专利名称：对多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法
技术领域：
本发明涉及一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，其为与由胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞诱导分化出心肌细胞时的心肌细胞的纯化有关的手段。
背景技术：
成体中的心肌细胞已经丧失增殖活性，为了治疗重症心肌梗塞、心肌症等疾患而不得不依赖心脏移植。然而，现状却是心脏供体不足的问题无法克服，找到心脏移植以外的治疗方法已成为当务之急。对此，预计在体外制作并纯化心肌细胞用其充当疾患治疗时心肌细胞的补充是用于救助不得不依赖心脏移植的心脏疾患患者的最有希望的方法。作为用于获得心肌细胞的方法，已知的是使干细胞(例如胚胎干细胞、各种成体干细胞(adult stem cell))分化后使用的方法、由胎儿取得的方法等。例如在使用小鼠的多能性干细胞的情况下从培养液去除抑制分化的因子(饲养细胞、白血病抑制因子(LIF) 等)、在人的多能性干细胞的情况下从培养液去除抑制分化的因子(饲养细胞、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子(TGF)等)，由此形成细胞块(胚状体)，从而可以积极地引发向心肌细胞的分化，这作为使干细胞分化的方法是已知的。体外的由干细胞分化为心肌细胞的方式部分承袭了活体内的生理发育阶段，尤其是就发育初期的事件而言，在由受精卵细胞发生的生理发育和体外的分化方式之间共通点很多。就体外分化为心肌细胞的系谱而言，与生理发育同样地，首先是干细胞分化为未分化的中胚层细胞，其一部分分化为编程性心肌细胞(前心脏中胚层)后，分化为心肌细胞。多能性干细胞是具有分化为构成脏器的所有细胞的能力的细胞，因此使其仅分化为心肌细胞在技术上较为困难。另一方面，由于将所有多能性干细胞一齐诱导至分化阶段也非常困难，因此胚状体中残存有未分化的干细胞是非常常见的。如上所述，在体外诱导干细胞分化为心肌细胞时，所有干细胞的情况下，均产生作为副产物的心肌细胞以外的细胞以及残存未分化的细胞等对临床应用遗留下有害性质。尤其是残存的未分化的细胞由于具有增殖活性且能分化为多种细胞，因此若治疗时移植至活体的细胞中残存未分化的细胞，则该未分化的细胞形成畸胎瘤的危险性极高。由这样的理由出发，难以将含有对多能性干细胞进行诱导分化而制作的心肌细胞的细胞群直接移植至活体而用于治疗。因此，为了安全地使用多能性干细胞来源的心肌细胞进行治疗、获得理想的治疗效果，需要找到彻底去除未分化的多能性干细胞且高度纯化心肌细胞的方法(即， 去除心肌细胞以外的细胞的方法)。目前，已知的纯化心肌细胞的方法是，预先在干细胞的基因(基因组)中导入某些标记基因(例如GFP)的方法(非专利文献1)。然而，这样的方法需要改变基因组，方法自身存在伦理上的问题且在细胞癌化率变化等安全性方面伴随着无法预测的巨大风险(非专利文献2~)。此外，还报道了采用改变基因的方法作为积极地去除未分化的多能性干细胞的方法(非专利文献幻。另一方面，报道了使用已知具有细胞死亡诱导作用的神经酰胺类比较特异地对胚胎干细胞诱导细胞死亡的方法(非专利文献4)。然而，该方法中，用神经酰胺类处理后进行培养的细胞组中残留了多达相当于多能性干细胞(OCT阳性细胞)未被处理(对照)时的1/3的量的多能性干细胞，并非是充分的去除方法。此外，对于人胚胎干细胞的去除而言，仅仅记载了发现发生细胞凋亡的细胞，而未记载能进行充分的去除。此外， 还报道了使用具有细胞毒性的抗体的方法(非专利文献幻，该方法中记载了在抗体处理后仍残存20%左右的胚胎干细胞。进而，就抗体的治疗性处理而言，利用该方法时存在避免抗原性等制约。由此，在诱导细胞死亡的公知方法中，能够用于心肌疾患的治疗的心肌细胞的纯化方法还具有改善的余地，期待一种效率更好的新的细胞死亡诱导方法。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Muller M, et al.，FASEB J. 2000 ；14 :2540-2548非专利文献2 =Schroder AR, et al.，Cell. 2002 ；110 :521-529非专利文献3 =Schuldiner M, et al.，Stem Cells 2003 ；21，257-265非专利文献4 =Bieberich E et al.，J Cell Biol. 2004 ；167 :723-734非专利文献5 :CH00 AB, et al.，Stem Cells 2008 ；26 :1454-1463.
发明内容
发明要解决的问题本发明课题在于，开发一种不改变基因且对胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡但不对心肌细胞诱导细胞死亡的方法。此外，本发明课题还在于利用这样的方法开发一种由多能性干细胞制作没有畸胎瘤的危险性的安全且高纯度的心肌细胞的方法。用于解决问题的方案本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过对多能性干细胞、非心肌细胞的培养条件添加未确认到物质毒性(physica 1 toxicity)和细胞死亡诱导作用的物质，从而构建了以短时间且非常有效地对心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，由此明确了不改变基因也能够解决上述课题。该方法由于不对心肌细胞诱导细胞死亡，因此也是有效的心肌细胞纯化方法。具体而言，本发明明确了 通过用具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而提供引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞进入细胞死亡的方法，由此能够解决上述课题。即，本申请发明具体涉及以下事项。(1) 一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的方法，其为用具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞进入细胞死亡的方法。(2)根据上述(1)所述的方法，用高渗液的培养进行2小时以上。
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(3)根据上述⑴或(2)所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液是通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制得的。(4)根据上述(3)所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液含有 0. 1 IM的糖质。(5)根据上述C3)或(4)所述的方法，糖质是糖醇类、糖类、或甜菜碱类。(6)根据上述( 所述的方法，糖醇类、糖类、或甜菜碱类选自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸组成的组。(7)根据上述⑷所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液含有 0. 1 0. 6M的丙三醇。(8)根据上述(7)所述的方法，培养进行10小时以上。(9)根据上述(1) (8)中任意一项所述的方法，用高渗液培养细胞群后，返回至具有200 300m0sm/kg的通常渗透压的培养液中进一步进行培养。发明的效果根据本发明的方法，通过对含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群进行处理，能够有效地去除细胞群中的未分化的多能性干细胞和非心肌细胞，且仅心肌细胞能够存活，因此能够有效地浓缩纯化心肌细胞。
图1表示胚胎干细胞(ES细胞)来源的心肌细胞和残存的未分化胚胎干细胞的免疫染色。图2表示在混入了胚胎干细胞来源的心肌细胞和残存的胚胎干细胞的培养体系中的甘露糖醇处理。图3表示对甘露糖醇处理后的细胞中的Nkx2. 5和0ct_3/4的免疫染色。图4表示0. 45M的甘露糖醇对小鼠胚胎干细胞的细胞死亡诱导作用。图5表示甘露糖醇对绒猴胚胎干细胞的作用。使用线粒体膜电位敏感性色素TMRM 对该细胞的生死进行了判定。图6表示甘露糖醇对绒猴胚胎干细胞的效果。图7表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的作用(FACS解析)。图8表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的效果(即刻)。图9表示甘露糖醇对人胚胎干细胞的效果(5小时后)。图10表示人胚胎干细胞胚状体的甘露糖醇处理。图11表示人胚胎干细胞细胞胚状体由于甘露糖醇处理所致的Oct-3/4阳性细胞的死灭。图12表示甘露糖醇对人诱导多能性干细胞(iPS细胞)的作用(FACS解析)。图13表示甘露糖醇以外的各种糖质对人胚胎干细胞的细胞死亡诱导作用。图14表示丙三醇对人胚胎干细胞来源的心肌、非心肌细胞的作用。图15表示用含有0. 2M甘露糖醇的培养液处理了 48小时或72小时的细胞的状态。下半部分表示各个集落的放大像，图中示意出代表性的细胞形态。
具体实施例方式本发明人等发现了如下事实对含有胚胎干细胞、心肌细胞、非心肌细胞的混合细胞系使用溶解了高浓度的甘露糖醇的高渗液时，通过暴露于高渗液，胚胎干细胞和非心肌细胞容易发生细胞死亡。对该见解，更详细地研究了甘露糖醇浓度、在甘露糖醇中的暴露时间与胚胎干细胞及非心肌细胞的细胞死亡间的关系，结果获知在低浓度的甘露糖醇中长时间暴露可有效地对胚胎干细胞和非心肌细胞诱导细胞死亡，在几乎饱和的浓度即IM下短时间即可诱导胚胎干细胞的细胞死亡。同时获知，在所有浓度下均存在既是引起胚胎干细胞和非心肌细胞发生细胞死亡的浓度、时间又不会对由胚胎干细胞分化出的心肌细胞诱导细胞死亡的条件。由此，基于那样的条件进行培养的本发明的方法为有效地去除胚胎干细胞和非心肌细胞的方法，同时也是有效的心肌细胞浓缩纯化的方法。因此，本发明的一个方式中，提供一种用具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有未分化的多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞进入细胞死亡的方法。据称，对于小鼠胚胎干细胞而言，在使用胚状体形成法诱导分化时，在分化诱导开始后3 6天的胚状体中包含中胚层乃至编程性心肌细胞。此外，出现心肌细胞是在分化开始后第7天(人的胚胎干细胞的情况下是第10天)。胚状体中除上述以外还包含未分化细胞、内皮上皮样细胞、神经细胞等。对构成胚状体的细胞进行更详细研究的话，构成胚状体的细胞群中，7 8成为心肌细胞以外的分化细胞，其中有时还包含未分化的胚胎干细胞。这些杂细胞旺盛地增殖，随着时间的经过其存在比例将增加。本发明人等发现，通过使具有这样的细胞构成的胚状体在培养液中暴露于适当范围的高渗透压下，从而引起胚状体中残存的胚胎干细胞、心肌细胞以外的分化细胞发生细胞死亡。此外，本发明人等发现，即使在该条件下培养时，心肌细胞也不出现细胞死亡，通过置换为生理性渗透压培养液可恢复自主搏动。在本发明的方法中，作为细胞的供给源，只要是含有心肌细胞的细胞群，则可以是任意的供给源来源的细胞群，例如可以使用包含使用公知的心肌细胞诱导条件由多能性干细胞(包括胚胎干细胞(ES细胞)、活体干细胞、诱导多能性干细胞(iPS细胞)等)分化获得的心肌细胞的细胞群、胎儿组织来源的细胞群，来实施本发明的方法。含有如上所述地由多能性干细胞分化获得的心肌细胞的细胞群中，除了多能性干细胞来源的心肌细胞以外， 还可以含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞。本发明的方法特征在于，用具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液培养该细胞群。本发明的方法中使用的渗透压对心肌细胞以外的细胞(多能性干细胞和心肌细胞以外的分化细胞)诱导细胞死亡，但不对心肌细胞诱导细胞死亡。这样的渗透压为370m0sm/ kg 以上、优选 370m0sm/kg 1600m0sm/kg、更优选 370m0sm/kg 1000m0sm/kg、进而优选 480m0sm/kg 1000m0sm/kg、最优选700m0sm/kg 1000m0sm/kg。与通常体外培养条件下的渗透压为200 300m0sm/kg左右(也称为通常的渗透压或生理性渗透压)相比，这些值是非常高的，在该条件下培养时心肌细胞以外的细胞会死灭。使用通过对培养液添加糖质而制作的具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液时，本发明的方法特征在于，在该高渗液中的培养进行2小时以上、优选2 72小时、更优选2 48小时、进而优选2 24小时、最优选4 12小时。本发明的方法中，能够仅对包括人ES细胞、iPS细胞在内的未分化的多能性干细胞、或心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡的条件由高渗液的渗透压程度和细胞在高渗液下的暴露时间的关系决定。即，与用于诱导心肌细胞而使用的细胞物种无关，高渗液的渗透压越高则细胞在高渗液下的暴露时间可以越短，另一方面，若将高渗液的渗透压设定为较低则需要相应地延长细胞在高渗液下的暴露时间。本发明的方法中，在高渗液中暴露细胞群时可以引导心肌细胞以外的细胞(未分化的多能性干细胞或非心肌细胞)进入细胞死亡(即，诱导细胞死亡或提供细胞死亡的信号)。这样被引导进入细胞死亡的细胞在高渗液中发生细胞死亡或在由高渗液返回至通常的培养液后发生细胞死亡。本发明的方法中的细胞死亡由于是使细胞暴露于生理性应激而诱导的，因此不会对幸存细胞带来基因性的损伤，可以仅对目标细胞以外的细胞诱导细胞死亡，从这点来说与通过直接给基因带来损伤的物理性条件(放射线应激、氧化应激等)、化学性条件(化合物应激)来诱导细胞死亡相比是非常优选的。其原因在于，就能耐受生理性应激而幸存的细胞而言，通过返回至去除了用于诱导其细胞死亡的生理性应激的培养条件，能够再次恢复原本的细胞机能，发挥正常的机能。该特征非常易于利用在将离体制备的组织或构成组织的细胞移植至体内而进行再生的医疗现场中。本发明中言及具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液时，是指不影响细胞的代谢、仅使渗透压为370m0sm/kg以上的高渗液，例如作为例子可以列举出通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制备的高渗液。作为本申请发明中可以使用的糖质的例子，可列举出不影响细胞的代谢且可以提高培养液的渗透压的糖质，即作为可以添加到本发明的培养液中的糖质的例子，可以列举出例如糖类(单糖类、寡糖类、多糖类)、粘多糖类、氨基糖苷类、糖醇类或甜菜碱类，但并非限定于此。更具体而言，可以列举出表1所述的物质。表 权利要求
1.一种对多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞诱导细胞死亡的方法，其用具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液培养含有多能性干细胞、多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞的细胞群，从而引导多能性干细胞和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的细胞进入细胞死亡。
2.根据权利要求1所述的方法，用高渗液的培养进行2小时以上。
3.根据权利要求1或2所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液是通过对培养液添加糖质(碳水化合物)而制得的。
4.根据权利要求3所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1 IM的糖质。
5.根据权利要求3或4所述的方法，糖质是糖醇类、糖类、或甜菜碱类。
6.根据权利要求5所述的方法，糖醇类、糖类、或甜菜碱类选自甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、丙三醇、蔗糖、葡萄糖和三甲基甘氨酸组成的组。
7.根据权利要求4所述的方法，具有370m0sm/kg以上的渗透压的高渗液含有0.1 0. 6M的丙三醇。
8.根据权利要求7所述的方法，培养进行10小时以上。
9.根据权利要求1 8中任意一项所述的方法，用高渗液培养细胞群后，返回至具有 200 300m0sm/kg的通常渗透压的培养液中进一步进行培养。
全文摘要
本发明课题在于，开发一种不改变基因且对胚胎干细胞、诱导多能性干细胞等多能性干细胞、和多能性干细胞来源的心肌细胞以外的分化细胞诱导细胞死亡但不对心肌细胞诱导细胞死亡的方法。本发明通过对多能性干细胞、非心肌细胞的培养条件添加未确认到物质毒性和细胞死亡诱导作用的物质，从而构建了非常有效地对心肌细胞以外的细胞诱导细胞死亡的方法，由此明确了不改变基因也能够解决上述课题。
文档编号C12N5/07GK102449139SQ201080023990
公开日2012年5月9日 申请日期2010年3月29日 优先权日2009年3月30日
发明者服部文幸, 福田惠一 申请人:学校法人庆应义塾, 第一三共株式会社