专利名称：用于处理植物体细胞胚的分离器设备、沉积设备和系统的制作方法
用于处理植物体细胞胚的分离器设备、沉积设备和系统
背景技术：
对问题领域的总体介绍植物中的体细胞胚发生(somatic embryogenesis)是由初始外植体形成体细胞胚的过程，其中所述外植体为植物组织中的细胞。所形成的体细胞胚是与提供初始外植体的植物基因相同的拷贝。因此，体细胞胚发生的过程提供了一种获得大量基因型相同的植物的手段，以增殖具有商业利益的所选基因型、保存濒危物种或为研究目的而生成基因相同的植物体。 与该问题相关的程序的生理学背景如下所述并如图I所示，为了从针叶树的体细胞胚制备植物，实施多步程序以满足不同发育期的生理学需要。体细胞胚发生的启动始于在含有植物生长调节剂的固化培养基上将初始外植体诱导为体细胞胚，通常为未成熟的合子胚。通常在相同成分的培养基上持续形成体细胞胚，并形成増殖的胚发生培养物。在増殖期，出现通常视为对体细胞胚发生过程有利的几个关键特征(i)通过未成熟胚发生组织的无限増殖来大量繁殖基因型相同的繁殖体；(ii)増殖胚胎的低温储存可实现克隆几乎永久的储存，即，建立克隆库，(iii)未成熟体细胞胚的转基因改造允许基因改良的繁殖体的大規模繁殖。在该程序的下ー个步骤中，将增殖的体细胞胚经受培养基，其引发胚发育以进入成熟期。培养基中仅有部分増殖胚胎发生从増殖到成熟的转化。低转化率会更频繁地发生在来自顽拗型针叶树种的基因型中，但在所有针叶树种以及其它植物物种中是常见的。随着转化率的下降，收集胚胎所需的体力劳动增加，因此成本和污染风险及其它误差増加。从增殖到成熟的低转化率是商业大规模应用体细胞胚发生程序的主要瓶颈。为了萌发，在许多不同的步骤中使成熟的体细胞胚经历不同的培养方法以诱导根和芽的形成；脱水，蔗糖处理，红光诱导，和蓝光刺激。此后，将认为适当发育的萌发胚胎转移至堆肥材料中并逐渐转移至离体环境中，在此期间蔗糖含量降低。在萌发成植物的过程中的不同处理需要手工重复处理各个芽和植物，为整个程序增加了相当大的成本。从体细胞胚制备植物使用体细胞胚制备植物的现有技术的程序在多个步骤需要手工处理，使得程序耗时、昂贵并且不准确。对于针叶树种，当需要手工处理时，所使用的标准程序涉及多个步骤。一般程序概述于图 I 中(见例如 von Arnold S, Clapham D. Spruce embryogenesis. 2008. MethodsMol Biol. 2008 ；427 :31-47 ；Belmonte M F, Donald G, Reid D M, Yeung E C 和 StasollaC. 2005. Alterations of the glutathione redox state improve apical meristemstructure and somatic embryo quality in white spruce (Picea glauca). J Exp Bot，Vol. 56，No. 419，pp.2355-2364)。如图I所示，有四个依赖人工处理以从成熟体细胞胚中获得小型植物的步骤。第一次人工相互作用是当[I]将成熟胚从未成熟胚120中分离，并在无菌条件下水平置于塑料容器中；第二次[2]发生在休眠3-7天后130，然后将成熟胚胎转移至胶凝的培养基中以引发萌发过程。在合适的培养基成分和光照条件下，萌发的体细胞胚开始生根140。第三次人工转移[3]是当芽形成有小根吋，将其转移至直立位置并将根部分地浸在液体萌芽培养基150中。第四次[4]和末次转移是当萌发的胚胎具有主根和小侧根时，将其转移至罐中的固体基质中以进ー步形成植物160。表I.关于图I的标号列表
100成熟胚胎
101成熟胚冠102成熟胚足
103成熟胚冠的宽度
104成熟胚胎的长度120 成熟期
130休眠期
140萌发期
150体外(in vitro)植物形成期
160离体(Ex vitro)植物形成期迄今为止在从体细胞胚制备植物的可用方法中，均通过人工从未成熟的胚性组织中挑出胚胎。这耗时并且效率低下。现有技术US06684564和US7568309教导了通过使用视觉系统、传送带和具有吸头的自动机械臂代替人眼、人的手臂和镊子，从而像人所做的那样从多孔传送带中拾取胚胎并沉积在目的位置。然而，该方法类似于通过用于飞行的机械翼使鸟类翅膀的运动自动化，由于若干如下所述的原因，所以是非常复杂并不切实际的。因此，希望提供使胚胎的分离和沉积更快和更高效的简单实用的方式。所制备的成熟体细胞胚最初与未成熟胚性组织以集群(cluster)的方式粘在一起。由于首先必需通过破碎集群而使集群中的胚胎与未成熟胚性组织分离，所以使得处理更加复杂。现有技术未教导如何以自动化方式破碎胚性集群。通过分散器破碎集群在专利申请PCT/US09/39981中公开了快速破碎集群的方法，其将所述集群悬浮于液体介质(诸如水)中，井迫使集群进行至少ー种分散程序，其中使胚性细胞团暴露于流体动力，导致集群的破碎和各个胚胎的分散。通过分离器分离胚胎当根据上述方法所述将胚性细胞团分散于液体中时，未成熟和成熟胚胎及未成熟胚性组织的混合物悬浮于液体介质中。在许多应用中，非常期望在进ー步下游处理之前从分散的胚性细胞团中分离并收集胚胎。例如，如果g在对胚胎成像并分析胚胎的形状和条件，诸如Harrell 等，1993 (Computers and Electronic in Agriculture, 9),则非常期望悬浮在液体中的仅有胚胎而没有任何未成熟胚性组织以避免使图像模糊。如果图像中包含多个对象而不仅仅是胚胎，那么图像识别和分析的任务将更加困难和冗长。此外，图像处理的任务将会更加耗时并对处理和转化率具有不良影响。因此需要用于有效的分离器的方法和装置以从分散的胚性细胞团中仅将胚胎分离和选择性去除并以快速有效的方式引导进入独立液流。液流中仅具有各个胚胎将有助于对胚胎的进ー步处理，该处理包括对各个胚胎的数字成像、对胚胎的图像分析和表征(其包括在沉积到用于萌发和制备植物的合适基质中之前识别并控制胚胎定向)。本发明的ー个目的是提供自动化装置以从未成熟胚性组织中将分散的体细胞胚温和地隔离和分离，并以快速有效的方式将所收集的胚胎引导进入独立液流中。胚胎沉积装置
现有技术中从体细胞胚制备植物的方法需要密集的人工处理，因此对于植物制备来说是昂贵的。由于所开发的借助移动部件(诸如传送带和精细机械臂)使胚胎的人エ转移和传送自动化的设备较复杂，使得对人工操作中的步骤进行自动化的尝试失败。例如，现有技术文件US7568309和US6，684，564教导了将胚胎转移至人工种子中的装置，其借助多孔传送带和装备有吸头的移动机械臂从传送带中拾取胚胎，并借助连接于轨道的可移动机械臂将胚胎沉积于人工种子中。该过程需要许多移动部件(诸如滑轮或马达)来驱动传送带、抽吸装置以将胚胎中多余的液体真空吸出，并需要可移动地连接于轨道的精细机械臂部件，所述精细机械臂部件通过精确控制以定位并从传送带中拾取胚胎。胚胎是小而脆弱的物体，机械臂必须具有敏感而精确的装置以拾取并携带胚胎而不损坏胚胎。如US6, 684，564中所解释，当检测胚胎时传送带必须停止移动以对胚胎进行成像并借助机械臂的机械装置拾取胚胎。当毎次检测胚胎时需要运动和停止的传送带将产生固有的低效率过程。通常，现有技术教导了ー种方法，其需要包括传送带和机械臂部件的许多移动部件，使得目前的技术状态不可行。因此，本发明的ー个目的是提供有利的方法和设备以将胚胎传送至期望的胚胎接收器中，而不需要任何滑轮、传送带、机械臂或具有移动部件的此类设备。系统本发明的另ー个目的是提供用于处理植物体细胞胚的系统，以进行分离过程和整个过程中的至少ー个附加处理步骤来将其从生物反应器分离至移植的繁殖体，以提供具有成本效益的手段以处理体细胞胚并从体细胞胚发生大規模制备植物。定义出于本文的目的，术语“体细胞胚”、“胚胎”和“植物体细胞胚”可互換地使用。这些术语是指来自植物体细胞组织的成熟或未成熟的植物胚胎。术语“胚性细胞团”是指由存在于体细胞胚胎的液态或固态培养物中的未成熟胚性组织、或成熟胚胎和未成熟胚性组织组成的植物物质的总称。术语“未成熟胚性组织”是指胚性细胞团中除胚胎以外的所有物质。术语“组织”在本文件以非传统方式使用并由主要未分化的细胞组成，且不应与通常所指的具有特化细胞的植物组织混淆。术语“胚性集群”、“胚集群”或“集群”可互換地使用。该术语是指植物胚性细胞团的集合，其在固态介质上或在液态介质中被保持在一起而成为尺寸有限的连续固态物质。“挪威云杉”为原产于欧洲的云杉物种，拉丁名为Picea abies。极坐标的“正交方向”由轴向(Z)、径向(r)和角(或方位角)(Θ )方向构成。这些方向相当于圆柱体的中心轴线，其为圆柱体的圆形横截面的法线。径向和角方向分别沿横截面上的半径和半径的法线。“轴对称流”是指在横截面始终为圆形的管内的流，并且因此该流动关于管的轴线对称。換言之，沿角(或方位角)方向无任何改变。“压カ梯度”是指相对于给定轴向的压カ变化率。
“轴向、径向、角向压カ梯度”是指沿轴向、径向和角方向的压カ(P)的变化，在数学上分別显示为偏导数I,ま,—。本文所使用的术语“涡旋”(Vortex，复数形式为Vortices)是指具有涡流强度的流动，其具有围绕中心轴线的旋转或涡旋运动。涡流可分为自由(无旋转)涡旋或強制(旋转)涡旋。如本文所使用，术语“涡流强度”在数学上是指速度矢量场的旋度；因此，其为具有大小和方向的矢量。或者说，流中一点的涡流强度的值与在流场中一点的流体粒子的旋转速度有夫。本文所使用的术语“自由涡旋”是指这样的涡流，即，在该涡流中，在流中除了中心轴线附近之外的各处，流围绕轴线旋转的同时流体粒子保持其方向(即，涡流强度为零)(用数学术语来说是存在奇点)。放置与流体粒子一起称动的假设箭头，在箭头与流围绕轴线旋转的同时，箭头持续指向相同的方向。理想的无旋转汇流涡流(下沉涡流，sinkvortex)可为自由润旋的实例。本文所使用的术语“汇流涡流”是指在排流区域附近产生的实际流场，所述排流可以由任何方式产生，包括通过重力的向下自然排流或由压カ差或其它方式产生的沿任意方向的排流。本文所使用的术语“强制涡旋”是指流体以固体(solid-body)旋转移动的涡流；是指在流中无剪切力，并且因此涡流強度在各处恒定并等于2 ζ，其中ζ为旋转速度。在强制涡旋中，指向旋转线轴并附在流体粒子上的假设箭头在围绕轴线旋转的同时持续指向旋转轴线。“子叶”为植物胚胎100的一部分，其将成为幼苗的首片胚叶。子叶位于植物胚胎的一端处，该端与最終形成根(足102)的一端相対。当有多个子叶时，它们可能会形成称为冠101的结构。“冠的直径”是指冠结构在其最宽处的直径103。“植物胚胎的长度”是指沿胚胎的纵轴所测量的从根端的末端到子叶端的末端的直线距离104。术语“管”、“通道”和“流动通道”可互換地使用。除非另有明确规定，使用这些术语时不具体指代任何特定的横截面的几何形状。
术语“流体动力学”和“流体力学”可互換地使用，井指代流体流动的相同物理原理。“应变”为变形的几何度量，其代表实体中的点之间的相对位移；将其表示为变形相对于原始尺寸的比率或百分比。“法向应变”定义为沿材料线元拉伸量或压缩量的比率或百分比(在变形方向上，变形与原始长度的比率)。“剪切应变”定义为变形量相对于原始尺寸的比率或百分比，其与材料平面层的相 互滑动有夫。“伸长应变”为元素拉伸的法向应变。“轴向伸长应变”为沿轴向拉伸的元素。“径向伸长应变”为沿径向拉伸的元素。“压缩应变”为元素收缩的法向应变。“轴向压缩应变”是指沿轴向收缩的元素的变形。 “径向压缩应变”是指沿径向收缩的元素的变形。“应变率”是应变相对于时间的改变。“水力直径”，Dh，是用于表征在非圆形管和通道中的流动的术语。根据定义，其由Dh, = 4A/S表示，其中A为非圆形管或通道的横截面积，并且S为横截面的湿周。通道中的“平均速度”定义为体积流速除以通道的横截面积。“收缩比”定义为通道中出口处的平均速度与入口处的平均速度之比。“平均应力”是在表面上的平均的应カ。“平均应变率”为在表面上的平均的应变率。流体的“动カ粘度”是剪切应カ与剪切应变率之比，在牛顿流体中为ー常量。牛顿流体的实例为水、甘油、硅油。“应变率分布图”为显示应变率变化的轮廓图(profile)。长度单位毫米缩写为“mm”。应变率单位为秒的倒数，缩写为“1/s”。通常，具有较高平均应变率的流可对悬浮于流体中的粒子(或胚胎)或粒子集群(或胚胎集群)施加较高的平均应力。术语“边界层”、“粘性边界层”、和“薄边界层”可互換地使用，是指在汇流边界层存在或不存在的条件下，由圆形容器内的強制旋转的流形成的边界层。
图I示出了制备体细胞植物胚胎的一般过程。图2示出了本发明分离设备的某些实施方式的某些细节的构造。图3示出了本发明分离设备的某些实施方式的顶视图和底视图。图4示出了在操作A之前和在操作B过程中，内部分离容器5中的液体水平。图5示出了进料管出口 14a、14b、14c的不同的其它实施方式。图6示出了旋转装置18a、18b的不同的可替换实施方式。图7示出了适于持续使用的本发明所述分离设备的实施方式。A和B示出了用于调节流经管道7的可替换装置。图8示出了在操作期间与边界层相关的二次流。图9示出了自动化系统的实施方式，其公开了操作単元。图10示出了完全集成的自动化系统，其包括本发明的单元，正如实验部分所验证的。图11示出了用于萌发和萌发单位的沉积。图12示出了定向胚胎的沉积。
图13为轴对称分散器单元的图示。图14为非轴对称分散器单元的图示。图15a_f为探测器-分选器-定向单元的图示。表2.与图有关的标号列表I 壳体框架2 顶部支撑结构3 底部支撑结构4 外部容器5 分离器容器6 分离器容器的底壁7 分离器容器的导管8 传感器9 进料导管10 分离器容器5的轴向中心11 空心轴12 空心轴马达13 上游容器14 进料导管9的出口15 外部容器的液体阻隔件16 外部容器中的开ロ17 外部容器排流管18 旋转装置19 基座块20 边界层21 开始时分离器容器中的流体水平22 操作期间分离器容器中的流体水平25 第二出口30 容器5的第三出口31 分离器容器5排流管32 抽取管33 抽取管的底端34 顶部支撑结构中的孔
35线性驱动器阀，诸如夹管阀、闸式阀、旋转喂料阀或针阀、或一组这些36阀(可选)37排流阀(可选)38控制单元(可选)50管道7的圆形实施方式的内径51分离器容器5的圆形实施方式的内径52旋转装置18a的实施方式的内径
53旋转装置18b的实施方式的直径54分离器容器5的高度200生物反应器205处理植物体细胞胚的系统210胚性集群的抽取215胚性集群的转移220分散器225分散胚性细胞团的转移230分离器233未成熟胚性组织的转移235分离胚胎的转移240稀释器245稀释胚胎的转移247分选器贮液器249检测部分250检测器-分选器-定向系统255定向胚胎的转移260胚胎接收器中的定向成熟胚胎的沉积263流体和被剔除(rejected，拒绝)的胚胎265接受的成熟胚胎的转移270萌发280育苗290稀释流体300具有胚胎容器的板305板中的穿孔310剔除贮液器312胚胎收集器313步进马达/开关315x-/y_工作台的线性驱动器320基质325基质中的腔
330胚胎容器之间的打开空间335胚胎容器之间的连接器340胚胎容器345胚胎容器中的穿孔350缩窄部孔360自由喷射流的长度365出口370出口 365之前的管的平直段
375流体和定向胚胎的流动方向380管直径381包封液体382包封液体传送喷射流383a传送喷射流内的定向胚胎383b不稳定传送喷射流内的胚胎385基本稳定的传送喷射流386基本不稳定的传送喷射流387传送包封液体的容器(管)388内部传送管401轴对称通道的节段402轴对称通道的节段403至440 根据表5的尺寸441连接管481非轴对称通道的节段481a481 的横截面482非轴对称通道的节段482a482 的横截面442to490根据表6的尺寸501流体入口502入口管503流体出口504出口管505贮液器管506贮液器设备507交叉部508入口阀(可选)509出口阀(可选)510定向检测器511贮液器管检测器(可选)512出口管检测器(可选)
518流动方向519三通交叉阀(可选)521第二目标板(可选)522第二出口管(可选)523第二交叉部(可选)524液体排放(可选)
·
530交叉阀的入口/出口开ロ531交叉阀壳体532交叉阀转动体533交叉阀转动体流动通道534入口/出口的直径540x，y_可移动工作台装置(可选)541用于将出口管进行x，y_移动504的设备(可选)550第二交叉部523处的三通阀(可选)560通向贮液器设备的管进气ロ /出气ロ(可选)561 进气ロ/出气ロ(可选)562 空气过滤器(可选)表5.与图13有关的标号的尺寸列表
横截面位置内径[mm]用于挪威云杉的优选内径
(403)3.0-10.09.0-9.5
(404)2.0-9.05.0-5.5
(405)3.0-10.09.0-9.5
(406)2.0-9.04. 75-5.0
(407)3.0-10.09.0-9.5
(408)2.0-9.04.0-4.25
(409)3.0-10.09.0-9.5
(410)2.0-9.05. 5-6.0
(411)2.0-9.05. 75-6.0
(412)1,0-8.03.25-3. 5
(413)2.0-9.05. 75-6.0(414)I 1,0-8.0「3.0-3.25
(415)2.0-9.05. 75-6.0
(416)1,0-8.02. 5-2.75
(417)2.0-9.05. 75-6.0
(418)1,0-8.02. 5-2.75
(419)2.0-9.05. 75-6.0
(420)2.0-9.05. 75-6.0 细节的长度长度[皿！]
(421)30，O
(422)10，O
(423)30，O
(424)5，O
(425)30，O
(426)5，O
(427)20，O
(428)10，O
(429)20，O
(430)30，O
(431)5，O
(432)30，O
(433)5，O
(434)30，O
(435)5，O
(436)Γ 30, O Γ
(437)5，O
(438)20，O
(439)10，O (440)10，O表6.与图14有关的标号的尺寸列表示例性的内部横截面尺寸
f内部截面「 内部尺寸 |_ ボ，箭十侧 |~宽度侧
的形状[mm] _^483 一、_ [mm]
Alt. I Alt. 2 Alt. I Alt. 2 Alt. I Alt. 2
(442)圆形 9,5 9,5
(483)'
(443)矩形____(483) 5,0 4,75 9.5 9,5
(444)圆形 9,5 9,5_____
(445)矩形____(484) 9,5 (484) 9,5 5,0 4,25
丄446) 圆形 9,5 9,5_
(485)
(447)矩形____(485) 5,0 3,75 9,5 9,5
(448)圆形 9,5 9,5_____
(449)矩形____(486) 9.5 (486) 9,5 5,0 3,5
(450)圆形 9,5 9,5_____
(451)圆形 6,0 6,0_____
(452)_圆形 6,0 6,0
-(487)-
(453)矩形____(487) 3,5 3,25 6,0 6,0
(454)圆形 6,0 6,0_____
(455)矩形____(488)6,0 (488)6,0 3,5 3,25
(456)圆形 6.0 6,0_____
_(489)
(457)矩形____(489) 3,5 2,75 6,0 6,0
(458)圆形 6.0 6,0_____
(459)矩形____(490) 6,0 (490) 6,0 3,5 2,75
(460)「圆形「6,0[ 6,0 |~_]_[ I_
发明内容
在第一个方面中，本发明提供了ー种将悬浮于流体中的胚胎与未成熟胚性组织彼此分离的装置，包括a)分离器容器5，其在操作期间含有密度低于待分离的胚胎的密度的流体，所述容器基本为圆柱形，具有基本平坦的底壁6和基本竖直的轴线，并包括位于底壁6的轴向区域处、与容器的内侧相连通的管道7 ;b)在流体中引发相对于底壁6的轴对称旋转流动的装置，由此在操作期间i)在底壁6处产生粘性边界层20 ；
ii)在分离器容器5中产生径向压カ梯度；c)将待分离的悬浮于流体中的胚胎和未成熟胚性组织引入到存在于分离器容器5中远离底壁6的位置处的装置，由此在操作期间i)使胚胎的沉淀快于未成熟胚性组织；ii)使胚胎进入粘性边界层20而未成熟胚性组织基本上保持在粘性边界层20外部;iii)将进入粘性边界层20的胚胎吸取到底壁6的轴向区域中和管道7中；以及d)从管道7中收集胚胎的装置；由此使所收集的胚胎与未成熟胚性组织基本分离。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，管道7的放置和尺寸使得在操作期间被吸取到底壁6的轴向区域中的胚胎通过重力沉淀进入到管道7中。优选地，第一个方面的设备为这样的设备，其中，收集胚胎的装置包括从管道7收集胚胎而基本不改变容器中的流体体积的装置。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，从管道7中移除胚胎而不改变容器中的流体体积的装置包括阀或ー组阀36。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，i)设备包括从管道7中排出流体的装置，由此在操作期间在底壁6的轴向区域处产生汇流涡流；以及ii)收集胚胎的装置包括在从管道7排出的流体中的汇流涡流中收集胚胎的装置。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，设备适于分批操作，并进一歩包括在胚胎已发生沉淀之后但在未成熟胚性组织有时间发生沉淀之前的时间段期间选择性地收集胚胎的装置。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，设备适于连续操作，并进一歩包括分离器容器5以及以超过流体从管道7中流出的速度的速度(优选为2-100倍的范围，更优选为5-20倍的范围)将流体供应到分离器容器5中的装置，分离器容器包括位于分离器容器5的顶部处的第二出ロ 25。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，通过在顶部处开ロ的分离器容器5来实现第二出口 25。
优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，从汇流涡流中收集胚胎的装置包括收集离开管道7的流体的装置。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，设备附加地包括更换分离器容器5中的流体的装置。优选地，第一个方面的装置为这样的装置，其中，设备包括在操作期间将流体从底壁6的轴向区域排出的装置，该装置包括从上方或任何其它方向延伸到到底壁6的轴向区域附近的导管。第一个方面的设备可优选包括分离器容器5，分离器容器的直径为5-30cm，更优选 10-25cm，10-25cm 或 18_22cm，最优选约 20cm。第一个方面的设备可优选包括流体管道7的面积为底壁6的面积的O. 01 % -10 %，更优选O. 01-1%，更加优选O. 1-0. 15%，最优选约O. 125%。
第一个方面的设备可优选包括引发轴对称旋转流动的装置，其在流体中产生的转速在5_1200rpm的范围，更优选30至360rpm。第一个方面的设备可优选包括引发轴对称旋转流动的装置，其包括旋转盘形或圆柱形物体。第一个方面的设备可优选包括引入胚胎和组织的装置，其在操作期间位于流体的表面附近的轴向位置处。第一个方面的设备可优选包括保持静态流体高度的装置，所述高度为分离器容器5的直径的O. 1-10倍，更优选O. 8-2倍。在本发明的第二个方面，提供了ー种将悬浮于流体中的胚胎与未成熟胚性组织分离的方法，包括以下步骤a)提供合适的分离器容器5，所述容器包含密度低于待分离的胚胎的流体，基本为圆柱形，具有基本平坦的底壁6和基本竖直的轴线；b)在流体中引发相对于底壁6的轴对称旋转流动，从而i)在底壁6处产生粘性边界层20 ;以及ii)在分离器容器5中产生径向压カ梯度；c)将待分离的悬浮于流体中的胚胎和未成熟胚性组织引入到存在于分离器容器5中的流体中远离底壁6的位置处，从而i)使胚胎比未成熟胚性组织更快地沉淀；ii)使胚胎进入粘性边界层20，同时不允许未成熟胚性组织进入粘性边界层20 ；iii)将进入粘性边界层20的胚胎吸取到底壁6的轴向区域中；以及d)从底壁6的轴向区域收集胚胎，由此使所收集的胚胎与未成熟胚性组织基本分离。优选地，上述步骤a)所提供的设备进一歩包括在操作期间在底壁6的轴向区域处与容器中的流体相连的管道7，并且所述方法进ー步包括以下步骤通过从所述管道7中排出流体而在底壁6的轴向区域处产生汇流涡流；以及从底壁6的轴向区域在由管道7排出的流体中收集胚胎。优选地，上述步骤a)所提供的设备进一歩包括合适的分离器容器5，分离器容器进ー步包括在操作期间在底壁6的轴向区域处与容器中的流体相连通的管道7，其中管道7的放置和尺寸使得在操作期间被吸取到底壁6的轴向区域中的胚胎通过重力沉淀进入管道7 ;并且所述方法进ー步包括从所述管道7中收集胚胎。更优选地，所述方法进ー步包括通过引导流体流经管道7进入分离器容器5中而调节管道7中胚胎的沉淀速度的步骤。第二个方面所述的方法可优选地适于分批操作，并进一歩包括在胚胎已发生沉淀之后但在未成熟胚性组织有时间发生沉淀之前的时间段期间选择性地收集胚胎。适于分批操作的第二个方面所述的方法还可优选附加地包括在处理ー批胚胎之后通过新鲜流体更换分离器容器5中的流体的步骤。第二个方面所述的方法可优选地适于连续操作，其包括以超过流体从管道7中流出的速度的速度(优选为I. 1-1000倍，更优选2-100倍，更加优选2-50，2-30, 3-20或5_15倍，最优选约10倍)将流体供应到分离器容器5中。 第二个方面所述的方法可优选地包括通过使胚胎进入离开管道7的流体中、并收集包含胚胎的流体来进行胚胎的收集。在第三个方面，提供了ー种将悬浮于流体的植物胚胎沉积在胚胎接收器中并同时保持胚胎的定向的方法，包括以下步骤i)提供合适的胚胎接收器340，胚胎接收器具有将流体从接收器中排出的装置345,350 ；ii)提供流动通道，流动通道的尺寸使得胚胎可与流经通道的流体一起行迸，但是由于尺寸的限制被约束于向冠首或冠尾方向行进，流动通道具有出口 365，其中流动通道包括紧邻出ロ 365上游的流动通道段，该流动通道段具有长度至少等于流动通道380的最大横截面内部尺寸的平直段370;iii)将胚胎(优选地具有期望定向的胚胎)置于流动通道中；以及iv)使从出ロ 365流出的流体形成自由喷射流385和386、将自由喷射流对准胚胎接收器340、并通过将自由喷射流用作运载工具而将胚胎从流动通道沉积到接收器中。第三个方面所述的方法优选地进ー步包括以下步骤i)确定流动通道中的胚胎的定向；ii)在定向与期望方向不匹配的情况下，将胚胎远离胚胎接收器340引导；以及iii)在定向与期望方向匹配的情况下，将胚胎引导到胚胎接收器340中。在本发明的第四个方面，提供了ー种用于沉积悬浮于流体的植物胚胎而同时保持胚胎的定向的装置，包括i)流动通道，其尺寸可使胚胎与流经通道的流体一起行迸，但由于尺寸的限制而被约束于向冠首或冠尾方向行进，流动通道流出至出口 365 ；ii)胚胎接收器340 ；以及iii)使从出口 365流出的流体形成自由喷射流370的装置，其中，在操作期间将自由喷射流对准胚胎接收器340，从而将悬浮于流体中的胚胎沉积在胚胎接收器340中；其中，形成自由喷射流的装置包括紧邻出ロ 365上游的流动通道380段，该流动通道段具有长度至少等于流动通道380的最大横截面内部尺寸的平直段370。第四个方面的设备可优选地设计成使得平直段的长度为流动通道380的最大横截面内部尺寸的至少10倍。
第四个方面的设备可优选地设计成使得在操作期间将出ロ 365末端定位成离胚胎接收器340 —至三个流动通道直径。第四个方面的设备可优选地设计成使得胚胎接收器340具有用于沉积胚胎的开ロ，开ロ的最小尺寸比待沉积的胚胎的最大横截面直径大至少10 %。第四个方面的设备可优选地进ー步包括使传送胚胎的喷射流稳定的装置，该装置包括将传送胚胎的喷射流包封在具有更大直径的另一流体喷射流中的装置。在本发明的第五个方面中，提供了ー种用于处理悬浮于流体中的植物胚胎的系统，包括根据本发明第一方面的分离器装置、以及以下中的至少ー个a)位于分离器装置的上游的用于分散悬浮于流体中的胚胎和胚性组织的分散器単元220、以及位于分散器単元220上游的作为胚胎源的可选的生物反应器200 ；b)位于分离器装置230下游的用于定向和分选悬浮于流体中的胚胎的定向和分 选单元250 ;以及优选地位于定向和分选单元250下游的可选的沉积装置。在本发明的第六个方面，提供了一种系统，包括根据本发明第四方面的沉积装置、以及以下中的至少ー个a)用于分散悬浮于流体的胚胎和胚性组织的分散器単元220、以及位于分散器单元220上游的作为胚胎源的可选的生物反应器200 ；b)根据本发明第一方面的分离器装置230，其位于分散器単元220的下游；c)用于定向和分选悬浮于流体中的胚胎的定向和分选单元250，其位于分离器装置230的下游和沉积装置的上游。
具体实施例方式在陪替氏培养皿或生物反应器中的固态或液态介质上制备的体细胞胚最初由未成熟胚性组织粘接在一起成为胚性集群或团块，直径通常可达50_或有时更大。现有技术教导了通过镊子手动地或通过传送带和机械臂自动地拾取个胚胎并将胚胎置于人工种子中的方法。但现有技术未教导如何快速且有效地破碎胚性集群并分离成熟胚胎且将每个成熟的可存活胚胎以正确的方向在大约数秒内置于各个容器中，所述容器可为人工种子等。为提供有效装置以从植物体细胞胚大規模制备植物，需要ー种自动化装置来快速并廉价地将成熟胚胎与所述胚性集群分离并快速以正确方向将成熟胚胎沉积至用于萌发的适当基质中。这样做需要如本文所公开的四个主要的操作步骤。首先，将从未成熟胚性组织脱离的体细胞胚集群温和地分散为单个胚胎，该步骤有利地当悬浮于液体介质中时执行。其次，过程涉及将胚胎与未成熟胚性组织隔离和分离，所述胚胎和未成熟胚性组织目前分散在液体介质中但仍混合在一起。第二步是有利的，例如，为了在视觉上畅通地接近悬浮于透明液体介质中的胚胎，而没有胚性组织的存在。对于该视觉接近的需要是为了建立胚胎的成熟度和适应性水平以萌发和制备植物。第三，过程涉及在沉积和校正不期望的方向之前识别成熟胚胎的方向，该过程在胚胎仍悬浮于液体介质中的同时进行。第四，过程涉及将具有正确方向的成熟胚胎沉积至适当基质中以萌发并形成植物。
如本文所公开，在能够快速且有效地通过每个步骤运送胚胎的基于流体动力学的自动化系统中，上述四个步骤的有效结合提供了一种从体细胞胚有效地大規模制备植物的手段。图10公开了用于快速且有效分散、分离、分选和定向并将植物胚胎沉积于用于萌发的基质中的基于流体动力学的自动化系统的ー个实施方式。自动化系统涉及多个所公开的创新性步骤，这些步骤依照图10所概述的过程的顺序，并概述于此I.分散器单元，參照专利申请PCT/US09/39981的220，也如本文中所公开的，2.分散器单元230，如本文所公开的，3.检测器和定向单元250，參照专利申请PCT/US09/39982，也如本文中所公开的，4.用于萌发的沉积装置260，如本文所公开的。
I.分散器単元专利申请PCT/US09/39981中所公开的针对在液体介质中分散胚性集群的装置的分散器単元的详细描述将全部以引用方式并入本文。本系统的分散器单元PCT/US09/39981涉及将植物体细胞胚的集群温和地分散为各个胚胎和未成熟胚性组织的方法和设备，其对本发明的系统是有用的。PCT/US09/39981中公开了将悬浮于液体介质中的植物胚胎的集群分散为各个植物胚胎的方法，所述方法包括至少ー个分散程序，其包括下列步骤i)对胚胎的集群施加流体动力，引起轴向拉伸应变和径向压缩应变；ii)对胚胎的集群施加流体动力，引起来自流体动カ的轴向压缩应变和径向拉伸
应变；依次重复所述步骤，直到各个胚胎彼此分离。优选地，随着每次重复该程序，拉伸和压缩应变的强度増加。PCT/US09/39981中还公开了ー种用于分离包含在胚胎集群中的各个胚胎的分散器，其包括包含至少ー个缩窄部的流动通道，使得流经流动通道的胚胎集群首先受到来自流体动カ的轴向拉伸应变和径向压缩应变，然后受到轴向压缩应变和径向拉伸应变。优选地，流动通道包括至少两个缩窄部，每个缩窄部的内径等于或小于紧靠其上游的缩窄部的内径。优选地，流动通道包括位于每个缩窄部之间的具有恒定横截面的中间部分。优选地，每个中间部分的内径等于或小于紧靠其上游的中间部分的内径。优选地，每个中间部分的长度可至少等于待分散的胚胎集群。优选地，每个中间部分的长度在2. 5mm至60mm的区间内，更优选地为约5mm至约30mm。缩窄部的数量可为3-100，优选为5-20，更优选为约10。优选地，缩窄部的横截面积在O. 75至1300mm2的区间内，更优选在3至32mm2的区间内。流动通道可具有轴对称的横截面。流动通道可具有基本上为圆形或椭圆形的横截面。流动通道的至少部分可具有非轴对称的横截面，诸如矩形横截面。可优选地将具有最大尺寸的每个非轴对称缩窄部的横截面定向成使得每个缩窄部的最大尺寸相对于下一个非轴对称缩窄部的最大尺寸依次旋转优选至少30°，更优选约90°。每个缩窄部的横截面可表示为具有第一侧边和第二侧边的矩形，其中第一侧边比第二侧边长，并且缩窄部被定向成使得每个缩窄部的第一侧边依次垂直于下ー个具有矩形横截面的缩窄部的第一侧边。PCT/US09/39981所公开的分散方法和设备的优势包括(I)不需要任何移动部件，因此耐用(2)自然适用于连续流系统，因此不需要在批处理方式下运行(3)对胚胎温和(4)快速；使用该设备进行分散仅需数秒即可分散数百个胚胎(5)设备紧凑且完全封闭，易于灭菌。2.分离器单元 用于将体细胞胚与胚性组织隔离和分离的设备—旦胚性集群分散于液体中，其产生悬浮于液体中的成熟胚胎、未成熟胚胎和未成熟胚性组织的混合物。必须将体细胞胚与未成熟胚性组织隔离和分离以用于进ー步处理和种植。在自动化系统中，非常期望快速、有效地进行该分离，而对系统的连续运行不造成任何干扰。本文公开了本发明的这种分离器设备。本发明的分离器设备和方法利用了在悬浮液中胚胎相对于未成熟胚性组织(以下称为“组织”或“胚性组织”)的阻力因数的差异，以提供分离体细胞胚和胚性组织的设备和方法。设备的大体构造和操作为了便于进行接下来的理论论述，对本发明的设备进行如下简短的大体概述。本发明的分离器设备优选地具有基本上为圆柱形的在操作期间容纳流体介质分离器容器5、以及在分离器容器5内的流体中引起轴对称旋转流动的装置。优选地，具有基本平坦的底壁6。流体介质的密度低于待分离的胚胎和组织的密度。流体介质优选为水。诱导分离器容器5内部的流体介质围绕分离器容器5的中心轴(相对于底壁6旋转，其中，除了在底壁6的表面上形成的薄边界层邻近处之外，在整个分离器容器5中具有基本均匀的旋转速度，其中底壁6处的旋转速度快速接近零。由于流体的旋转，分离器容器5中的各处(包括底壁6处的薄边界层内部)的压カ沿径向增加一基本均一的量。更确切地，压カ沿径向升高，使得压カ改变率相对于到中心轴线10的径向距离来说与轴向距离无关，并与旋转速度二次相关，且与到中心轴线的径向距离线性相关。在底壁6的轴向区域(中心)具有管道7，可从该导管中移除并收集体细胞胚。将与未成熟胚性组织(以下简称组织)混合的胚胎引入分离器容器5中的流体中距离底壁6足够远的位置处。借助将其向外推动的离心力和将其向内推动的向内压力，使胚胎和组织快速夹带并分散于旋转流体中。两种カ相互抵消，胚胎和组织最终找到平衡轨道并围绕其旋转。然而，旋转时，胚胎将比组织沉淀得快。具有较大相对阻カ的组织将沿平衡轨道旋转并基本更易于夹带和悬浮，且显示较低的沉淀速度。在向底部沉淀时，胚胎进入所述边界层，而组织由于下文阐述的原因而基本停留在边界层外部。进入边界层之后，胚胎的旋转速度明显减慢。然而，向内压カ保持基本相同。因此，对于边界层20内部的胚胎，向内压カ与离心カ相比占主导地位井向中心推动胚胎；因此一旦到达边界层，胚胎将被推入底壁6的轴向区域中并进入管道7中。然后，可使用收集装置从管道7中收集胚胎，例如，通过收集离开管道7的流体(见如下对收集装置的更多详细描述)。具有比胚胎更大表面-体积比的组织处于更大的阻力下，因此比胚胎更易于夹带在主旋转流中。由于阻カ较高，当组织接近容器底部处的边界层时，很容易被扫回旋转流中。本发明的关键特征为，在轴对称旋转的流体下方的底壁6表面上产生薄边界层，使得胚胎能够沉淀并进入边界层，而具有较大阻力的组织由于在主旋转流中反复夹带而无法进入边界层。(i)由于阻カ差异导致的在边界层处胚胎与组织的隔离和(ii)该边界层内部的压カ相对于离心力的不平衡为重要特征，这些特征组合在一起提供独特而有效的手段以快速使胚胎与组织隔离并分离。此外(iii)汇流涡流的存在可为本发明的有益特征，如下文进ー步阐述。该组合效果的利用是本发明的设备明确区别于已知设备(诸如水力旋流器或气旋除尘器)的特征。
关于分离体细胞胚和胚性细胞团的方法和装置的流体动力学考量本发明是以产生组合效果为基础的，所述组合效果导致胚胎与未成熟胚性组织分离。所述效果包括a)在底壁6处产生粘性边界层，这通过使用旋转装置18引起流体内(相对于底壁6)的轴对称旋转流来实现；b)仅引导胚胎进入所述粘性边界层，这通过组织具有低得多的沉淀速度和高得多的阻力来实现；c)在分离器容器5中产生径向压カ梯度，这通过旋转的离心作用来实现；d)可选地，在底壁6的中心附近产生汇流涡流，这通过在操作期间将流体从管道7中排出来实现。因此将胚胎与组织分离，并且胚胎被引入底壁6的轴向区域(中心)中并进入管道7中，随后在此处使用收集装置对胚胎进行收集，例如，通过简单地收集离开管道7的流体。所述效果的理论基础和实用性讨论如下。如果旋转装置无效，可通过将流体从管道7中排出而在分离器容器5中产生自由涡旋(见定义)。在该情况下，除了中心附近的流体表面突然向下弯曲之外，流体的自由表面接近变平。汇流在整个分离器容器5中产生自由涡旋，并在底面处形成汇流边界层。汇流边界层外的流体粒子在分离器容器5的液流中沿着接近圆形的路线运动，所述路线由对所述流体粒子的向外离心カ和由径向压力梯度产生的向内力的平衡产生。汇流边界层内的流体粒子以相对于所述层外部的流体粒子较慢的旋转速度进行旋转；因此，与汇流边界层外的流体粒子相比，汇流边界层内的流体粒子由于缺乏足够的将所述流体粒子保持在接近圆形的路线中的离心カ而进入汇流。由于压カ梯度引起的向内力战胜了向外的离心力。由于当粒子向中心运动时角速度快速増加，因此汇流涡流对于捕获并排出接近中心的粒子是十分有效的。然而在汇流涡流中，不接近中心的流体粒子经历角速度降低的缓慢的运动涡旋。可记得的是，在中心处的奇点外部，定义为V0的角(或切线)速度在汇流涡流中降低为近1ん，其中r为距离中心轴线10的半径。因此，在远离中心处运动时，液流的运动非常缓慢。该缓慢的运动使得胚胎和未成熟胚性组织沉淀至汇流边界层并一起排入管道7中。
本发明的关键在于建立流动条件以在进入管道7之前将胚胎和未成熟胚性组织分离。自由涡旋和强制涡旋的结合这可通过以下方法在填充有流体的分离器容器5中将上述自由涡旋的作用与强制涡旋的作用结合来实现a)通过将流体从管道7中排出而产生自由涡旋；并同时b)通过使用旋转装置18在流体中引起轴对称旋转流动而产生強制涡旋。
在以下段落中对强制涡旋和自由涡旋的结合所产生的关键现象进行解释。实际上，本发明的某些实施方式利用了两种涡旋流动的共同特征，其为在分离器容器5的底壁6处形成相对较薄的粘性边界层。通过旋转装置18施加于液体的剪切应カ产生强制涡旋与汇流流动的自由涡旋叠カロ。可记得的是，在強制涡旋中，流体几乎以固体旋转方式进行旋转，涡流強度恒定并且角速度表示为V0 = O. 5r ζ ζ。因此当远离中心运动时,角速度随着r线性增加。在中心附近，流动主要受汇流的自由涡旋支配，而在远离中心处，流动主要受强制涡流支配，以用于以期望方式建立理想状态来控制胚胎和未成熟胚性组织的运动。围绕中心轴线10旋转的具有在-r方向上的向心加速度的流体感受到在+r方向上的(反作用)离心力。如果通
过定义为字的正径向压力梯度对粒子施加朝向旋转中心的力(即沿_r方向)而对所述离
心カ进行平衡，那么漂浮的粒子将无限地围绕中心轴线10在圆形路径中旋转。当引入分离器容器5中后，由于胚胎和未成熟组织材料的密度大于所使用的流体介质(例如水)，所以它们通常在此处的强制涡旋流动中向外运动以升高的角速度进入流场。与胚胎相比具有相对较高流体阻力的未成熟胚性组织变得比胚胎更易于夹带在旋转流体中。因此，胚胎沿着螺旋路径围绕分离器容器5并逐渐朝向底壁6运动，同时未成熟胚性组织也呈现螺旋路径但具有低得多的沉淀速度。由于胚性组织具有相对较大的表面积-体积比，由于其易于被夹带回主旋转流而将不进入薄边界层。实际上，胚胎以相对较短的时间(以秒的级别或更短)进入底部处的粘性边界层；其中未成熟胚性组织由于较大的表面积-体积比而持续被再次夹带回主旋转流中。—旦胚胎处于边界层内，其角速度明显降低而正径向压カ梯度仍保持基本相同，迫使胚胎朝向中心向内运动并进入汇流涡流区域。一旦进入汇流涡流区域，可在例如进入管道7的流体中收集胚胎。具有零或可忽略的自由涡旋的強制涡旋如上所述，自由涡旋和强制涡旋的结合可用于建立分离胚胎与胚性细胞团的流动条件。液体从管道7的排出率与所达到的纯度之间具有倒数关系。在上下文中“纯度”是指分离未成熟胚胎组织和胚胎的有效度；较高的纯度意味着每个胚胎具有较少的胚性细胞团。液体从管道7的排出率越低(降至零流动并包括零流动)，所达到的纯度越高。因此，在某些实施方式中，优选地完全或基本缺乏自由涡旋(汇流涡流)以便实现高纯度。在缺乏汇流涡流吋，由于分离器容器5内的流体旋转产生的物理过程，即在底板6处形成的边界层，以及使胚胎在底板6处的边界层内部向分离器容器5的轴向中心迁移的夹带和向内压カ保持完全相同。与消除汇流涡流(液体排放为零或接近零)的不同为胚胎不是通过流体对流和重力沉淀的结合进入管道7，而是仅通过重力沉淀。換言之，上述机制将迫使胚胎进入底板6的轴向区域。一旦胚胎到达底板6的轴向区域，角(方位角)和径向流体速度基本为零，如果排放速度和轴向速度也为零，那么该中心点为“停滞”点，并且胚胎在该中心处将有足够的时间沉入管道7中。一旦进入管道7，胚胎将逐渐沉淀(例如，对于该实验中所使用的胚胎来说，为每秒约10cm)。然而，分离速度由于液体从管道7的较低排出速度降低而变慢。因此，在需要高速分离的应用中，可优选自由涡旋和强制涡旋的结合。
·
粘性边界层ー个非常重要的特征是在分离器容器5的底壁6处形成的薄轴向对称粘性边界层。粘性边界层是指从ζ = O的底壁6表面到ζ = δ的指定为边界层20边缘的区域(在此处流体速度与強制涡旋基本相同)的流体层。在该流动中，边界层厚度基本取决于流体的运动粘度和旋转装置18的旋转速度。通过考虑在静止平板上方的流体的轴对称固体旋转的牛顿粘性流体流动的动量守恒(Navier-Stokes方程)，可对分离器容器5的底部处的边界层流动进行良好的概算。对所述流动的解决方案提供于流体力学文献中k 例如，H. Schlichting, Boundary Layer Theory, McGraw Hill Series in MechanicalEngineering，1979)，并且此处将不再赘述。我们使用相同的解决方案对由于旋转装置18的旋转而在分离器容器5内部产生的流动提供了良好的概算。除了在分离器容器5的中心和其固体壁附近的外缘之外，该解决方案在底壁6处的边界层中有效。本发明的其中ー个
重要方面是基于边界层内部的压カ梯度，I，考虑到层足够薄，因此基本可忽略。換言之，边
界层的内部和外部的径向压力梯度将基本相同，表示为￥ = P~2，其中 为流体介质的旋
转速度。显然，该量在容器中的流体的各处均为正，并且因此，压カ随着到分离器容器5的中心轴线的距离而升高。压カ随着半径r升高导致在流体介质的自由表面处形成液体高度的抛物线变化。基本相同的径向压カ梯度存在于边界层内部，迫使流体远离分离器容器5的壁并朝向分离器容器5的中心轴线运动。边界层内部的压カ大小取决于分离器容器5内部的流体高度。在操作期间容器中的流体高度54应大约等于容器的直径51，高度优选为直径的O. 6-1. 4倍，更优选地为O. 8-1. 2倍。可容许在操作期间与理想流体高度具有偏差，但会导致不太理想的操作。然而，边界层内部的压カ梯度并进而流体速度取决于流体高度相对于半径的变化，而不是分离器容器5内部的液体量。当旋转速度增加时，压カ梯度增加，流体和边界层夹带的胚胎的朝向中心的向内速度増加。然而，表示为3 = 8·^的边界层的厚度随着旋转速度的增加而減少，直到厚度小于胚胎的尺寸的点。本发明的分离胚胎和未成熟胚性组织的效率取决于下面将要讨论的多个參数。关键參数是速度，借助该速度可引导胚胎进入底壁6的轴向区域中，并可在该处对胚胎进行收集。
在这方面的ー些重要參数为边界层厚度，δ，速度的径向分量，'，角速度与径向速度之比，/，以及轴向速度，Vz0在这里我们将根据旋转速度和径向位置对这些參数中的
r
每ー个提供ー些数值。虽然可基于边界层方程中的相似变量通过提供适当按比例缩放的量而以一般形式提供该信息，但是为了提供该部分优选实施方式的具体实施例，我们将基于特定优选设备且以尺寸形式提供結果。基于本文所包含的教导，技术人员将能够构建功能性分离设备，其中针对待分离胚胎的具体类型以及其它相关原因对參数进行优化。旋转速度的影响用作非限定性示例性实施方式的分离器容器的直径51为200_，示例性的液体高度54为200mm。我们将使用该示例性分离器容器来描述流体的旋转速度对边界层厚度和边界层内部的流动的影响，其中所述旋转速度以每分钟的转数为单位(rpm)。表3提供了在径向位置r = 7mm处,对于旋转速度为15rpm,距离底壁6为ζ = O至3mm,边界层内部的流体 速度的径向、轴向和角分量的值，以及径向与轴向和角速度的比值。在该情况下，边界层厚度为6. 38mm,其中定义V0为约110mm/s的自由流角速度的约98%。表3.在径向位置r = 7mm处,对于旋转速度=15rpm,从ζ = O处的底壁至ζ =6. 4mm处的边界层边缘，边界层内部的流体速度的径向、轴向和角分量，以及径向与轴向以及径向与角速度的比值。
z (mm) vr (mm/s) vz (mm/s) v _ve(mm/s) vr
vZ%
0.0O0.000.0
0.40.00.24-15742.2-0.91
0.8-38.30.78-6780.9-0.65
1.2-52.61.38-36111.4-0.44
1.6-49.41.88-19131.1-0.28
2.0-36.12.19-9139.9-0.14
2.4-19.42.32-2139.8-0.03
2.8-4.02.293133.90.05
2.87.32.293133.90.05
3.213.52.426125.50.11
3.615.12.018117.00.13
4.013.31.847110.10.12
4.49.71.716105.70.09
4.85.51.623103.70.05
5.21.81.58I103.40.02
5.6-0.91.59-I104.8-0.01
6.0-2.51.60-2106.6-0.02
6.4-2.91.63-2108.4-0.03如表中所示的两个速度比，在邻近底面的2mm层中，流动相对于主流动具有強烈的向内的二次流动。速度的向上分量比速度的径向向内分量和角分量相对小得多。因此，胚胎一旦处于边界层内部，将被有效地在大约几秒内扫至中心。如表4所示，如果我们明显増加旋转速度，则径向速度和比值发生有利地变化，然而，边界层厚度也将明显下降。此处，仅有旋转速度从15rpm增加至120rpm。表4.在径向位置r = 7mm处,对于旋转速度ζ = 120rpm,距离底壁为ζ = O至2. 3mm的边界层内部的流体速度的径向、轴向和角分量，以及径向与轴向以及径向与角速度的比值。
z (mm) vr (mm/s) vz (mm/s) v _ve(mm/s) vr
vZ
0.00.00.000.0
0.1-306.70.69-445337.3-0.91
0.3-421.22.21-190646.9-0.65
0.4-395.53.90-101891.4-0.44
0.6-289.15.32-541048.9-0.28
0.7-155.06.19-251119.0-0.14
0.8-31.86.56-51118.4-0.03
1.058.36.4991071.60.05
1.1107.96.84161003.90.11
1.3120.65.6721935.90.13
1.4106.45.2120881.10.12
1.677.24.8316845.40.09
1.744.04.5910829.20.05
1.814.34.473827.50.02
2.0-7.44.50-2838.3-0.01
2.1-19.64.52-4852.6-0.02
2.3-23.6 4.61 -5 867.1 -0.03向内的二次流动的 速度已明显增加，迫使胚胎更快速地到达边界层的中心。然而，目前边界层厚度仅为2. 3mm,并且与15rpm的情况下的2. 4mm相比,在120rpm的情况下具有有效二次流的区域限于距板约O. 8mm。以上两个实例显示，基于胚胎尺寸和对于特定的分离器容器5尺寸，旋转速度可用作控制參数，以调节边界层厚度并优化将胚胎分离并转移至底壁6的轴向区域中的效率。对汇流涡流的考虑当分离器容器5的底壁6的轴向区域处的管道7面积远小于分离器容器5的底壁6面积时，可通过从管道7中排放流体而在分离器容器5中产生汇流涡流。产生汇流涡流的可替换方式是通过将抽吸管从顶端延长至分离器容器5的底壁6中心。在不失普遍性的前提下，并且为了明确说明，我们将我们的说明限定在这样的情况中，即，其中管道7为位于底壁6的中心且直径远小于底壁6的直径的圆形穿孔。在该情况下，通过管道7离开的液流呈现旋转的二次运动，形成自由涡旋流动。当管道7直径小于底壁6的直径的10%时，可忽略竖直边界的影响并自由地形成汇流涡流。汇流涡流的特征为液体的自由表面22突然降低，并在分离器容器5的底部处围绕管道7形成汇流边界层20。
图8示出了在分离器容器5中与汇流涡流有关的二次流动。应注意的是，主要流动为围绕中心轴线的旋转流动，未在图中显示。留在边界层外部的二次流动的部分未进入底壁6处的管道7中。可通过以下实例说明如果我们将附接在注射器上的长针插入液流中，只要针尖在边界层外部，并且通过针注射的任何染料将持续围绕中心轴线旋转，并且ー些染料沿着图8所示的二次流动的路径运动。仅当针尖与底面非常接近时，染料才可随着排出的流体进入底部孔中。因此，仅有进入边界层的流体和任何物体将进入孔中。因为分散的胚性组织由于较大的表面-体积比而具有较大的平均阻力，所以，当其被快速夹带回边界层外部的二次流动中时，其将不进入薄边界层。然而，胚胎将进入边界层并随着流体的向内运动进入管道7。流体的二次运动和边界层的结合可建立简便且快速的方式，以将胚胎从胚性组织中分离至通过管道7离开分离器容器5的独立液流中。分离器容器5本发明的设备包括在操作期间填充有流体的分离器容器5。理想地，分离器容器5 为圆柱形，并具有平坦的底壁6。同样理想地，圆柱体的轴10是竖直的，并且平坦底部垂直于该轴。虽然与理想參数偏离导致非最优的运行，但在偏离理想几何学的特定水平下仍然可操作设备。容差将因各情况而改变。优选地，分离器容器5为轴对称。与轴对称的任何偏离将导致对流动的干扰并由此导致分离效率较低。平坦底面的角度对于有效分离胚胎也是很重要的。优选平坦底壁6垂直于分离器容器5的轴线10或ζ。如果底壁6的角度为正(向上)，那么胚胎必须轴向向上(ζ增加)并径向向内(r减和)行进穿过边界层。由于胚胎比倾向于沉淀而非上升的流体重，这使得分离效率降低。如果平坦底面的角度为负(向下)，这将对边界层内部的压カ梯度产生不利影响。这就是迫使胚胎在边界层内部朝向中心的正径向压力梯度的大小将降低，从而对胚胎施加更少的向内的力。该角度(在该角度处，径向压カ梯度变得如此不利地影响以便对胚胎无任何影响)取决于旋转速度和边界层特征。总而言之，假设在打开的分离器容器5中流体
的固体旋转具有角速度，如果每一点处平坦底面的向下斜率为# = 1，其中g为重力，那
dr g
么在汇流涡流存在的情况下，表面上除了管道7附近之外的各处沿底面的压カ梯度将非常小。该情况对于胚胎分离将是非常无效的几何学。如果斜率更大，即底壁6具有更高的向下负角度，那么沿表面将会有不利的压カ梯度。分离器容器5包括位于底壁6的轴向区域处的流体管道7。优选地，流体管道7包括位于分离器容器5的轴向区域(优选地中心)处的底壁6的穿孔。管道7也可包括从分离器容器5的顶部延伸至底壁6的轴向区域(优选底壁6的中心)的管。管道7也可包括从任意其它方向延伸至底壁6的轴向区域(优选底壁6的中心)的管。管道7面积与容器底壁6面积之比是重要的。管道7面积应相对较小(优选小于底壁6面积的10% )。容器可选地包括位于分离器容器5的顶部附近的第二流体出ロ 25。第二出ロ 25可通过不具有顶壁的分离器容器5实施，从而多余的流体可通过溢流而离开分离器容器5。分离器容器5也可以可选地包括在分离器容器5的底部处的第三流体出ロ 16，以将流体排出分离器容器5。分离器容器5的尺寸在具体实施方式
中改变，并且如上所述，流体中的旋转速度可用作方便可调节的控制參数，而无需对设备进行物理学改变。在分离器容器5中引起轴对称旋转流动的装置术语“在分离器容器5中引起轴对称旋转流动的装置”、“旋转设备”或“旋转设备”在整个公开中可互换地使用。旋转装置18可为置于容器内部在液体中旋转的旋转物体。可通过轴11将该物体连接于马达12。也可通过在分离器容器5外部施加磁场而引起物体旋转。
当浸入液体介质中的固体物旋转时，紧挨物体的固体表面的流体粒子紧贴表面(在流体力学中称为无滑移)井随着表面旋转。表面处的流体粒子对邻近的流体粒子施加摩擦力(更准确地为剪切应カ)，其进而传播至离表面更远处并进入流体中。所述流体剪切应カ进而在分离器容器5内部的整个流体上促使旋转运动。如上所述，如果提供足够的时间，除了外部固体边界和分离器容器5的底壁6附近以及中心轴线10附近之外，流体运动基本呈现固体旋转。优选地，旋转物体主要通过上述剪切应カ将其作用施于流体上，这可引起超过所需涡旋的最小附加涡旋。因此所述旋转物体优选为盘型18b或圆柱形18a。另ー旋转装置18的优选实施为通过相对于底壁6旋转整个分离器容器5来旋转分离器容器5内的流体。不同仅在于，在该情况下，在分离器容器5边界的竖直表面上无边界层。然而，在底壁6处将存在性质基本相同的边界层。如上所述，对将要实现的流体(相对于底壁6)的所需旋转速度进行測定，并且通过以上教导，本领域技术人员能够以实现所需旋转速度的方式构建并操作旋转装置18。在操作期间从底壁6的轴向区域排放流体的装置该设备可包括在分离器容器5的底壁6处通过流体管道7排放流体的装置。排放流体的装置可简单地包括向分离器容器5中的流体提供通过重力流经管道7的机会，但也可使用泵进行实施。优选地，该装置是可控的，例如通过安装有阀36或通过使用可控的泵。排放在本文中是指从分离器容器5通过管道7将流体抽出的任意方式，可为重力驱动或由压カ梯度、泵或其它装置驱动。收集已分离的胚胎的装置收集已分离的胚胎的装置可包括将管道7的放置和大小设置成使得在操作期间被吸入底壁6的轴向区域中的胚胎通过重力沉淀进入管道7中。优选地，上述收集胚胎的装置进ー步包括从管道7中收集胚胎而基本不改变容器中的流体的体积的装置。在需要最大纯度的应用中，该装置具有消除汇流涡流的优势。以上收集装置的实例包括旋转闸式阀，其布置成使得胚胎可通过旋转闸式阀沉淀至阀中以及离开阀。假设闸式阀周围的所有管道7均填充有流体，那么收集胚胎不产生净流动。另ー实例包括第一和第二阀，其布置成i)当第一阀打开而第二阀关闭时，胚胎可朝向第二阀沉淀至管道7中；ii)当第一阀关闭而第二阀打开时，胚胎可进ー步沉淀至第二阀外的管道7中。该布置也可允许从管道7中收集胚胎，而无任何体积流量。又ー优选的收集胚胎的示例性装置包括向管道7提供管交叉部(具有至少第一、第二和第三连接)，其布置成具体如下(见图7对示例性实施方式的图示)。第三连接包括流体的出ロ。管道7附接于第二连接。交叉部包括底面，其布置成使得沉淀在管道7中的胚胎优选地通过第二连接沉淀在底面上。此外，收集胚胎的装置包括提供来自交叉部的第一连接的流体流动的装置，使得沉淀于交叉部底面中的胚胎被扫入第三连接中，胚胎在第三连接中可容易地在流出的流体中进行收集。提供流体流动的装置优选地(在操作中)提供已调节的流体流动，使得流体流动的压カ在交叉部中提供流体压力，用于抵消管道7中的压力。优选地，调节流体流动以使管道7中的净流动为零或基本为零。在一些情况下可优选调节流体流动，使得管道7内中存在沿分离器容器5的方向的净流动。然而，在这些情况下，管道7内的净流动不应大得以致于引起对沉淀胚胎的向上阻カ而使得沉淀停止。 管道7中朝向分离器容器5的净流动具有优势，使得可能已进入管道7中的任何未成熟胚性细胞团可被吹回至分离器容器5中。可记得的是，未成熟胚性细胞团呈现出较大的阻力，因此其沉淀比胚胎的沉淀更容易抵消。另ー方面，如果需要以纯度为代价而加快分离过程，可优选调节来自第一连接的流体流动，使得来自分离器容器5的净流动发生在管道7中。技术人员应懂得的是，可以大量等同的方式来实施调节流体流动以在管道7中提供合适的流动。可调节的參数包括管道7和分离器容器5中的流体柱高度、来自第一连接的流动速度、和通过第三连接的流动速度。也可通过经由管道7中吸取流体并收集流出管道7的流体来实施收集已分离的胚胎的装置。可替换地，可使用来自分离的可选流体出口的抽吸而从底壁6的轴向区域吸取和收集胚胎。在操作包括通过管道7吸取流体的实施方式中，优选的是收集已分离胚胎的装置包括选择性收集离开管道7的流体部分(fraction)的装置。可手动控制或自动控制该部分收集装置，例如简单地通过定时来控制。收集装置也可包括传感器8，该传感器检测通过管道7离开的流体中是否存在胚胎。传感器8可包括光传感器。本发明所使用的光传感器原则上可为适用于本目的的任何本领域已知的光传感器。合适传感器的实例包括但不限于基于ー种或多种光束(包括激光束)的传感器、感应传感器、声波传感器(包括超声波传感器)。来自传感器8的输入数据可用于指导部分收集装置选择性地收集含有预定浓度的胚胎的流出流体。将悬浮于流体的胚胎和未成熟胚性组织引入到分离器容器5中的装置可间歇地(分批地)或连续地将悬浮于流体中的胚胎和未成熟胚性组织引入到分离器容器5中。以下分别公开每种操作方式的详情。引入装置优选地为进料管道9，其适于将悬浮于流体的胚胎和组织优选传送到至分离器容器5的轴向区域，并优选地接近流体的表面。引入的位置不是非常关键，只要引入位置位于远离底壁6至少ー些距离即可，以允许足够的距离来分离组织和胚胎。引入装置可集成到旋转装置18的轴中；例如空心轴11可用作进料导管9以引入胚胎和组织。适用于分批操作的分离设备和方法在许多情况下，必须将正被处理的胚胎集群从陪替氏培养皿或生物反应器中分批供应到分散阶段中。对于位于分散器単元下游的分离器设备，这将导致胚胎的不平衡流入。在该情况下，携带已分散胚胎和未成熟胚性组织的液体介质将在短时期内富含胚胎(称为“富含”期)，井随后在一段时期内排空胚胎。在分离ー批胚胎与引入后续批次前之间的时间期间(例如在交換正被处理胚性集群的源期间)，分离器容器5中将会有非常少的胚胎或无胚胎(称为“排空”期)。由于将分离器容器5内的未成熟胚性组织的量最小化是有益的，因此在耗尽期优选对分离器容器中的流体介质进行更换。因此，适用于成批操作的本发明设备优选地包括更换分离器容器5中的流体的装置。该设备可选地包括传感器8，用于监测离开胚胎收集装置的流体。传感器8可用于监测胚胎的运送并检测排空流的发生。一旦传感器8未在指定时间段内检测到胚胎，其可发出信号表示排空期开始，这使得更换分离器容器5中的流体的装置进行流体更换操作。流体更换操作的触发也可手动进行，或者通过定时以在引入最新ー批胚胎后的预定时间段后发生流体更换来进行。
·
可以多种方式进行流体更换操作。以下实例不应解释为以任何方式限定，并且在不同实例中的特征可自由組合。例如，可通过引入悬浮于流体的胚胎的装置而在分离器容器5中注入纯介质。可选的阀36可用于在底壁6处阻断任何通过管道7的流动，其中流体将通过第二出ロ 25溢流，从而快速地用纯介质更换容器中的内容物。可替换地，装置可以可选地在分离器容器5的最底部处包括安装有第二阀37的第三出ロ 30，可选地操作性地耦接于底壁6的管道7处的第一阀36。在流体更换操作的过程中，第二阀37将打开并可选地同时关闭第一阀36，以允许流体从第三出ロ 30离开，从而将分离器容器5中含有未成熟胚性组织材料的流体介质排空。在另一可替换方案中，更换流体的装置包括附接于竖直定向线性驱动器35的抽取管32以抽取流体，所述线性驱动器可被降低以从分离器容器5中抽取含有未成熟胚性组织的液体。一旦液体完全抽出，将抽取管升高,出口 33位于液体水平上方。可替换地，分离器容器5中的流体也可通过管道7排出。一旦充分排出具有未成熟胚性组织的液体，将新鲜流体介质提供至分离器容器5中以用于待处理的下ー批胚性细胞团。适于连续操作的分离器设备和方法如果正被处理的胚性集群的源为连续的，本发明的方法和设备可以连续操作模式用于胚胎分离。适用于连续操作的本发明设备优选地包括连续更换分离器容器5中的流体的装置。优选地，连续更换分离器容器5中的流体的装置包括(例如，通过给料管道9向分离器容器5提供新鲜介质的流动速度比管道7中的流动速度大得多的装置，使得含有未成熟胚性组织的多余流动例如通过第二出ロ 25和/或通过第三出ロ 30离开分离器容器5。可根据所需分离效率的水平来确定因数，通过该因数使经由管道7的向内流动速度高于向外流动速度。更高的相对向内流动速度将导致更高的纯化因数。原则上，混合于已分离胚胎中的剩余污染组织的量将与因数负相关，通过该因数使经由管道7的向内流动速度高于向外流动速度。优选通过管道7的向内流动速度超过向外流动速度约3、5、10、15、20倍或更多。也可优选向内流动速度超过向外流动速度约I. 1-1000、2-100、2-50、2-20、3-20、5-15、5-10或8-12倍。在某些实施方式中，优选通过管道7的向外流动速度等于零或基本为零。在连续操作模式的情况下，优选通过管道7从分离器容器5中连续收集胚胎。也可为其它连续收集胚胎的装置。控制单元控制单元38具有计算和储存能力，并可设置为ー个物理単元，或可替换地设置为多个逻辑上互联的单元。可以多种方式实施控制単元38。例如，控制单元38可为通常市售的个人计算机或专门定制的微处理器控制的控制单元。可以许多方式(有线地和无线地)实施控制其它单元和接收来自其它单元的输入数据的装置。例如，控制单元可包括D/A转换器输入-输出单元，其能够产生可通过电线传送的模拟电信号。由控制单元38发出的信号可为数字的，诸如经由串行端ロ、并行端ロ、USB端ロ、Firewire (IEEE1394)或相似有线信号。可替换地，信号可为通过声学、光学、红外 或射频信号的无线信号。例如，蓝牙或无线LAN技术可用于将信号从控制単元38传送至待被控制的组件。应注意的是，控制単元38包括用于执行分离设备功能的逻辑电路。可借助软件或计算机程序实现该功能。控制单元38也可包括用于储存计算机程序的储存装置或存储单元以及用于执行计算机程序的处理装置或处理单元(诸如微处理器)。储存装置也可为可读存储介质，其与控制单元38隔开但与其连接。当在以上描述分离器设备或沉积设备执行特定功能时，应理解的是，分离器设备或沉积设备中的控制单元38使用处理装置来执行储存于储存装置中的程序的特定部分。具有两个或多个容器的分离器如上所述的两个或多个分离装置可以串联方式相连接以实现胚胎的更高纯度。例如，具有通过管道7的较高向外流动速度(导致高速度但低纯度)的第一分离设备可用于上游，并且第一分离设备的输出物可直接被供应到第二分离设备中，所述第二分离装置具有较慢的操作但较高的纯度因数。可替换地，具有较高纯度因数的较慢分离设备可用作上游设备，并且在下游使用较快的分离设备。两个以上的分离设备的组合也可能，并且优选地用于纯度最为重要的应用中。本发明还涉及将悬浮于流体中的胚胎与未成熟胚性组织隔离和分离的方法。该方法需要使用合适的填充有流体的容器，优选如上所述的分离器容器5。该方法基于利用一致有效俄国快速地导致胚胎与未成熟胚性组织隔离和分离的作用的组合。所述方法包括以下a)如上所述，在分离器容器5中引起相对于底壁6的强制轴对称旋转流动，并且可选地b)通过在底壁6的中心处或该中心附近将流体从管道7中排出而在分离器容器5的底部处产生汇流涡流。强制旋转流动使得在底壁形成薄边界层。在涉及使用可选的汇流涡流的情况下，由于汇流涡流而在排放管道7的附近形成附加边界层(汇流边界层)。该方法还包括在分离器容器5中具有正压カ梯度。所述压カ梯度由旋转流体而产生。如本文所阐述，该方法包括利用在旋转流体下方形成的边界层的特征，可选地与汇流涡流组合。旋转流体产生在边界层内部与外部的大小基本相等的正压カ梯度。在边界层外部，物体随着流动旋转而接近平衡轨道，在平衡轨道处由于正压力梯度产生的向内力与由于物体旋转而产生的离心カ平衡。由于物体的旋转速度在边界层内部明显降低，因此边界层内部不存在离心カ与由于压カ梯度所产生的力之间的该平衡。方法还基于胚胎相对于未成熟胚性组织的流体力学特征的关键差异。由于表面积-体积比的较大差异，胚胎上的阻力明显低于未成熟胚性组织上的阻力。由于该差异，胚胎发生沉淀并易于进入边界层；然而，未成熟胚性组织也发生沉淀但不进入边界层。相反，未成熟胚性组织继续保持被夹带在主旋转流体中。边界层内的胚胎最初通过由于正压カ梯度所引起的主导カ而被朝向中心轴线推动。当接近中心吋，胚胎可快速夹带在汇流涡流(如果存在汇流涡流的话)内并容易地从汇流涡流收集。可替换地，可简单地从底壁6的轴向区域收集胚胎。因此，该方法包括在边界层20处将胚胎与胚性组织隔离，并且可选地通过汇流涡 流的存在将胚胎分离至不含未成熟胚性组织的液流中。优选地，管道7 (从分离器容器5)向外的流动速度为零或基本为零，并且胚胎通过重力沉淀进入管道7。优选在管道7中引起向内的流动，因主其可通过将胚性细胞团推动得远离管道7而进一歩提高纯度。然而，由于管道7中向内的液体速度而在胚胎上产生的向上阻カ不应超过胚胎重量减去由胚胎所取代的液体的重量(浮力效应)；否则胚胎将在管道7中向内运动。适于成批操作的方法该方法可适于成批操作，在该情况下其进ー步包括在引入之后并且在胚胎已发生沉淀之后但在未成熟胚性组织有时间发生沉淀之前的时间期间从底壁6的轴向区域选择性地收集胚胎。优选地，分批方法来[包括在引入后续批次之前，更换分离器容器5中的流体介质的步骤。适于连续操作的方法该方法适于连续操作，在该情况下其进ー步包括使用在分离器容器5的顶部处具有第二出ロ 25的分离器容器5，以超过离开管道7的流体速度的速度将流体供应到分离器容器5中。优选地，从导管中收集胚胎，优选地在离开管道7的流体中收集。3.定向和分选单元专利申请PCT/US09/39982中所公开的针对用于以正确定向将成熟胚胎沉积于合适的基质中的检测、分选和定向的装置对方法和设备的详细描述整体以引用方式并入本文。公开于PCT/US09/39982的定向和分选单元可用作独立方法或与在本发明的自动系统中的分散器和分离器装置结合。PCT/US09/39982提供了用于检测和自动定向植物胚胎(诸如植物体细胞胚)的设备。还提供了具有从其它物体中分选可接受胚胎的附加能力的设备。PCT/US09/39982中的设备用于自动定向流经该设备的悬浮于液体中的植物胚胎，设备包括a)用于液体的流动通道，其包括入口管502的液体入口 501、出口管504的液体出ロ 503、与贮液器设备506连接的贮液器管505，所述贮液器设备包括用于生成相对于出ロ503处的液体压カ为正的液体压カ的装置、用于容纳液体在内部流动的装置以及提供向外流动的液体的装置，其中入口管502、出ロ管504和贮液器管505在交叉部507处相连，并且其中流动通道的尺寸使得胚胎可与流经通道的液体共同运动，但由于尺寸限制而被约束于向冠首或冠尾方向移动，而当流经任何所述管时没有改变定向的可能性，除非定向如下进一歩所公开地发生改变；b)流动引导装置518，包括以下装置i)将流动从入口 501引导至出ロ 503的装置；ii)将流动从入口 501引导至贮液器设备506的装置；以及iii)将流动从贮液器设备506引导至出口 503的装置；c)检测器，其包括置于入口管502中的定向检测器510，其中定向检测器510包括确定通过入口管502的胚胎的定向的装置；
d)控制单元38，用于在流动通道中控制液体的流动，控制单元包括接收来自定向检测器510的输入的装置和控制流动引导装置518的装置，使得i)当由定向检测器510在默认位置未检测到胚胎时，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出ロ 503 ；ii)当由定向检测器510检测到定向与预定定向匹配的胚胎时,控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出ロ 503 ；iii)当由定向检测器510检测到定向与预定定向相反的胚胎，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入ロ 501朝向贮液器设备506被弓丨导，使得胚胎进入贮液器管505中，之后控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从贮液器设备506被引导至出口 503，使得胚胎进入出口管504，之后控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出口 503 ；由此，所有悬浮于离开出ロ 503的液体中的胚胎将具有与预定定向匹配的定向。另外，PCT/US09/39982中还公开了能够从其它物体中分选出可接受的胚胎的装置，其包括a)流动引导装置518，其附加地包括将流动引导至胚胎接收器340或第二目标板521的装置；b)定向检测器510，其附加地包括将可接受的胚胎从其它物体中分离的装置；c)控制单元38，其包括控制流动引导装置518的附加装置，使得i)当由定向检测器510在默认位置未检测到物体时，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出口 503，井出口流动被引导至第二目标板521 ；ii)当由定向检测器510检测到物体而不是可接受的胚胎时，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出ロ 503，并且出ロ流动被引导至第二目标板521 ；iii)当由定向检测器510检测到定向与预定定向匹配的可接受的胚胎时，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出ロ 503，并使出ロ流动被引导至胚胎接收器340;iv)当由定向检测器510检测到定向与预定定向相反的可接受的胚胎，控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至贮液器设备506，使得胚胎进入贮液器管505中，之后控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从贮液器设备506被引导至出口 503，使得胚胎进入出口管504，之后控制流动引导装置518以使液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出口 503并且出口流动被引导至胚胎接收器340 中；由此，所有悬浮于离开出口 503的液体中的可接受胚胎将被引导至胚胎接收器340中，并将具有与预定定向匹配的定向，并且由此将其它物体分选至第二目标板521中。更具体地，PCT/US09/39982的设备的特征可在于a)流动引导装置包括置于入ロ管502中的入ロ阀508和置于出ロ管504中的出口阀509，其中所述入ロ阀和出ロ阀通过响应于控制信号打开和闭合来提供控制在流动通道 中流动的装置；b)控制单元38，其包括控制阀508和509的装置，使得i)当由定向检测器510在默认位置未检测到胚胎吋，入口阀508打开，并且出ロ阀509打开，由此液体在流动通道中的流动从入口 501被引导至出ロ 503 ；ii)当由定向检测器510检测到定向与预定定向匹配的胚胎时，入口阀508保持打开，并且出口阀509保持打开，由此液体在流动通道中的流动保持从入口 501被引导至出口503 ;以及iii)当由定向检测器510检测到定向与预定定向相反的胚胎时，入口阀508保持打开，并且出ロ阀509关闭，由此液体在流动通道中的流动从入ロ 501被引导至贮液器设备506，使得胚胎进入贮液器管505中，之后入口阀508关闭而出ロ阀509打开，由此液体在流动通道中的流动从贮液器设备506被引导至出ロ 503，使得胚胎进入出ロ管504，之后入口阀508打开并且出ロ阀509保持打开，由此，正如在默认位置，液体在流动通道中的流动再次从入口 501被引导至出口 503 ；由此，所有悬浮于离开出ロ 503的液体中的胚胎将具有与预定定向匹配的定向。更具体地，PCT/US09/39982可包括以下的ー个或多个a)附加贮液管检测器511，其包括检测胚胎是否存在于贮液器管505中的装置，在该情况下控制单元38包括接收来自贮液器管检测器311的输入的装置，以便通过等待贮液管检测器511检测胚胎在贮液器管505中的存在和位置来确定胚胎何时进入贮液器管505 ；以及/或b)附加出ロ管检测器12，其包括检测胚胎是否存在于出ロ管504中的装置，在该情况下控制単元38包括接收来自出口管检测器512的输入的装置，以便通过等待出ロ管检测器512检测胚胎在出ロ管504中的存在和位置来确定胚胎何时进入出ロ管504 ;以及/或在一种或多种情况下，可根据液体流经PCT/US09/39982所述装置的恒定流动速度而通过预定定时来确定物体或胚胎何时进入特定位置。贮液器设备506可包括通向大气压的液体容器，其含有表面水平相对于出ロ 503较高的液体，使得当对流动引导装置进行相应设置时流体静压足以提供在流动通道中从贮液器设备506到出ロ 503的液体流动。贮液器设备506可优选地具有比贮液器管505的横截面积大得多的水平横截面积，使得贮液器506内部的液体水平在操作期间基本恒定。阀508和/或509可为电磁夹管阀。
定向检测器510优选地包括数字成像装置和计算机图像分析装置。PCT/US09/39982中公开的定向和分选单元至少提供以下优势-以正确的定向种植胚胎-低成本-精确定向，并且易于从其它物体中分选可存活胚胎-实现对每个体细胞胚进行成像和表征-快速处理大量胚胎-在液相中对体细胞胚的温和处理增加了成熟胚胎转化为萌发胚胎的转化率 -高效的装置允许使仅产生有限数量的成熟胚胎的细胞系形成足够产量的成熟胚胎4.沉积以用于萌发通过自由喷射流沉积胚胎以用于萌发的方法本发明的沉积方法基于借助流体的自由喷射流将胚胎传送至胚胎接收器340中，其中所述胚胎在该传送之前以任何方式处理过。该方法具有无需任何移动机械部件(诸如传送带或机械臂)的优势。公开了ー种将植物体细胞胚沉积在胚胎接收器340中的方法，其包括以下步骤i)以所需定向提供悬浮于流体的植物胚胎；ii)提供合适的胚胎接收器；iii)可选地，提供装置以稳定携帯胚胎的流体自由喷射流；iv)使用流体自由喷射流的装置将植物胚胎引入胚胎接收器340中，同时保持所
需定向。用于稳定携帯胚胎的流体自由喷射流的装置可用来抵消任何可发生的液体喷射流的不稳定，如所示出的在如下所讨论的某些情况下发生。该方法可优选地进ー步包括使用具有流动通道387的生成流体自由喷射流的装置，所示流动通道具有紧靠装置出口上游的基本呈线性的平直段。平直段370的长度为至少ー个流动通道内径380那么长，但优选为流动通道内径的10倍。用于沉积胚胎的设备胚胎传送设备和胚胎接收器分别能够运送和保持胚胎，同时维持胚胎的定向。虽然本文优选的携帯胚胎的流体介质为液体，更优选为水，但其它液体或气态流体(诸如空气)也在本发明的范围内。本发明的设备包括形成从流体通道出ロ 365流出的流体的自由喷射流360的装置，其中自由喷射流对准胚胎接收器340，其具有如下进ー步描述的特征。紧靠出ロ 365的点的上游的流动通道段具有基本线性的平直段370，其长度至少等于ー个最大内部横截面尺寸380，但优选为流动通道的最大内部横截面尺寸的10倍。紧靠出ロ 365上游的流动通道的平直段370使得离开出ロ的流体喷射流基本为单向性，其具有基本平行的流线而无第二液流。不限制在设计上的变化，优选的是，胚胎接收器的入口或顶部表面上方的喷嘴的出口 365末端至少ー个为最大内部横截面尺寸的那么长，并优选约为最大内部横截面尺寸的三倍。換言之，离开出口 365的自由喷射流360的长度优选为最大内部横截面尺寸的一至三倍。当出口 365末端距离胚胎接收器的入口小于ー个管最大内部横截面尺寸吋，液体溢流可干扰喷射流和胚胎传送。当末端距离接收器大于管最大内部横截面尺寸的三倍吋，更难以保持喷射流稳定并精确对准接收器，并且胚胎可具有足够的时间旋转并轻微改变定向386，这当进入接收器时将引起问题，如图12所示出。在本发明所优选的液体喷射流的情况中，根据自由喷射流的长度和自由喷射流的平均速度、液体的表面张カ和液体喷射流的半径，自由喷射流可变得不稳定并形成波纹形386，其导致喷射流解体。该现象在流体动力学不稳定性领域中称为Rayleigh(瑞利)不稳定(见 Drazin 和 Reed 的 Hydrodynamic Instability ；ISBN 0521289807,1987),如果时间足够将导致自由液体喷射流解体。例如，在胚胎沉积设备的优选实施方式中，其中最大内部横截面尺寸为约4. 2mm(即通道的3x3平方mm横截面的对角线)，自由喷射流的优选长度为约12. 5mm,并且圆形喷射流的水力直径为约3. 4_。基于线性稳定性分析可显示，导致该不稳定性和喷射流解体的波纹形式的干扰在2ms内将以指数因数e增长，即乘以约2. 7倍的因数。对于速度约为O. 5m/s的喷射流，在约Imm长度的自由喷射流中将发生乘以2. 7倍因数的干扰增长。因此，IOmm之后的喷射流将开始显示较大的干扰。本文中作为沉积设备260的部分所公开的用于稳定喷射流的装置是基于流体动力学不稳定性的知识和自由喷射 流中主要不稳定性模式的增长所包括的參数。自由液体喷射流不稳定的原因是液体表面张カ和液体射流曲率的影响。导致喷射流轴对称变形的轻微干扰使喷射流的曲率半径轻微减小，使得表面张カ的影响增加，这进而进ー步迫使半径减小，从而放大干扰的影响并迫使喷射流成为波纹形，其最终使喷射流解体。当自由喷射流离开喷嘴时明显可见该现象。当流速降低时，不稳定性和液体解体越来越接近管出ロ 365。对于必须通过缓慢的自由液体喷射流将胚胎传送至接收器中的情況，该不稳定性变得足够大以致引起胚胎在自由液体喷射流386中旋转，并且不能正确地沉积在胚胎接收器容器340的内部。不稳定性的主要模式以指数方式est增长，其中·V = 0.34 r Ρ/σ ，并且此处在
该增长速度方程中，r，P和σ分别为液体喷射流的半径、密度和表面张力。如果该不稳定性占优势，那么本发明的自由液体喷射流传送系统将无法可靠地连续将胚胎传送至容器中并保持胚胎的定向。对于缓慢的液体传送喷射流，可通过基本去除传送喷射流381的自由表面(即液体与空气之间的界面)、通过将喷射流382包封在具有更大直径的另ー喷射流381中来稳定喷射流。这有效去除了传送喷射流(即包含胚胎的喷射流)周围的空气并有效使用半径更大的喷射流来代替半径较小的喷射流。由于如以上增长速度方程所示，干扰的增长速度取决于喷射流半径的-3/2次方；当半径从4. 2mm增至8. 4mm吋，不稳定性的增长速度以约3倍下降。这可产生基本上更加稳定的传送喷射流。由于不稳定性首先出现于喷射流的自由表面上，在包封的传送喷射流中，外部液体层首先变得不稳定，而使得基本稳定的内部传送喷射流对于缓慢传送喷射流足够长以基本保持稳定和平直，并且在传送至胚胎接收器的容器的点处保持胚胎的定向。在许多情况下，当胚胎和胚胎传送喷射流必须更加缓慢地移动时(即远低于O. 5m/s)，直径为约3_、长度为12_或更长的典型自由喷射流将不稳定，并且传送操作可能无法保持正在沉积于胚胎接收器的容器中的胚胎的定向。波纹形的更加不稳定的喷射流386可能甚至无法保持足够平直以将胚胎传送至容器内。在该情况下，优选的用于稳定喷射流的方式为通过使用密封接头将传送管388放置于外管387的内部而使用外部流体喷射流381包封喷射流382。通过调节外管387中的流动速度，内部传送喷射流381将更加稳定，从而以保持胚胎383a的定向的方式提供更加可靠的将胚胎沉积至胚胎接收器中的装置。虽然不同的液体可用作内部和外部流体，但对于内部和外部流体优选使用相同的液体以消除传送喷射流383与包封喷射流381之间的界面。当使用相同液体吋，传送喷射流和包封喷射流之间不存在界面张カ。在无限制的前提下，优选匹配传送和包封喷射流的平均速度，使得每个喷射流中的流体基本以相同速度行迸。应注意的是，任何移动至静止固体表面附近的粘性流体在固体表面处的速度将为零，流体动力学中的无滑移原理。因此，紧邻内管388内、外固体表面的液体速度将为零。在管出口 365处，传送喷射流与包封喷射流之间的界面处的速度从零増加，在出口处达到平均自由喷射流速度。为了避免在传送和包封喷射流之间产生额外的 剪切力，优选调节包封喷射流的流动速度以使包封喷射流具有与传送喷射流相同的平均速度。在实施时，可基于包封喷射流381的流动速度和横截面积，通过计算包封喷射流中的平均速度来实现。因此，沉积设备可选地包括増加传送喷射流稳定性的装置，其包括将传送胚胎的传送喷射流包封在具有更大直径的另ー喷射流中的装置。胚胎接收器本发明的胚胎接收器可为用于接收胚胎的容器或任意培养室(如人工种子或萌发容器)，只要对胚胎接收器340构造成接收并容纳胚胎同时保持胚胎的定向即可。在胚胎接收器340的构造中，接收器的物理尺寸、基质的性质以及足够的排放能力(当使用液体来沉积胚胎)是重要的。接收器的尺寸必须足够大以容纳胚胎，并且足够小以保持期望定向。胚胎接收器的初始打开直径也必须至少等于胚胎的最大横截面直径，但优选至少大10%以使得胚胎进入自由喷射流中。与液体喷射流载体一起使用的接收器需要排放多余载液的装置，其中所述多余载液与胚胎一起进入接收器。优选地，对接收器进行穿孔345以实现排放。优选地，穿孔345中的至少ー个位于接收器的底部处，以最完全地将多余的流体从容器中排放。优选地，胚胎接收器为圆柱形或圆锥形。圆锥形接收器的入口直径至少比胚胎的最大横截面直径大两倍，并且平坦穿孔底部的半径至多为胚胎的最小直径且轴向长度至少为胚胎长度的两倍的圆锥形是容器的优选形状之一。优选该形状的容器是由于其允许多余液体自由通过并排出，而同时将正在沉积的胚胎首先从容器的入口侧释放，井随后当接近容器底部时被更多地限制；从而可保持定向并将胚胎保持在基本竖直的定向中。基质320需具有足够的刚性以将胚胎保持在期望的定向中，并足够柔软以允许发育。流经流动通道350的不含胚胎的流体的体积流体流动速度等于流体的平均速度乘以管的横截面积。在一个实施方式中，管由玻璃制成，其内部具有3mm乘以3_的横截面积。液体的平均速度为50cm/s。因此，体积流动速度为4.5ml/s。胚胎悬浮于通过管的液体中，胚胎基本上可在邻近玻璃壁的润滑的液体薄膜上滑动，由于对该胚胎的阻力相对于与玻璃壁的干燥接触的胚胎来说降低，使得胚胎容易并平滑地平移。总是有小量的阻力作用于胚胎，因此胚胎的运动比流动通道内部的流体平均速度稍慢。如果流动通道的内部直径沿流动液流未发生改变，那么胚胎的速度将基本保持恒定，并易于精确地预测借助通过由基本恒定的压カ头或压カ梯度迫使流经流动通道的流体液流而将每个连续胚胎传送至指定胚胎接收器中的时间。因此，优选传送管的形状和横截面积基本保持恒定。在液体的情况下，可通过将流体的贮液器保持在合适的高度以得到足以使液体流和胚胎以基本恒定和稳定的速度在管中移动的恒定压カ头，从而可提供恒定的压カ头。在一种设置中，具有3x3平方mm横截面和两个九十度弯曲部的管需要O. 12m的液压头以使胚胎以约O. 5m/s的速度移动通过I. 2m的管段。虽然优选以重力方向竖直地将胚胎传送至胚胎接收器中，但也可能并且有时可有利地迫使流体自由喷射流和胚胎以除竖直和向下之外的方向进入胚胎接收器中。以O. 5m/s离开喷嘴的流体喷射流在其离开管出ロ 365时可在IOmm或更长的距离内保持基本平直和基本稳定。因此，以除竖直-向下之外的方向将胚胎沉积至胚胎接收器340中是可行的。5.系统
在不失普遍性的前提下，我们使用体细胞胚发生作为通过体外培养的植物繁殖体进行制备的实例。用于大量繁殖植物的体细胞胚发生技术由于需要繁琐的人工操作而受到限制。由体细胞胚制备植物的方法需要密集的人工处理，因此对于植物的制备是昂贵的。潜在的原因是在成熟、萌发和植物形成过程中的人工选择、分离、分选、定向和胚胎移植等繁琐和耗时的实验室程序。本发明的目的是提供用于自动系统的方法和设备，其能够选择和沉积满足一套规定标准的成熟胚胎以在最小的人为干扰下萌发并形成植物。借助该自动化系统，从陪替氏培养皿或液体生物反应器中制备的胚胎集群中选择和分离成熟胚胎、分选、定向和沉积用于萌发的胚胎的过程可在大约数秒内完成。本文所公开的或所引用的本发明的每个单元可用作独立単元，但优选地为更大系统的整合部分，以使体外培养的植物繁殖体的大規模制备的大量繁殖自动化。本发明的系统包括ー个或多个以下部件a)分散器単元220，用于分散悬浮于流体(位于分离器设备的上游)和还可选的生物反应器中的胚胎和胚性组织，作为胚胎源，位于分散器的上游，b)分离器设备230，位于分散器単元下游，以有效地将成熟胚胎分离至液体介质流中，而不具有大部分未成熟胚性组织。c)分选和定向単元250，位于分离器设备下游，以根据设定标准对胚胎进行成像和分选和识别胚胎的定向以用于进一歩在下游沉积。d)沉积设备260，位于分选和定向单元下游，用于将所选择和定向的成熟胚胎沉积至胚胎接收器340中以萌发和形成根。本发明的分离器单元可用作独立单元或优选地与PCT/US09/39982中公开的的分散器单元组合和集成为分散器-分离器系统，以从陪替氏培养盘中在固体基质上所制备的胚性集群或从具有液体介质的生物反应器中的胚性集群中快速提取成熟的胚胎。在该情况下，最后ー个分散器管的出ロ连接于分离器的给料导管9，如图10所示出。可通过分离器的给料导管9直接将分散于分散器220中的胚性集群引入分离器容器5中，同时通过旋转装置18使分离器容器中的流体旋转。与胚性细胞团共同分散于分离器容器中的胚胎沉积更快并进入分离器容器的底板6处的边界层20。一旦进入边界层中，胚胎快速沿着汇聚的螺旋路径到达底板6的中心并进入管道7中。分散器和分离器单元在子系统中的组合提供装置以将在陪替氏培养盘中在固体介质上或在生物反应器中的液体介质中制备的胚胎从胚性集群中快速有效地分离成仅含有胚胎的液流。如图12所示出，仅具有胚胎的所述液流可与本文所公开的其它单元组合，以对沉积在合适板中用于萌发的胚胎的性质和胚胎的定向进行成像和分析，或剔除不符合规定的可接受胚胎的标准的胚胎。可接受胚胎的标准取决于正在处理的胚胎类型。例如对于挪威云杉，标准包括但不限于具有清晰子叶、细长尾部且全长至少比胚胎的平均横截面的直径大两倍的胚胎。形状必须相对平直，并且不能过于弯曲。为了根据所设置的标准来评价每个胚胎并以快速和成本有效的方式制备植物，离开分离器単元230的管道7的分离至仅含有胚胎的液流中的胚胎将直接被引入定向和分选 単元250中，借助液体导管引导各个胚胎通过测试段249，如图12所示。在测试段，通过光学传感器和成像系统检测胚胎。基于图像分析检查胚胎的图像。随后根据通过进ー步处理最可能萌发并形成植物的“可接受”胚胎的一套标准来测试胚胎的特征。如果通过测试段的胚胎不可接受，即其不符合所设置的标准，则将其剔除。也对胚胎定向进行确定，并且改变是不合适的。正确定向的且可接受的胚胎在液体导管中前进至沉积设备260并沉积于胚胎接收器340中。在一个实施方式中，XY工作台将对单一反应器板进行定位以使该板中的下一个空胚胎接收器容器被直接地并精确地位于出口喷嘴365沉积设备的下方，其足够长以供可接受的胚胎沉积至容器中。一旦胚胎离开沉积设备的出口并沉积至单一反应器板的容器中，XY工作台将对单一反应器板进行定位以使离开出口喷嘴365的液体沉积于胚胎接收容器300外部并进入剔除段310，如图11所示。此外，将所剔除的胚胎引导至胚胎接收容器的外部。每当检测并沉积可接收胚胎时，计算机软件可记录胚胎图像、序列号、胚胎沉积在板中的位置、沉积日期和时间、以及胚胎的唯一代码。一旦胚胎接收器被充满，可将其手动运输并安装至相应停靠站中以萌发和形成根。无定向模块的系统在对具有定向模块250的系统进行测试期间，可注意的是，定向步骤是与沉积相关的限速步骤。胚胎必须被再定向位置而进入胚胎容器340所耗费的时间比具有正确初始定向的胚胎的胚胎沉积时间约长四倍。为了加速系统，移除定向模块250而构造可替换类型的胚胎收集器312。胚胎收集器312如图16所示(A为侧视图，B为顶视图)。通过步进电动机/开关313和控制单元38以这样的方式控制胚胎收集器，即，使得当位于出ロ 365上游的定向检测器510识别胚胎后，步进电动机/开关313可根据正在通过的胚胎的定向定位胚胎收集器312。定向检测器510和控制单元38可例如为与计算机连接的成像系统，其可识别所通过胚胎的定向。如果所识别的胚胎首先具有尾/根，其会使胚胎通入胚胎容器340中，如果胚胎首先具有头，步进电动机/开关313将对胚胎收集器312进行定位以收集胚胎。在收集之后，将胚胎返回至系统中，进入分离器230或稀释器240。通过该设置，系统运行良好，并且正确沉积胚胎的速度与具有定向模块250的系统相比提高两倍。
以下实施例应解释为非限制性的。实施例实施例I :分离从周期性和部分浸入的生物反应器中收集取自集群中段的横截面的平均水力直径为5mm至30mm的挪威云杉的数个胚性细胞 团集群(细胞系06:28:05)，并供应到PCT/US09/39981所述的分散器中。如W09625484所公开的体外培养容器用作生物反应器。通过分散器之后，完全分散在水中的胚胎通过进料导管9进料并进入分离器容器5中。在将胚性细胞团集群注入分散器之前，以120rpm的速度使旋转装置(盘)和充满水的分离器容器5旋转20分钟以上。优选使旋转装置运行数分钟以上以消除由发动起的启动与静止液体引起的初始瞬变。将500_玻璃烧瓶置于管道7下方，以收集离开分离器容器5的材料。附接于管道7玻璃管的塑料管与另一通过烧瓶顶部上的压カ密合的橡胶塞插入的玻璃管(玻璃管I)相附接，并延伸至距烧瓶底部约5mm处。另ー玻璃管(玻璃管2)被压カ密合地通过烧瓶的橡胶塞，一直延伸至烧瓶的中间高度。将塑料管附接于玻璃管2的顶部并将其引导置于远低于烧瓶底部的高度的贮液器中。起初将连接管道7管和玻璃管I的顶部的塑料管夹闭，以使没有液流流经管道7管。在将分散的胚胎注入分离器容器5中之前不久，将起初夹闭的所述管打开以使液体可通过分离器容器5中的压カ头控制而流经管道7玻璃管。观察到的是，液体流经管道7的流速起初较高(如预期)直到烧瓶内的液体水平到达玻璃管2的底部末端(入口)。调节玻璃管2的管道7下游的阀(位于顶部处)以保持液体水平在烧瓶内静止。一旦在分散器中注入胚性细胞团集群，离开分散器的完全分散的胚性细胞团快速进入分离器容器5中并夹带在液流中。约3分钟时，将连接管道7管和玻璃管I的塑料管夹闭并停止马达和流动。也关闭玻璃管2下游的阀。由于管2的底部位于烧瓶底部上方约50mm并且烧瓶中的胚胎沉积在烧瓶底部，因此仅有烧瓶顶部的液体由于烧瓶中的压カ头差而通过玻璃管2被移除。收集分离器容器5、烧瓶和贮液器下游内的液体和悬浮材料，并仔细检查。在整个系统所收集的所有52个胚胎中，45个在烧瓶中，8个在分离器容器5中，玻璃管2下游的贮液器中没有胚胎。使用该系统重复试验可得到相似的結果，回收胚胎的比例为约60至85%。该实施例的系统中的旋转装置18由立体刻印制成，并附接于马达的空心轴。观察到的是，旋转装置轻微地“晃动”，即，并非精确地轴对称，在液体表面稍微产生周期行进波。与理想轴对称流动的轻微偏差的其它原因是试验中所使用的玻璃分离器容器5的直径和圆形的不精确。通常，如果精确用机器加工分离器容器5和旋转装置18和整个系统，以产生理想的轴对称流动，预计收集胚胎的效率会増加。实施例2 :沉积如图11所示，本发明的沉积设备包括x/y工作台，其具有线性马达315和具有20个或更多个容器的单一反应器板，每个容器容纳ー个胚胎个体。线性马达315附接于控制单元38。将胚胎接收器精确固定于x/y工作台的顶部上的已知位置，以使线性马达软件可精确地定位该板。胚胎接收器板包括多个容器，优选50个或更多个，其为网格形式，优选为矩形网格形式，具有特定的中心-中心间距，优选约25mm。如图IlA所示，容器可为任意适于应用的形状，优选为具有平底的锥形。对容器的壁和底部进行穿孔305以允许液体介质自由进入和排出容器。如图IIB所示，胚胎接收器板包含具有入口 330和出口 524的贮液器部分310。具有XY工作台的整个系统置于防护罩内以保持整个系统无菌。胚胎接收器板也可装备有密封盖，从而能够在无菌条件下转移。实施例3 :使用两个分离器单元的分离为了得到纯净且分离良好的成熟胚胎，以串联方式连接两个分离器230。来自第一分离器单元的出口管7连接于第二分离器单元上的给料导管9。通过该设置，可将未成熟胚性组织的量降低95%或更多。实施例4 :不使用或使用或者微量汇流涡流进行的分离液体通过管道7的排出速度与所分离的胚胎纯度之间具有明确的关系。在该上下文中“纯度”是指将未成熟胚性组织和胚胎分离的有效度；更高的纯度是指每个胚胎具有更少的胚性细胞团。通过管道7的排出速度越慢，分离速度越慢，分离过程在纯度方面就更为有效。 根据这些观察数据制成设备，其从管道7的液体流动速度几乎为零，并且使胚胎通过该出ロ沉积下来并持续收集该胚胎。在该模式下，胚胎沉积速度基于分离器容器内的胚胎数量密度和流体的旋转速度。在一个试验中，显示了当容器内有约75至100个胚胎时，在150rpm的转速下胚胎分离的速度(通过出ロ的流动速度基本为零)约为每秒I个胚胎。
权利要求
1.一种将悬浮于流体中的胚胎与未成熟胚性组织分离的方法，包括以下步骤 a)提供合适的分离器容器(5)，所述容器包含密度低于待分离的所述胚胎的流体，基本为圆柱形，具有基本平坦的底壁(6)和基本竖直的轴线； b)在所述流体中引发相对于所述底壁￠)的轴对称旋转流动，从而 i)在所述底壁(6)处产生粘性边界层(20);以及 )在所述分离器容器(5)中产生径向压力梯度； c)将待分离的所述悬浮于流体中的胚胎和未成熟胚性组织引入到存在于所述分离器容器(5)中的流体中远离所述底壁(6)的位置处，从而 i)使所述胚胎比所述未成熟胚性组织更快地沉淀； )允许所述胚胎进入所述粘性边界层(20)，同时不允许所述未成熟胚性组织进入所述粘性边界层(20)； iii)将进入所述粘性边界层(20)的所述胚胎吸取到所述底壁￠)的轴向区域中；以及 d)从所述底壁￠)的所述轴向区域收集胚胎， 由此使所收集的所述胚胎与未成熟胚性组织基本分离。
2.根据权利要求I所述的方法，进一步包括 a)提供合适的分离器容器(5)，所述分离器容器进一步包括在操作期间在所述底壁(6)的所述轴向区域处与所述容器中的流体相连通的管道(7)； b)通过从所述管道(7)中排出流体而在所述底壁￠)的所述轴向区域处产生汇流涡流；以及 c)从所述底壁￠)的所述轴向区域处在由管道(7)排出的流体中收集胚胎。
3.根据权利要求I所述的方法，进一步包括 a)提供合适的分离器容器(5)，所述分离器容器进一步包括在操作期间在所述底壁(6)的所述轴向区域处与所述容器中的流体相连通的管道(7)，其中所述管道(7)的放置和尺寸使得在操作期间被吸取到所述底壁出)的所述轴向区域中的胚胎通过重力沉淀进入所述管道(7);以及 b)从所述管道(7)中收集胚胎。
4.根据权利要求3所述的方法，进一步包括通过引导流体流经所述管道(7)进入所述分离器容器(5)中而调节所述管道(7)中所述胚胎的沉淀速度的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法适于分批操作，并进一步包括在所述胚胎发生沉淀之后但在所述未成熟胚性组织有时间发生沉淀之前的时间段期间选择性地收集所述胚胎。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述方法附加地包括在处理一批胚胎之后用新鲜流体更换所述分离器容器(5)中的流体的步骤。
7.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述方法适于连续操作，使得所述方法包括以超过流体从所述管道(7)中流出的速度的速度将流体供应到所述分离器容器(5)中。
8.—种将悬浮于流体中的胚胎与未成熟胚性组织彼此分离的设备，包括 a)分离器容器(5)，其在操作期间含有密度低于待分离的所述胚胎的密度的流体，所述容器基本为圆柱形，具有基本平坦的底壁(6)和基本竖直的轴线，并包括位于所述底壁(6)的轴向区域处、与所述容器的内侧相连通的管道(7)； b)在所述流体中引发相对于所述底壁出)的轴对称旋转流动的装置，由此在操作期间 i)在所述底壁(6)处产生粘性边界层(20)； )在所述分离器容器(5)中产生径向压カ梯度； c)将待分离的所述悬浮于流体中的胚胎和未成熟胚性组织引入到存在于所述分离器容器(5)中的流体中远离所述底壁出)的位置处的装置，由此在操作期间 i)所述胚胎基本上比所述未成熟胚性组织更快地沉淀； )所述胚胎进入所述粘性边界层(20)而所述未成熟胚性组织基本上保持在所述粘性边界层(20)外部； iii)进入所述粘性边界层(20)的所述胚胎被吸取到所述底壁￠)的轴向区域中和所述管道(7)中；以及 d)从所述管道(7)中收集所述胚胎的装置； 由此所收集的所述胚胎与未成熟胚性组织基本分离。
9.根据权利要求8所述的设备，其中， i)所述管道(7)的放置和尺寸使得在操作期间被吸取到所述底壁(6)的所述轴向区域中的所述胚胎通过重力沉淀进入到所述管道(7)中。
10.根据权利要求8-9中任一项所述的设备，其中，所述收集胚胎的装置包括从所述管道(7)收集所述胚胎而基本不改变所述容器中的流体体积的装置。
11.根据权利要求10所述的设备，其中，从所述管道(7)中移除所述胚胎而不改变所述容器中的流体体积的装置包括阀或ー组阀(36)。
12.根据权利要求8-9中任一项所述的设备，其中， i)所述设备包括从所述管道(7)中排出流体的装置，由此在操作期间在所述底壁(6)的所述轴向区域处产生汇流涡流；并且 )所述收集胚胎的装置包括在从所述管道(7)排出的流体中的汇流涡流中收集所述胚胎的装置。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的设备，其中，所述设备适于分批操作，并进一歩包括在所述胚胎已发生沉淀之后但在所述未成熟胚性组织有时间发生沉淀之前的时间段期间选择性地收集所述胚胎的装置。
14.根据权利要求8-12中任一项所述的设备，其中，所述设备适于连续操作，并进一歩包括分离器容器(5)以及以超过流体从所述管道(7)中流出的速度的速度将流体供应到所述分离器容器(5)中的装置，所述分离器容器包括位于所述分离器容器(5)的顶部处的第ニ出口(25)。
15.根据权利要求14所述的设备，其中，通过在顶部处开ロ的分离器容器(5)来实现所述第二出口(25)。
16.根据权利要求14-15中任一项所述的设备，其中，从所述汇流涡流中收集胚胎的装置包括收集离开所述管道(7)的流体的装置。
17.根据权利要求8-16中任一项所述的设备，其中，所述设备附加地包括更换所述分离器容器(5)中的流体的装置。
18.根据权利要求8-17中任一项所述的设备，其中，所述设备包括在操作期间将流体从所述底壁出)的所述轴向区域排出的装置，该装置包括从上方或任何其它方向延伸到所述底壁(6)的所述轴向区域附近的导管。
19.根据权利要求8-18中任一项所述的设备，其中，所述分离器容器(5)的直径在3-30cm的范围。
20.根据权利要求8-19中任一项所述的设备，其中，所述流体管道(7)的面积为所述底壁(6)的面积的O. 01%-10%。
21.根据权利要求8-20中任一项所述的设备，其中，所述引发轴对称旋转流动的装置在所述流体中产生的转速在5-1200rpm的范围。
22.根据权利要求8-21中任一项所述的设备，其中，所述引发轴对称旋转流动的装置包括旋转盘形或圆柱形物体。
23.根据权利要求8-22中任一项所述的设备，其中，所述引入胚胎和组织的装置位于所述流体的表面附近的轴向位置处。
24.根据权利要求8-23中任一项所述的设备，其中，在操作期间所述流体的高度为所述分离器容器(5)的直径的O. 8-1. 2倍。
25.—种将悬浮于流体的植物胚胎沉积在胚胎接收器中并同时保持所述胚胎的定向的方法，包括以下步骤 i)提供合适的胚胎接收器(340)，所述胚胎接收器具有将流体从所述接收器中排出的装置； )提供流动通道，所述流动通道的尺寸使得所述胚胎可与流经所述通道的流体一起行进，但是由于尺寸的限制被约束于向冠首或冠尾方向行进，所述流动通道具有出口(365)，其中所述流动通道包括紧邻所述出口(365)上游的流动通道段，该流动通道段具有长度至少等于所述流动通道的最大横截面内部尺寸的平直段(370)； iii)将胚胎置于所述流动通道中；以及 iv)使从所述出ロ(365)流出的流体形成自由喷射流(360)、将所述自由喷射流对准胚胎接收器(340)、并通过将所述自由喷射流用作运载工具而将所述胚胎从所述流动通道沉积到所述接收器(340)中。
26.根据权利要求25所述的方法，进ー步包括以下步骤 i)确定所述流动通道中的所述胚胎的定向； )在所述定向与期望方向不匹配的情况下，引导所述胚胎远离所述胚胎接收器(340);以及 iii)在所述定向与期望方向匹配的情况下，将所述胚胎引导到所述胚胎接收器(340)中。
27.ー种用于沉积悬浮于流体的植物胚胎而同时保持所述胚胎的定向的设备，包括 i)流动通道，其尺寸使所述胚胎与流经所述通道的流体一起行迸，但由于尺寸的限制而被约束于向冠首或冠尾方向行进，所述流动通道流出至出口(365)； )胚胎接收器(340);以及 iii)使从所述出口流出的流体形成自由喷射流(370)的装置，其中，在操作期间将所述自由喷射流对准胚胎接收器(340)，从而允许悬浮于所述流体中的胚胎沉积在所述胚胎接收器(340)中； 其特征在于 所述形成自由喷射流的装置包括紧邻所述出口(365)上游的流动通道(380)段，该流动通道段具有长度至少等于所述流动通道(380)的最大横截面内部尺寸的平直段(370)。
28.根据权利要求27所述的设备，其中，所述平直段(370)的长度为所述流动通道(380)的最大横截面内部尺寸的至少10倍。
29.根据权利要求27-28中任一项所述的设备，其中，在操作期间将出口(365)末端定位成远离所述胚胎接收器(340) —至三个流动通道直径。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的设备，其中，所述胚胎接收器(340)具有用于沉积所述胚胎的开ロ，所述开ロ的最小尺寸比待沉积的所述胚胎的最大横截面直径大至少10%。
31.根据权利要求27-30中任一项所述的设备，其中，所述设备进ー步包括使传送所述胚胎的喷射流稳定的装置，该装置包括将传送所述胚胎的喷射流包封在具有基本上更大直径的另一流体喷射流中的装置。
32.ー种用于处理悬浮于流体中的植物胚胎的系统，包括根据权利要求8-24中任ー项所述的分离器设备、以及以下中的至少ー个 a)位于所述分离器设备(230)的上游的用于分散悬浮于流体中的所述胚胎和所述胚性组织的分散器単元(220)、以及位于所述分散器単元(220)上游的作为胚胎源的可选的生物反应器(200)； b)位于所述分离器设备下游的用于定向和分选悬浮于流体中的所述胚胎的定向和分选单元(250);以及优选地位于所述定向和分选单元下游的可选的沉积设备。
33.一种系统，包括根据权利要求27-31中任一项所述的沉积设备以及以下中的至少ー个 a)用于分散悬浮于流体的所述胚胎和所述胚性组织的分散器単元、以及位于所述分散器単元上游的作为胚胎源的可选的生物反应器； b)根据权利要求8-24中任一项所述的分离器设备，其位于所述分散器単元的下游； c)用于定向和分选悬浮于流体中的所述胚胎的定向和分选单元，其位于所述分离器装置的下游和所述沉积装置的上游。
全文摘要
公开了基于流体阻力特性不同而分离悬浮于流体中的植物体细胞胚和胚性组织的方法和设备。公开了借助流体喷射流将植物体细胞胚沉积至胚胎接收器中的沉积方法和设备。还公开了将植物体细胞胚从生物反应器处理至生长基质的自动系统。
文档编号C12M1/00GK102695788SQ201080045552
公开日2012年9月26日 申请日期2010年10月8日 优先权日2009年10月9日
发明者西拉斯·K·艾邓 申请人:佐治亚科技研究公司