Infection，2010，16 (12) : 1699-1701.)。迄今， 含有NDM-I这一超级耐药基因的抗生素多重耐药菌已经从南亚地区蔓延向全球传播，先后在英国、美国、加拿大、澳大利亚、荷兰等国家以及国内发现，对人类的健康形成了新的威胁(www. theLancet. com/Infection, published online August 11,2010D0I :10.1016/ S1473-3099(10)70143-2)。临床上对这种抗生素多重耐药菌的传统检测是分离培养结合药敏鉴定方法，最快需一个多星期出检测结果，远不能满足临床上对病原微生物鉴定和用药指导的需要。因此采用分子生物学方法鉴定含有NDM-I基因的抗生素多重耐药菌是临床上的必然选择，其中荧光PCR方法更是由于灵敏、快速的特点而具有优势。同时，考虑到这种耐药菌经常通过暴露的伤口、血液和粪便接触直接传播，这一类检材样品成分复杂、往往含有较多的PCR抑制物，因此在荧光PCR检测NDM-I基因的过程中，非常有必要引入内参照用于监测操作或PCR 抑制物引起的检测假阴性，减少NDM-I基因耐药菌误诊漏检发生的概率。
发明内容
本发明的目的是提供一种应用双波长荧光PCR技术单管检测新德里金属β内酰胺酶-1 (NDM-I)基因和内参照DNA的试剂盒，其特征在于，试剂盒所用的内参照DNA为人工构建，其核苷酸序列为SEQ ID NO :1。试剂盒能避免因操作失误或样本中PCR抑制物造成的检测结果假阴性问题，从而可以提高实时荧光PCR检测NDM-I基因的准确性，适合临床中含NDM-I基因的抗生素多重耐药病原细菌的快速检测。1.实时荧光PCR引物探针的设计与合成通过对GenBank中对新德里金属β内酰胺酶_1基因序列查询，用分子生物学专业软件对各种来源的基因序列进行比对，选择高度保守并具有很好的同源性的序列，并按照TaqMan荧光PCR设计的原则，设计了一对NDM-I基因特异性引物扩增该基因上的保守区域，并用5’端FAM标记的特异性TaqMan水解探针法实时检测。引物和探针核苷酸序列如下上游引物为5，-ggCggggATT gCgACTTATg-3，，如 SEQ ID No 2 所示；下游引物为5，-AATACCTTgA gCgggCCAAA g_3，，如 SEQ ID NO 3 所示；荧光探针为5，-AATgCgTTgT CgAACCAgCT TgCC_3，(5，标记 FAM，3，标记 TAMRA 或 BHQ-1)，如 SEQ ID No 4 所示。本发明采用人工构建的内参照DNA，其序列为SEQ ID No 1，它含有NDM-I基因PCR 扩增的一条引物序列和另一条引物互补序列，并含有位于两者之间、不同于现有公布的已知生物序列的内参探针序列。更具体地，内参DNA和NDM-I基因扩增片段具有相同的核苷酸序列长度和相近的GC%含量，能保证两者在单管反应体系中具有相同的扩增效率。内参探针核苷酸序列为5，-TTCAg CgAgC gTggg ACATC Agg_3，(5，标记 JOE 或 HEX，3，标记 TAMRA 或 BHQ-1)，如 SEQ ID No 4 所示。通过上述设计，获得的一对引物和探针序列为NDM-I基因所特异，而内参照DNA人工模板序列不同于包括NDM-I基因在内的现有已知生物序列，上述寡核苷酸由商业序列合成公司(上海生工生物工程技术服务有限公司等)合成，合成好的寡核苷酸干粉可用无菌双蒸水溶解至浓度为25 μ Μ, -20°C保存。2.试剂盒的制备含有上述引物探针和内参照DNA的NDM-I基因荧光PCR检测试剂盒(32人份)主要组分如下(I)PCR 缓冲液 672 μ 1，主要成分有 Tris-HCl (ρΗ8. 3)、KC1、明胶、dATP、dGTP、 dCTP、dUTP、MgCl2、上下游引物(SEQ ID No :2 和 3)。(2)荧光探针96 μ 1，含NDM-I基因探针(SEQ ID No 4)和内参探针(SEQID No 5)。(3) Taq酶64 μ 1，含Taq DNA聚合酶40U和尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG酶)16U。(4)内参 160 μ 1，含有 105copy/ml 内参 DNA (SEQ ID NO :1)。(5)阴性对照200 μ 1，为大肠杆菌培养物，IO4个菌/ml。(6)阳性对照200 μ 1，为人工构建含有NDM-I基因片段序列质粒的大肠杆菌培养物，IO3个菌/ml。(7) DNA 提取液 1. 5ml，主要成分为 50mmol/L Na0H、5mM EDTAU % TritonX-100、 1% NP-40。由上述试剂盒组分PCR缓冲液21 μ 1、荧光探针3 μ 1、Taq酶2 μ 1混合后加入模板4μ1 (含有由样本处理步骤引入的内参DNA)后组成的30 μ 1反应体系，含有 Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 2-0. 4mM、 MgCl2L 5-5mM、引物各 0. 2-0. 5 μ Μ, NDM-I 荧光探针和内参探针各 0. 1-0. 5 μ M、Taq DNA 聚合酶1-5U、UNG酶0. 1-1U，在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。更具体地，上述组分配制成的反应体系中含有iTris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、 明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 3mM、MgCl23. 5mM、引物各 0. 35 μ Μ, NDM-I 荧光探针和内参探针各0. 15yM、Taq DNA聚合酶1. 25U、UNG酶0. 5U，在多波长荧光PCR仪器上进行扩增反应。上述组分组装成的试剂盒在-20°C保存和运输。
3.试剂盒使用方法本发明试剂盒在含NDM-I基因抗生素多重耐药病原细菌检测过程中的使用步骤之一为(1)样品处理取采集的临床样本或增菌液，置于离心管13，OOOrpm离心6分钟，用移液器小心吸弃上清(为防止吸走沉淀，可保留5μ 1残液)，在沉淀中加入Iml生理盐水，漩涡振荡混勻后重复离心吸弃上清。在沉淀中加入50 μ 1 DNA提取液、5 μ 1内参，旋涡振荡混勻后100°C 保持10分钟，13，OOOrpm离心2分钟取上清进行荧光PCR扩增检测。试剂盒阴性和阳性对照处理方法和样品液相同。(2)扩增检测按照待检测样品数n+2，取试剂盒PCR缓冲液21 μ 1 X (η+2)、荧光探针 3 μ 1 X (n+2)、Taq酶2 μ 1 X (η+2)组分，混勻后每个扩增管分装沈μ 1，分别加入处理好的试剂盒阴性对照、阳性对照以及上述处理好的η个样本模板各4μ 1。每个反应扩增管体积为30 μ 1，将上述扩增管放到双通道实时荧光PCR仪器上按照50°C 2min、94°C ^iin后 94°C 10sec、60°C45sec循环40次的程序运行。荧光PCR仪运行结束后使用自带软件分析，
结果按照下表来判断。
权利要求
1.本发明为一种检测新德里金属β内酰胺酶-I(NDM-I)基因的试剂盒，其特征在于， 试剂盒利用荧光PCR技术在单管中同时扩增检测NDM-I基因和内参照DNA，且人工构建的内参照DNA核苷酸序列为SEQ ID NO :1。
2.如权利要求1所述，所用试剂盒的引物序列根据NDM-I基因保守序列设计，其中引物核苷酸序列为SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3 ；探针序列为SEQ IDNO :4，探针5，端标记FAM 荧光基团，3’端标记淬灭基团如TAMRA或BHQ-I。
3.如权利要求1所述，试剂盒中的内参DNA含有扩增NDM-I基因的一条引物序列和另一条引物互补序列，并含有位于两者之间、不同于现有公布的已知生物序列的内参探针序列。
4.如权利要求1所述，试剂盒所用内参探针可以是kqID No :5序列，其5’端标记JOE 或HEX荧光基团，3，端标记TAMRA或BHQ-I荧光淬灭基团。
5.如权利要求1、2和4所述，试剂盒所用引物探针也可以是和上述^^ID NO :2-5序列同源性大于85 %以上的序列。
6.如权利要求1所述，含有内参照的NDM-I基因检测试剂盒含有PCR缓冲液、荧光探针、Taq酶、内参、阴性对照和阳性对照、以及DNA提取液组分。
7.如权利要求1所述，试剂盒组分按照以下浓度配制成的反应液进行扩增反应 Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 2-0. 4mM、 MgCl2L 5-5mM、引物各 0. 2-0. 5 μ Μ, NDM-I 探针和内参探针各 0. 1-0. 5 μ M、Taq DNA 聚合酶 1-5U、UNG 酶 0. 1-1U。
8.如权利要求1所述的试剂盒，更具体地，其扩增反应液各成分终浓度为 Tris-HCl (pH8. 3) IOmM, KCl 50mM、明胶 0. lmg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0. 3mM、 MgCl23. 5mM、引物各 0. ；35 μ M、NDM_1 探针和内参探针各 0. 15yM、Taq DNA 聚合酶 1. 25U、UNG 酶 0. 2U。
全文摘要
本发明为一种利用荧光PCR检测新德里金属β内酰胺酶-1基因(NDM-1)和内参照核酸的试剂盒，它采用一对引物扩增NDM-1基因上的特异性保守区域，以人工构建含上述引物序列的DNA模板为内参照，分别用两种不同波长荧光标记的探针单管检测NDM-1基因和内参照DNA，从而判断样品中是否含有由NDM-1基因引起的抗生素多重耐药细菌的存在，或者是否有假阴性检测结果存在。试剂盒使用包括样品处理和扩增检测两个步骤，操作简便快速、灵敏度高、特异性强，可广泛应用于临床中由NDM-1基因引起的抗生素多重耐药细菌的快速检测。
文档编号C12Q1/68GK102533962SQ20101062192
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者吴大治, 夏懿 申请人:上海复星医学科技发展有限公司, 上海复星医药(集团)股份有限公司