专利名称：一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种新的整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统的构建，及其在蛋白质生产中的应用。
背景技术：
自40多年前(1964年)Komagata等首次描述无芽孢酵母——麦芽糖假丝酵母 (Candida maltosa)，就引起了广泛的学术和工业兴趣。麦芽糖假丝酵母能够在以正构烷烃或脂肪酸作为唯一碳源作和能量的条件下生长。第一个麦芽糖假丝酵母分离株是从谷氨酸单钠制造过程中的中和槽的胶黏剂中获得。在19世纪60年代初期，碳氢生物化学成为工业研究的主题，大多数石油公司致力于微生物的潜在应用，用于生产作为食品(动物饲料) 的单细胞蛋白质和用于氨基酸、脂肪酸、留醇和其它有商业价值的物质的生物化学合成。通过基因工程技术对麦芽糖假丝酵母中宿主_载体系统的改进，带来一个显著的进步，使其更广泛的应用于生物技术和生物工业，也将增加该酵母用于基础研究的功用。与此同时，基于麦芽糖假丝酵母的特性，其可能被用于异源蛋白质的功能性表达，特别是用于疏水性蛋白质的生产。另一方面，其可用于有机化学生产中的生物转化反应。基于麦芽糖假丝酵母中宿主-载体系统改进中的最新进展，从已构建，并进行异源和同源蛋白质表达测试的麦芽糖假丝酵母中分离得到数个强表达启动子。在低拷贝复制表达质粒中使用麦芽糖假丝酵母的PGKl (磷酸甘油酸激酶)基因的启动子和终止子区域， 证实了内生P450基因和编码乳酸克鲁维酵母β -半乳糖苷酶的异源基因的功能性表达。 ALKUALK4和Ρ450启动子被用作麦芽糖假丝酵母细胞中的一些报告基因。强调控的，半乳糖-诱导和葡萄抑制的GALl (半乳糖激酶)启动子，在高拷贝(>20)质粒中被用于Ρ450 基因的高表达，ALKl-A也得到了同样的应用。另外，编码过氧化物酶体乙酰辅酶A氧化酶蛋白质ΡΧΡ-2和ΡΧΡ-4的基因Ρ0Χ2和 Ρ0Χ4分别在麦芽糖假丝酵母中得到了表达。也有报道说，使用表达质粒，实现了大肠杆菌功能性内酰胺酶在麦芽糖假丝酵母中的表达。然而，本领域至今还没有关于异源蛋白质在整合型麦芽糖假丝酵母中的表达的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用。在本发明的第一方面，提供一种蛋白表达(或生产)系统，其包括(1)麦芽糖假丝酵母，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；(2)表达构建体，所述表达构建体从5’ 一 3’依次包括以下可操作性相连的元件GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因， Origin。在另一优选例中，所述的Origin是ApR-Origin。
在另一优选例中，所述的终止子是C-PGK1。在另一优选例中，所述的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，包括至少一个多克隆位点(酶切位点)，用于外源蛋白的编码基因的插入。在另一优选例中，GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因各个元件之间，包括或不包括间隔序列，该间隔序列的长度为I-IOObp ；较佳地 l-50bp。在另一优选例中，GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin各个元件之间，包括或不包括多克隆位点(酶切位点)的DNA序列。在另一优选例中，所述的外源蛋白的编码基因包括(但不限于)植酸酶基因，淀粉酶基因。在另一优选例中，所述的植酸酶基因是Non-K12大肠杆菌(Escherichia coli)植
酸酶基因。在另一优选例中，所述的淀粉酶基因是环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)淀粉
酶基因。在另一优选例中，所述的Origin的DNA序列如SEQ ID NO 5所示；或所述的GALl启动子的DNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的α -结合因子分泌引导序列如SEQ ID NO 3所示；或所述的终止子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；或所述的麦芽糖假丝酵母His5基因的DNA序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的植酸酶基因的DNA序列SEQ ID NO 8所示；或所述的淀粉酶基因的DNA序列SEQ ID NO 9所示。在另一优选例中，所述的表达构建体是表达载体。在另一优选例中，所述的表达构建物的DNA序列如SEQ ID NO 7所示。在另一优选例中，所述的麦芽糖假丝酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。在本发明的另一方面，提供所述的蛋白表达系统的用途，用于表达外源蛋白。在另一优选例中，所述的外源蛋白包括(但不限于)植酸酶基因，淀粉酶基因。在本发明的另一方面，提供一种表达外源蛋白的方法，其包括(a)提供所述的蛋白表达系统；(b)将外源蛋白的编码基因的DNA序列插入到所述表达构建体的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，获得携带外源蛋白的编码基因的表达构建体；(c)将所述的携带外源蛋白的编码基因的表达构建体转入到所述麦芽糖假丝酵母中，从而获得基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母；(d)培养所述的基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母，从而表达所述的外源蛋白。在另一优选例中，所述方法还包括(e)从培养物中分离(或纯化)所述的外源蛋白。在本发明的另一方面，提供一种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 8 (植酸酶的DNA序列)所示。
在本发明的另一方面，提供一种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO 9 (淀粉酶的DNA序列)所示。在另一优选例中，所述的核酸分子在麦芽糖假丝酵母基因表达系统中的表达出蛋白质。在另一优选例中，所述核酸分子是经过密码子优化的核酸分子。在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；且其中还包含表达构建体，所述表达构建体从5’一 3’依次包括以下可操作性相连的元件GAL1 启动子，α -结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin。在另一优选例中，所述的表达构建体整合于所述宿主细胞的基因组中。在另一优选例中，所述的宿主细胞是(但不限于)来自中国普通微生物保藏中心 (CGMCC)的细胞株 CGMCC No. 2. 1371。在本发明的另一方面，提供一种组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、组氨酸营养缺陷型麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的突变株在各培养基平板上的生长状态。图2、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371及其营养缺陷型突变株的生长曲线。图3、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的GALl启动子基因序列(SEQID NO 2)。图4、麦芽糖假丝酵母基因表达系统的α -结合因子分泌引导序列(SEQ IDNO 3)。图5、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的C-PGK1转录终止子序列(SEQID NO 4)。图6、麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的His5基因序列(SEQ ID NO :1)。图7、大肠杆菌中DNA扩增片段ApR-Ori的基因序列(SEQ ID NO 5)。图8、表达穿梭载体pGALHis5的构建图。图9、分泌型表达穿梭载体pGALHis5S的构建图。图10、表达穿梭载体pGALHis5的基因序列(SEQ ID NO 6)。图11、分泌型表达穿梭载体pGALHis5S的基因序列(SEQ ID NO 7)。图12、合成的Non-K12大肠杆菌植酸酶编码基因序列(SEQ ID NO 8)。图13、合成的环状芽孢杆菌α -淀粉酶编码基因序列(SEQ ID NO 9)。图14、麦芽糖假丝酵母表达的Νοη-Κ12大肠杆菌植酸酶的SDS-PAGE。A 蛋白质标样；B 植酸酶重组菌株发酵上清液(96hr)。图15、麦芽糖假丝酵母表达的环状芽孢杆菌α -淀粉酶的SDS-PAGE。A 蛋白质标样；B α -淀粉酶重组菌株发酵上清液(48hr)；C α -淀粉酶重组菌株发酵上清液(96hr)。
具体实施例方式本发明人长期致力于改进蛋白的表达技术，经过深入的研究，揭示了一种新型整合型基因表达系统，包括组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母以及表达构建体，所述表达构建体包括元件=GALl启动子，α -结合因子分泌引导序列，终止子(如C-PGK1)和麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin (如ApR-Origin)。经验证该表达系统可用于多种蛋白的表达， 表达效率和表达量良好。术语如本文所用，所述的“表达构建体(或称DNA构建体)，，指一种已经通过人为干预修饰，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA 分子。如本文所用，“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列， 本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件” 的功能，其通过插入或删除一些碱基(如l_50bp ；较佳地l_30bp，更佳地l-20bp，更佳地 I-IObp)，或进行随机或定点突变等来获得。如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。如本文所用，“外源蛋白(异源蛋白质)”是指可由本发明的整合型基因表达系统表达的蛋白。合适的蛋白包括但不限于植酸酶(如non-K12大肠杆菌植酸酶)，淀粉酶 (如环状芽孢杆菌α-淀粉酶)，脂肪酶(如亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)脂肪酶和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶)，葡聚糖酶(如地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)葡聚糖酶)，木聚糖酶(如里氏木霉(Trichodermareesei)木聚糖酶)等。如本文所用，所述的“外源蛋白的编码基因”也称为“异源DNA”，指在所给定的宿主细胞中原本不存在的一种DNA分子，或一个DNA分子群；或指异于特定宿主细胞的DNA分子。例如，一个包含被操作性连接到组成转录启动子的宿主DNA片段的编码多肽的非宿主 DNA片段的DNA分子，可被当成一个异源DNA分子。如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接” 到该核酸序列上。如本文所用，所述的“整合型转化子”是异源DNA已经被介导进入其内部的细胞， 并且该异源DNA已经整合到细胞的基因组DNA中。如本文所用，所述的“线性DNA”是指有游离5’和3’端的DNA分子，其是非环状 DNA分子。线性DNA能够通过对闭合的环状DNA分子如质粒进行酶切获得，或通过PCR反应进行的DNA合成获得。如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，代表本领域所共知的含义，表示一个基因的一部分，其含有可供RNA聚合酶结合的DNA序列和转录的起始点。启动子，
6一般情况下，会在基因的5’端非编码区被发现。启动子中的在转录起始点起功用的序列组件常常用共知的核苷酸序列进行表征。这些启动子组件包括RNA聚合酶结合位点， TATA 序列，CAAT 序列，特异性组件(DSEs ；McGehee et al.，Mol. Endocrinol. 7 :551_560， 1993)，环腺苷酸响应组件(CREs)，血清响应组件(SREs ；Treisman, Seminars in Cancer Biol. 1 :47-58，1990)，糖皮质激素响应组件(GREs)，和其它转录因子的结合位点，如CRE/ ATF (0，Reilly et al.，J. Biol. Chem. 267 19938-19943，1992)、AP2 (Ye et al.，J. Biol. Chem. 269 :25728_25734，1994)、SP1、环腺苷酸响应组件结合蛋白质(CREB ；Loeken, Gene Expr. 3 :253_264，1993)和八聚合体因子(参见 Watson et al.，eds. ,Molecular Biology of the Gene,4th ed.，The Benjamin/Cummings Pub 1 ishingCompany, Inc.，Menlo Park, Calif. , 1987 ；and Lemaigre and Rousseau, Biochem. J. 303 1-14,1994.)。如本文所用，所述的“对数生长初期”是指培养基中细胞浓度从2X IO6个细胞/ml 增长到8 X IO6个细胞/ml的细胞生长阶段。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、 “基本上由……构成”、和“由……构成”;“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由…… 构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。本发明提供，用于介导异源DNA进入无芽孢酵母麦芽糖假丝酵母，用于选择介导进入的细胞和用于在麦芽糖假丝酵母中生产异源多肽的方法。本发明中的方法可被用于多肽和蛋白质的生产，进一步的，生产的多肽和蛋白质可以是高级有机体的多肽和蛋白质，更进一步的，其所叙述的高级有机体可以是人。本发明还将进一步提供，用其它DNA分子转化麦芽糖假丝酵母的方法，所述的DNA分子包括DNA文库和合成DNA分子。本发明从而可提供，能够用于表达基因多样性文库，产生能够从中筛选新的生物活性物质的产品的技术；本发明还提供，能够用作筛选复合物库标靶的工程细胞，和能够提高其在其它工序中的利用率的基因修饰细胞的技术。酵母细胞麦芽糖假丝酵母菌株可从中国普通微生物保藏中心(CGMCC)和其它机构获得。在本发明的一个实施方式中，用异源DNA转化的细胞将有一个能够被异源DNA分子上的一个基因(一个“选择性标记”)所补充的突变，该选择性标记允许转化的细胞在该条件下生长， 而非转化的细胞则不能增长(“选择性条件”)。选择的一般原则为本领域所共知。常用的选择性标记为编码合成氨基酸或核苷酸所必需的酶的基因。在这些基因上有突变的细胞在缺少特定氨基酸或核苷酸的培养基中不能生长，除非该突变能够被选择性标记所补充。使用这样的“选择性”培养基，能够确保稳定保持宿主细胞中的异源DNA。作为本发明的优选方式，在麦芽糖假丝酵母中使用的这种类型的选择性标记是一个编码组氨酸_磷酸转氨酶的His5基因。当该His5基因转化进入his5宿主细胞后，可使细胞在缺少组氨酸的条件下生长。一个代表性的麦芽糖假丝酵母His5基因序列的编码链如SEQ ID N0:1所示。在本发明优选的一个实施方式中，一个由His5基因的核苷酸所组成的DNA片段被用作选择性标记，更长的或更短的片段都能被使用，只要其编码的一部分能够被操作性连接到启动子和终止子序列。本领域中的熟练技术人员将认可这里所提供的这个序列和其它序列代表各自基因的单等位基因，并期望存在等位变异。任何功能性His5等位基因都可用于本发明。其它营养型标记也可用于发明，包括麦芽糖假丝酵母ADE2、HIS4和LEU2基因，在分别缺少腺嘌呤、组氨酸和亮氨酸的条件下可进行选择。异源基因，如来源于其它真菌的基因也可用作选择性标记。细胞首先被暴露在诱变条件下，如能够引起细胞中基因突变的环境条件下，以获取麦芽糖假丝酵母营养缺陷型突变株。细胞诱变的方法为本领域的人员所共知，包括化学处理，或紫外灯曝光(Lawrence,Methods Enzymol，194 :273_281，1991.)。获得诱变细胞的比例与用于细胞处理的诱变剂的强度或剂量相关。低水平的诱变剂产生小比例的突变型细胞，高水平的诱变剂产生高比例的突变型细胞，但也会杀死更多的细胞。因此需要对诱变和致死进行平衡，从而获得合理数量的突变型细胞。通常通过在不同条件下处理细胞，建立致死曲线，进行经验性的平衡。一般地，细胞被暴露在诱变条件下，并培养1天，然后按照标准分析方法测定其细胞活性。在本发明中，优选使用会导致20-50%死亡率的诱变水平，在本领域中的熟练技术人员将认可该数值可根据需要进行调节，例如诱变时使用非常大量的细胞。然后在富集培养基中培养允许突变至少在细胞群的一部分中可以保持和复制的诱变细胞。该步骤允许基因组已经被改变为可复制突变，并能将其传给它们子孙的细胞进行繁殖和增长，从而使突变在细胞群中得到保持。通过检测处理后细胞的营养需求来确定和表征营养缺陷型突变，在该检测中常使用影印培养技术。细胞同时被接种于富集培养基和缺少特定营养的培养基平板上。细胞尤其不能在不含其营养缺陷所对应养分的平板上生长。互补分析可用于进行进一步的表征。异源DNA可通过数种已知方法中的任一种被介导进入麦芽糖假丝酵母细胞中，这些方法包括锂转化(Hiep et al.，Yeast 9 :1189_1197，1993 ；Tarutina andTolstorukov, Abst. of the 15th International Specialized Symposium on Yeasts, Riga(USSR), 1991,137 ；Ito et al. , J, Bacteriol. 153 163,1983 ；Bogdanova etal. , Yeast 11 :343, 1995)，原生质体转化(Beggs, Nature 275 :104，1978 ；Hinnenet al.，Proc. Natl. Acad. Sci.USA 75 :1929,1978 ；Cregg et al.，Mol. Cell. Biol. 5 :3376，1985)，冻-融聚乙二醇转化(Pichia Expression Kit Instruction Manual,Invitrogen Corp. ,San Diego,Calif., Cat.No.K1710-01)，或电转化。在本发明优选的一个实施方式中，电转化被用于促进DNA进入麦芽糖假丝酵母细胞的介导过程。电转化是使用脉冲电场对细胞膜进行短暂的可渗透化处理(细胞膜打洞)，从而使其允许如DNA分子等大分子物质能够进入细胞内的一个操作过程。目前已有关于电转化用于哺乳动物(e. g.，Neumann et al.，EMBO J. 1 =841-845,1982) 和真菌(e. g.，Meilhoc et al.，Bio/Technology 8 :223_227，1990)宿主细胞的叙述。尽管如此，DNA转移进入细胞的有效机制，还不是非常清楚。研究发现，对于麦芽糖假丝酵母的转化，当细胞处于指数衰退期时，采用场强为2. 5-4. 5kV/cm和时间常数(.tau.)为1_40 毫秒的脉冲电场，电转化有很高的效率。时间常数.tau.是指初始峰电压V. sub. O下降到 V. sub. 0/e值所需要的时间。时间常数能够根据脉冲电路所产生的总的电阻和电容进行计算，例如，.tau. =RXC0电阻和电容是预置的，还是可通过使用者进行选择，通常依赖于所选择的电转化设备。无论如何，设备配置应该依照制造商的说明书所提供的如以上所讨论的场强和衰变参数。电转化设备均能够从商业供给者处获得(如BioRadLaboratories， Hercules, Calif.)。用于转化麦芽糖假丝酵母的DNA分子将通常需被制备成双链环状质粒，并且在转化前最好线性化。对于多肽或蛋白质生产，DNA分子应包含，除了如以上所讨论的选择性标记之外的一个由转录启动子、编码多肽或蛋白质的DNA片段(如一条基因)和转录终止子所组成的基因表达框。这些组件被操作性连接到所提供的用于转录的插入DNA片段。优选的启动子和终止子是麦芽糖假丝酵母基因。有用的启动子包含那些构建性启动子和半乳糖诱导启动子。启动子序列通常含有一个基因编码序列上游的1.5kb，常常是lkb，或更小。 一般地，调节性启动子比构建性启动子要大，因其要有调节组件的存在。例如甲醇诱导启动子，同时含有正、反调节组件，可能会从初始ATG往上游延伸大于lkb。可通过功能和按照已知的方法进行克隆对启动子进行鉴定。本发明中所使用的表达构建体将进一步包括一个能够允许转化子的鉴定、选择和保持的选择性标记。该表达构建体可能会进一步含有如一个复制区和一个选择性标记等， 能够使DNA可以在另外一个宿主(如大肠杆菌)中扩增和保持的添加组件。为了促进DNA 整合进入宿主染色体，优选使用完整的表达片段，其由启动子_插入基因_终止子_选择性标记所组成，其两侧均为宿主DNA序列。这可通过使表达片段下游末端含有3’端未翻译的 DNA序列，并使其依赖于启动子序列的5’端，来方便地实现。当使用线性DNA时，表达片段的侧面将会含有能够允许分子线性化和从其它序列(如细菌的复制区和选择性标记)中分离表达片段的剪切位点。优选的这种剪切位点是那些可被不会剪切DNA序列内部的限制性内切核酸酶所识别的位点，如那些识别8碱基目标序列的内切酶位点等(如NotI)。使用本发明的方法能够在麦芽糖假丝酵母被生产的蛋白质包括有工业价值和药用价值的蛋白质。这些蛋白质包括来自植物和动物的高等真核生物蛋白质，尤其是如哺乳动物等脊椎动物，虽然微生物来源的某些蛋白质也有很高的价值。使用本发明的方法能够制备的蛋白质包括如植酸酶、脂肪酶、葡聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等等的酶，包括蛋白酶抑制剂在内的酶抑制剂，如血小板源生长因子、成纤维细胞生长因子和表皮生长因子等等的生长因子，如红细胞生成素和血小板生成素等等的细胞因子，以及如胰岛素、瘦素和胰高血糖素等等的激素。本发明中所使用的麦芽糖假丝酵母细胞，在由充足的碳源、氮源和微量营养所组成的培养基中，于25-35°C的温度下进行培养。采用常规手段，如小的震荡摇瓶和气升式发酵罐等为液体培养提供足够的通气。一种优选的培养基为YEPD培养基。细胞可稀释到新的培养基进行传代，或在平板上冷藏进行短期保藏。优选将细胞置于50%甘油溶液中， 于-70°C下进行长期保藏。麦芽糖假丝酵母的电转化最好在其对数生长初期进行。在固体培养基上培养得到细胞的单克隆菌落，最优的为YEPD固体培养基。在30°C下大约培养2天后，来自新平板上的单克隆被接种预置体积的富集培养基中(如YEPD)，培养至细胞密度约为5-10X IO5个细胞/ml。在25-35°C下，最优的为30°C下，孵育细胞(剧烈震荡)，直至细胞到达对数生长初期。然后收获细胞，如通过3000Xg离心2-3分钟，并再次悬浮细胞。通过还原细胞壁中的二硫键来制备电转感受态细胞，在一种与电穿孔条件相兼容的离子溶液中对细胞进行平衡，并冷却细胞。细胞通常被制备成电转感受态通过在含有如二硫苏糖醇(DTT)或β-巯基乙醇(BME)等的还原剂的，ρΗ6-8的缓冲溶液中孵育细胞，来还原细胞壁蛋白质以促进其随后吸收DNA。一种优选的孵育缓冲液为新配置的50mM磷酸钾缓冲液(pH7. 5)，其含有25mM DTT0在该缓冲液中孵育细胞(通常使用1/5原培养液体积的缓冲液)，于约30°C下，大约5-30分钟，最优的为约15分钟。然后收获细胞，并用合适的电穿孔缓冲液(已预冰冷的) 洗涤细胞。在本研究中合适的缓冲液包括PH6-8的溶液，其含有弱缓冲液、二价阳离子(如 Mg2+，Ca2+)和渗透稳定剂(如糖)。洗涤后，用小体积的缓冲液重新悬浮细胞，在其成为电转感受态时，能够直接被使用或等体积分装后冷冻保藏(最优的为在_70°C下)。优选的电转化缓冲液为STM(270mM蔗糖，IOmM Tris, pH7. 5，ImM MgCl)。在优选的一个方案中，对细胞进行两次洗涤，先使用原培养液体积的缓冲液(已预冰冷的)洗涤，再使用1/2原培养液体积的缓冲液(已预冰冷的)洗涤。第二次洗涤后，收获并重新悬浮细胞，对于原培养液体积为200ml的细胞，通常使用约3-5ml缓冲液。使用小量的(通常约为0.1ml)电转感受态细胞和不超过其1/10体积的线性 DNA分子进行电转化。例如，0. Iml悬浮于离子强度不超过50mM的缓冲液中的细胞可与 0. I-IOug DNA结合。将电转感受态细胞和线性DNA分子的混合物放入已预冰冷的电转化杯中，然后将其置于指数衰减的脉冲电场中，场强为2. 5-4. 5kV/cm，优选3. 75kV/cm,时间常数为1-40毫秒，优选10-30毫秒，更优选15-25毫秒，最优选20毫秒。用实际使用的仪器设施实现预期的脉冲参数，将取决于所使用的仪器。当使用BioRad(Hercules，Calif.) Gene Pulser. TM.电转仪，并用2mm电转化杯进行转化时，设定电阻为600ohms或更高，优选“极大地”电阻，设定电容为25uF，以获得预期的电场特征。电转化结束后，将细胞加入到 Iml YEPD液体培养基中(稀释约10倍)，然后于30°C下培养1小时。然后收获细胞，并涂布接种选择性培养基平板。在一个优选的实施方式中，先用小量的(等于稀释后已电转化细胞的体积)IX酵母氮源(6. 7g/L无氨基酸酵母氮源；Difco Laboratori es，Detro i t，Mi ch.)洗涤细胞一次，再将其涂布接种于选择性基本培养基平板。 已被用His5选择性标记转化的含有his5突变的细胞，能够在缺少组氨酸的基本培养基平板上生长。蛋白质生产工艺中优选使用整合型转化子。这样的细胞可以在没有持续的选择性压力的条件下传代，因为DNA很少会从基因组中丢失。通过基因杂交分析(Southern blot analysis)能够确定DNA已整合进入宿主染色体。简要的说，即用限制性内切核酸酶酶切转化的和未转化的宿主DNA，进行电泳分离，将其印迹到一个支持膜上，再用合适的宿主DNA 片段进行探针检测。未转化和已转化细胞中可见的碎片图形上的差异代表整合型转化。可选择限制性内切酶和探针来鉴定基因组碎片中的转化DNA片段(例如启动子、终止子、异源 DNA和选择性标记序列)。异源蛋白质在表达水平上的差异，是由如整合位点、表达框的拷贝数和单独分离株之间启动子活性的差异等因素引起的。因此，在选择一个生产菌株之前，对大量的分离株的表达水平进行筛选是有益的。各种适用的筛选方法都可使用。例如，生长在用膜(如硝酸纤维素膜)覆盖的培养基平板上的转化子克隆。蛋白质通过分泌或随后裂解细胞的方式从细胞中释放出来，并结合到膜上。然后使用常规的方法对这些结合蛋白质进行分析，可使用的常规方法包括免疫分析法。可通过在液体培养基中培养细胞，并分析条件培养液或细胞裂解物(具体视情况而定)来实现对表达水平更准确的分析。可用一些重要的蛋白质进行实验，来部分确定用于从培养液和裂解物中浓缩和纯化蛋白质的方法。这些方法易于被熟练的技术人员选择和操作。对于小规模的蛋白质生产(如平板或摇瓶生产)，可在存在半乳糖和干扰量的其它碳源(如葡萄糖)的培养基中培养携带由半乳糖调控启动子(如GALl启动子)组成的表达框的麦芽糖假丝酵母转化子。对于小规模的实验，包括表达水平的初步筛选，可于 30°C下，在固体培养基上培养转化子，其所用的一个固体培养基比如含有20g/L细菌琼脂 (Difco)、6.7g/L无氨基酸酵母氮源(DifCO)、10g/L半乳糖和0.4ug/L生物素。由于半乳糖是容易挥发的碳源，其在长期诱导过程中会迅速损失。可在倒置平板的盖子中加入一些 20%半乳糖水溶液，来实现半乳糖的持续供给，因为半乳糖可以通过蒸发转移到生长细胞。 略大规模的实验，可通过在摇瓶中进行培养来实施。在通常的操作程序中，细胞于30°C下培养2天。对于生产规模的培养，需先在摇瓶中制备高产克隆的新鲜培养液，然后将最终的培养液接种到发酵罐培养基中。通常情况下，将500ml在YEPD培养基中，30°C下培养1_2天的培养液，接种于5L发酵罐中。使用合适的培养基(含有盐、葡萄糖、生物素和微量元素)， 在28°C、pH5. 0和> 30%溶解氧的条件下培养细胞。在初始添加的葡萄糖被消耗之后(可用耗氧降低作为指示)，向发酵罐中加入半乳糖，以诱导目标蛋白质的产生。由于大规模发酵是在限制碳源的条件下进行，所以培养基中存在的葡萄糖，不会抑制半乳糖诱导启动子。 在生理生长期，碳到生物质的转化会高效、快速的进行，尽管仍然在对半乳糖；诱导基因启动子进行全诱导。在常规的发酵过程中，细胞密度大约可达到80-400g/L(菌湿重)。“菌湿重”是指从发酵罐中单位体积的培养液收获细胞时，所得到的细胞质量，通常采用对培养液进行离心来收获细胞。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆实验室指南》(美国纽约州冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press), 1989)；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)(科学出版社，2008)；朱检等，生物化学实验[Μ](上海科学技术出版社，1995)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，百分比和份数均按重量计算。I.实验材料和试剂1.菌株和载体麦芽糖假丝酵母细胞CGMCC No. 2. 1371购自中国普通微生物保藏中心，大肠杆菌 DH5a和载体pUC 19均购自上海生工公司。2.酶类及其它生化试剂限制性内切酶、DNA标记物、蛋白质标记物、磷酸单酯酶Pmase、T4多核苷酸激酶、 [Y -32P] ATP均购自Fermentas (MBI)公司，其他常规试剂购自中国上海生物工程有限公司或上海Sigma公司。3.培养基LB培养基、YPD、YEPD、MM、MD培养基均参照英杰公司毕氏酵母操作手册制备。YEPD 培养基1% (w/v)酵母粉；2% (w/v)蛋白胨；2% (w/v)葡萄糖；1. 34% (w/ ν)酵母氮源；IOOmM磷酸钾pH6. 0。基本培养基IOOmM磷酸钾pH6.0; 1.34% (w/v)无氨基酸酵母氮源；4X 10_5 % (w/v)生物素；2% (w/v)葡萄糖。
II.实施例实施例1、制备麦芽糖假丝酵母营养缺陷型菌株将麦芽糖假丝酵母细胞(CGMCC No. 2. 1371，中国普通微生物保藏中心)在YPD培养基(1% (w/v)酵母粉，2% (w/v)蛋白胨，2% (w/v)葡萄糖)上，28°C培养16小时。离心收集细胞，并将其重新悬浮于无菌水中。通过计数测定细胞浓度后，将其涂布接种于YPD培养基平板上。将平板置于紫外灯下(采用G8T5紫外杀菌灯(Sylvania)和30厘米照射距离)，进行不同时间段的照射。照射完后，将平板置于28°C下培养，测定克隆数，并以此计算存活率。将细胞进行稀释后，涂布接种YEPD培养基平板，并采用影印接种法同时接种匪(1.34% (w/v)无组氨酸酵母氮源，2% (w/v)葡萄糖，0.002% (w/v)生物素)培养基平板，对营养缺陷型菌株进行传代培养。从YPD培养基平板上，挑选出其在匪培养基平板上对应位置不能生长的克隆，划线培养获得单克隆，并在补充有组氨酸的匪培养基平板上进行试验，所述的麦芽糖假丝酵母营养缺陷型菌株(C41 His5-)在各培养基上的生长状况如图1，其在补充有组氨酸的YEPD培养基中的生长曲线如图2。该麦芽糖假丝酵母营养缺陷型菌株(C41His5-)在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 CGMCCNo. 4499。实施例2、麦芽糖假丝酵母Hi s5基因的克隆过夜培养麦芽糖假丝酵母(营养缺陷型)，收集细胞，分离、提取基因组DNA，然后用限制性内切酶EcoRI进行酶切。在λ噬菌体(Lamda GT 11，获自Invitrogen公司)中构建麦芽糖假丝酵母的基因组文库。用人工合成的麦芽糖假丝酵母IAM 12247 (T. Hikiji et al. 1989, Curr Genet 16 :261_266)的 His5 寡核苷酸，其序列为5，-AAAACTGGTATCTTGT TAGATGCTAATGAAAATACTCATGGTCC-3，(NCBI :Χ17310· 1) (SEQ ID NO 10)，从基因组文库中筛选麦芽糖假丝酵母CGMCC No. 2. 1371的His5基因片段。根据λ构建库中麦芽糖假丝酵母 His5 基因片段的序列设计 PCR 引物 5，-AGCTAGCTTGACTCATACTTGAGCGCGGTAAAG-3’ (SEQ ID NO 11)和 5，-AGAATTCTTCATCATGAACAAGGAAATCTTTTCTAG-3’ (SEQ ID NO 12)(分别含有酶切位点NheI和EcoRI，如划线部分所示)，进行PCR，扩增含有5’端启动子和3’端侧翼序列的His5基因。His5基因的长度为1614bp，含有5，端和3，端侧翼序列，DNA序列及编码的氨基酸序列如SEQ ID NO :1 (图6)所示。实施例3、合成GALl启动子从以上所述的麦芽糖假丝酵母基因组文库中，筛选GALl (编码半乳糖激酶)基因片段。根据麦芽糖假丝酵母IAM 12247的GALl基因序列合成GALl寡核苷酸，其序列为5，-TTTTATTCCAACGTCGAAACCTAATCAACAGAGATTCACTGAAGTC-3，(SEQ ID NO 13)(NCBI D29759. 1)，用P32标记(先用磷酸单酯酶PMase去掉寡核苷酸片段端点核苷酸的游离磷酸根，露出-0H，再用T4多核苷酸激酶和放射性同位素P32 (简记为γ -P32)标记过的ATP，将寡核苷酸片段5’末端核苷酸的5’位上接上Y-P32，即得到P32标记的寡核苷酸片段)后， 用于GALl基因片段的筛选。将GALl基因片段克隆的pUC 19载体上，进行DNA序列测定。根据筛选得到的GALl 基因的DNA序列设计2个寡核苷酸引物，其序列分别为5’ -TACCTAGGATGATTATTATTGGAGTA AGTG-3' (SEQ ID NO 14)和 5，_ATCTCGAG CATATG Γ A CCG A TT A A GTTT A ΓΤΓΤΓΓΓΤΓτΓτ A G-.^i ^S
12EQ IDNO 15)(分别带AvrII和XhoI, NdeI酶切位点，如划线部分所示)。并用其进行PCR 反应，扩增GALl启动子。GALl启动子的长度为828bp，DNA序列如SEQ ID NO 2所示。鉴定了潜在的TATA框和重复序列，如图3所示。实施例4、α-结合因子分泌引导DNA片段的合成根据麦芽糖假丝酵母偏好密码子对克鲁维乳酸酵母α -结合因子分泌引导的DNA 序列(NCBI =XM 454814. 1)进行优化，送英俊公司(中国上海)人工合成该DNA片段，并在合成的DNA片段中加入5，端NdeI限制性酶切位点和3，端XhoI.StuI和NotI序列。合成的α -结合因子分泌引导的DNA序列如SEQ ID NO 3所示(图4)。实施例5、转录终止子DNA片段的合成从以上所叙述的麦芽糖假丝酵母基因组文库中，筛选麦芽糖假丝酵母C-PGKl (磷酸甘油酸激酶I)基因。根据麦芽糖假丝酵母IAM 12247的C-PGK基因序列设计、并合成寡核苷酸片段，其序列为 5，-TTATCCAACAAATTATCTGTCAAAGACTTAAACGTCACTGGTAAAAGAGT-3， (SEQ ID NO 16) (NCBI :D12474. 1)，用P32对其进行放射性同位素标记后，用于进行C-PGK 基因的筛选。PCR合成C-PGK转录终止子DNA所使用的引物为5’ -CTCGAGG CGGCCGC TTGATTTTTTATGACACTTGTG-3，(SEQ ID NO 17)和 5’ -ATGAATTCTTTGAACAATCTGAGGTTGTGG-3，(SEQ ID NO 18)(分别含有酶切位点XhoI.NotI和EcoRI，如划线部分所示)。C-PGK转录终止子的长度为578bp，DNA序列如SEQ ID NO 4所示(图5)。实施例6、大肠杆菌中DNA扩增片段Apr-Ori的合成DNA扩增片段包含突变区(pMBl复制子)和选择性标记，可通过PCR从质粒 pUC19(购自上海生工)上制备的编码β -内酰胺酶的bla(ApR)基因(来自Tn3转座子)， 其作为选择性标记，可赋予对氨苄青霉素的抗性。以PUC19为模板，PCR所用5’端引物为 5’-GCTAGCCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTT-3’ (SEQ ID NO 19)(含有酶切位点 NheI)，3，端引物为 5，-CCTAGGTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAG-3’ (SEQ ID NO 20)(含有酶切位点 AvrII)。 可依照相应的条件进行PCR反应，具体的说，可依据本发明通过使用引物设定扩增反应，此为本领域熟练技术人员所熟知。例如，常使用的一个PCR设定条件为先94°C加热5分钟； 然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 2分钟，如此重复30个循环；最后再72°C 7分钟。进行 PCR反应时可使用常规热循环仪，如Perkin Elmer公司制造的9600型等；可使用商品化热稳定的DNA聚合酶，如ExTaq DNA聚合酶(Invitrogen Biotechnology Inc)等。反应混合物的组成，可以依照附于以上聚合酶产品的生产厂商的说明书进行调整。扩增片段Apr-Ori 的长度为2191bp，DNA序列如SEQ ID NO 5所示(图7)。实施例7、构建表达穿梭载体pGALHis5第一步将GAL启动子和C-PGK转录终止子DNA片段进行组合，具体的为用限制性内切酶XhoI对GAL启动子PCR DNA片段进行酶切，与同样用XhoI酶切后的C-PGK转录终止子PCR片段进行连接。第二步使用引物(对应于5’端GAL和3’端C-PGK转录终止子)，依照本发明进行扩增，获得含有GAL启动子和C-PGK转录终止子DNA的新的PCR产物GAL-C-PGK。PCR反应的设定条件可为先94°C加热5分钟；然后94°C 30秒，55°C 30秒，72°C 1分钟，如此重复 30个循环；最后再72°C 7分钟。第三步纯化第二步所得到的PCR DNA片段，用于进一步的实验。
第四步用限制性内切酶AvrII和EcoRI对含有GAL启动子和C-PGK转录终止子 DNA序列的组合PCR DNA片段GAL-C-PGK进行酶切，用NheI和AvrII对Apr-Ori DNA片段进行酶切，用NheI和EcoRI对His5 DNA片段进行酶切。然后将以上三种酶切后的DNA片段混合，进行DNA连接，之后将其用于转化大肠杆菌。第五步将第四步中DNA的连接物转入DH5 α感受态细胞中，通过进行DNA制备、 限制性酶切和DNA测序，对大肠杆菌转化子进行筛选，获得pGALHis5质粒。表达穿梭载体pGALHis5的构建图如图8所示，所测得的DNA序列如SEQID NO 6 所示(图10)，与设计的组合及序列完全一致，说明获得了正确的构建质粒。实施例8、构建分泌型穿梭载体pGALHis5SpGALHis5S载体拥有用于外源蛋白质分泌的α-结合因子分泌引导序列 (Alpha-F)。合成α -结合因子分泌引导序列DNA(SEQ ID NO :3)，在其5，端和3，端分别加入限制性酶切位点NdeI和XhoI, StuI, NotI0用限制性内切酶NdeI和NotI对合成的 α -结合因子分泌引导序列DNA进行酶切后，将其插入到同样用NdeI和NotI进行酶切的 pGALHis5质粒中。α -结合因子分泌引导序列中的限制性酶切位点XhoI被用于克隆清除掉Kex2蛋白酶剪切位点的目标基因，以表达天然N-端蛋白质。将a-factor和pGALHis5 的DNA连接物转入DH5a感受态细胞中，通过进行DNA制备、限制性酶切和DNA测序，对大肠杆菌转化子进行筛选，获得pGALHis5S质粒。质粒pGALHis5S的多克隆位点如图9所示，所测得的DNA序列如SEQ IDNO 7所示 (图11)，与设计的组合及序列完全一致，说明获得了正确的构建质粒。实施例9、Non-K12大肠杆菌植酸酶的克隆和表达将密码子优化后的编码Non-K12大肠杆菌植酸酶的核苷酸分子送基因合成公司 (上海英俊，中国上海)进行人工合成。基因阅读框序列如SEQ ID NO 8所示(图12)。在合成DNA的5’末端和3’末端，分别设定两个酶切位点StuI和NotI。用StuI和NotI对合成的DNA片段进行酶切后，将其克隆到同样经StuI和NotI酶切的载体pGALHis5S中。然后将重组DNA转化进入大肠杆菌DH5 α，进行DNA复制和DNA测序。将含有植酸酶基因的 pGALHis5S的构建DNA分子命名为pGALHisPhy，用AvrII对其进行线性化酶切后，用于转化麦芽糖假丝酵母(组氨酸营养缺陷型)细胞。实施例10、环状芽孢杆菌淀粉酶基因的克隆和表达依照如SEQ ID NO 9所示(图13)的序列，委托基因合成公司(上海英俊，中国上海)人工合成环状芽孢杆菌淀粉酶基因，该序列的5’端和3’端分别含有限制性酶切位点StuI和NotI。按照以上所叙述的操作步骤将淀粉酶基因片段克隆到pGALHis5S载体上。 将pGALHis5S中含有植酸酶基因的构建DNA分子命名为pGALHisAmy，用AvrII对含有淀粉酶基因的重组质粒进行线性化酶切，然后用于转化麦芽糖假丝酵母细胞(组氨酸营养缺陷型)。实施例11、制备麦芽糖假丝酵母电转感受态细胞从YEPD培养基平板上挑取单克隆(组氨酸营养缺陷型)，接种到50ml (250ml三角瓶)液体YPD培养基中，28-30°C震荡(250rpm)培养过夜。培养过程中，用分光光度计测定培养液在600nm处的OD值，直至0D600 = 0.6-0.8。1600 X g室温离心5分钟，收集细胞。 将细胞重新悬浮于新配置的50mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5，并含有25mM二硫苏糖醇)中，置于30°C下孵育15分钟。1600Xg，4°C离心5分钟，收集细胞，然后用已预冰冷的STM缓冲液 (250mM蔗糖，IOmM Tris-HCl (pH7. 6)，ImM MgCl2)洗涤细胞3次。第3次洗涤完后，聚集细胞，并将细胞重新悬浮于Iml STM缓冲液中，用作转化。实施例12、麦芽糖假丝酵母的电转化按照BioRad实验室(Hercules，Calif.)所提供的操作流程进行电转化。对于每一个转化，将IOOul电转感受态酵母细胞(组氨酸营养缺陷型)与2ugDNA 混合，然后加入到0. 2cm电转化杯中。冰浴5分钟后，设定条件750V和25uF，进行电转化。 立即向电转化杯中加入Iml YEPD培养基(室温)，然后转移到培养管中。在30°C下培养细胞1小时后，1600Xg室温离心5分钟，聚集菌体。将细胞重新悬浮于0. 2ml MD培养基中， 然后涂布接种于2个MD培养基平板上。28-30°C下培养平板2_3天，直至克隆菌落出现。MD 培养基(minimal dextrose medium) 1. 34% (w/v)酵母氮源，4Χ1(Γ5% (w/v) 生物素，2% (w/v)葡萄糖，余量为蒸馏水。实施例13、用于小规模表达的操作流程从转化平板上挑取单克隆酵母菌落(组氨酸营养缺陷型)，接种到Iml YEPD培养基中，28-30°C震荡培养16小时。次日，将培养管IOOOOrpm离心5分钟，弃去上清液，再向每个培养管中分别加入0. 5ml新配制的MG培养基，28-30°C下剧烈震荡(至少250rpm)培养3-5天。用SDS-PAGE分析细胞碎片和培养液中的基因表达水平。MG培养基(minimal galactose medium) :1· 34(w/v)酵母氮源，4X l(T5(w/v)生物素，0.5 (w/v)半乳糖，余量为蒸馏水。选择在摇瓶培养基中表现出半乳糖诱导表达外源蛋白质最高水平的菌落，在高细胞密度发酵条件下，对其进行进一步的分析。先将细胞于0.5L YEPD液体培养基中， 30°C下剧烈搅拌培养1-2天，然后接种到5L发酵罐中(e. g.，BioFlowIII ；New Brunswick Scientific Co.，Inc.，Edison, N. J.)。先向发酵容器中加入矿物盐(57. 8g(NH4)2S04、68g KH2PO4,30. 8g MgSO4 · 7Η20、8· 6g CaSO4 · 2Η20、2· Og NaCl)和 IOml 消泡剂(PPG)，再用水补充至总体积为2. 5L，搅拌使矿物盐完全溶解后，将溶液121°C灭菌40分钟(在发酵容器中进行灭菌)。待其冷却后，在无菌条件下，向发酵罐中加入350ml 50%葡萄糖、250ml IOX 微量元素、25ml200mu. g/ml生物素(均已单独灭菌)，搅拌混合均勻后，接种250ml细胞培养液。IOX 微量元素IOOmM(27. 8g/L)FeSO4 · 7H20、2mM(0. 5g/L) CuSO4 · 5H20、 8mM(l. 09g/L)ZnCl2、8mM(l. 35g/L)MnSO4 · H20、2mM(0. 48g/L) CoCl2 · 6H20、lmM(0. 24g/L) Na2MoO4 · 2H20、8mM(0. 5g/L) H3B03、0. 5mM(0. 08g/L)KI、5mg/L 生物素、0. 5g/L 硫胺素(维生素 Bl)、l-2ml/L H2S04。设定在28°C，pH5.0*> 30%溶解氧条件下运行发酵罐进行发酵。细胞将消耗初始添加的葡萄糖，在葡萄糖消耗过程中，对氧的需求急剧增加，随后，当葡萄糖消耗完后， 耗氧量降低。初始添加的葡萄糖耗尽后，向发酵罐中流加补充有NH4+和微量元素的葡萄糖-半乳糖料液，先维持发酵液中0.2% (w/v)葡萄糖和0.2% (w/v)的水平5小时，然后再维持0.1% (w/v)葡萄糖和0.4% (w/v)的水平25小时。通过发酵罐的一个口所补充的总的半乳糖量为550g，所使用的初始流加速度为12. 5ml/hr，最终流加速度为25ml/hr。通过发酵罐的另一个口补充700ml葡萄糖溶液，其含有175g葡萄糖、250ml IOX微量元素和
1599g(NH4)2S04。在这些条件下，葡萄糖和半乳糖可同时被利用，并在葡萄糖-半乳糖饲喂时就开始诱导蛋白质表达。采用以上所叙述的用于分析摇瓶培养液的方法，分析发酵罐中细胞的基因表达水平。将实施例9和实施例10中构建得到的载体pGALHisPhy和pGALHisAmy，按照实施例11和实施例12中所述的方法，转化到麦芽糖假丝酵母中，得到分别含有植酸酶和淀粉酶的重组菌株Candida maltosa Phy和Candida maltosaAmy。然后按照实施例14中的方法， 对两个重组菌株进行培养、发酵，及重组酶的诱导表达，并分别对发酵液进行SDS-PAGE分析和酶活力分析，评判两种重组酶在麦芽糖假丝酵母表达系统中的表达水平，结果如图14 和图15所示。从结果可以看出，重组植酸酶和α-淀粉酶均在麦芽糖假丝酵母系统中得到了表达，其分子量分别约为45kDa和55kDa，与其理论分子量44. 6kDa和54. 8kDa相近；半乳糖诱导表达96小时后，两种重组酶在发酵上清液中的酶活力分别为113. 6U/ml和58. 3U/ml, 进一步说明两种重组酶在麦芽糖假丝酵母(组氨酸营养缺陷型)中得到了表达和积累。菌种保藏本发明的组氨酸营养缺陷型麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)已经保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCCNo. 4499，保藏日为 2010年12月21日。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种蛋白表达系统，其包括(1)麦芽糖假丝酵母，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；(2)表达构建体，所述表达构建体从5’一 3’依次包括以下可操作性相连的元件 GALl启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin。
2.如权利要求1所述的蛋白表达系统，其特征在于，所述的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，包括至少一个多克隆位点，用于外源蛋白的编码基因的插入。
3.如权利要求2所述的蛋白表达系统，其特征在于，所述的外源蛋白的编码基因包括 植酸酶基因，淀粉酶基因。
4.如权利要求1-3任一所述的蛋白表达系统，其特征在于， 所述的Origin的DNA序列如SEQ ID NO 5所示；或所述的GALl启动子的DNA序列如SEQ ID NO 2所示；或所述的α-结合因子分泌引导序列如SEQ ID NO :3所示；或所述的终止子的DNA序列如SEQ ID NO 4所示；或所述的麦芽糖假丝酵母His5基因的DNA序列如SEQ ID NO=I所示；或所述的植酸酶基因的DNA序列SEQ ID NO 8所示；或所述的淀粉酶基因的DNA序列SEQ ID NO 9所示。
5.如权利要求1-3任一所述的蛋白表达系统，其特征在于，所述的麦芽糖假丝酵母在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。
6.权利要求1所述的蛋白表达系统的用途，用于表达外源蛋白。
7.—种表达外源蛋白的方法，其包括(a)提供权利要求1所述的蛋白表达系统；(b)将外源蛋白的编码基因的DNA序列插入到所述表达构建体的α-结合因子分泌引导序列和终止子之间，获得携带外源蛋白的编码基因的表达构建体；(c)将所述的携带外源蛋白的编码基因的表达构建体转入到所述麦芽糖假丝酵母中， 从而获得基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母；(d)培养所述的基因组中整合有该表达构建体的麦芽糖假丝酵母，从而表达所述的外源蛋白。
8.—种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
9.一种人工构建的核酸分子，所述的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示。
10.一种宿主细胞，其是组氨酸营养缺陷型的酵母；且其中还包含表达构建体，所述表达构建体从5’ 一 3’依次包括以下可操作性相连的元件GAL1启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子，麦芽糖假丝酵母His5基因，Origin。
11.一种组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号是CGMCC No. 4499。
全文摘要
本发明涉及一种整合型麦芽糖假丝酵母基因表达系统及其应用。所述系统包括组氨酸营养缺陷型的麦芽糖假丝酵母以及表达构建体，所述表达构建体包括元件Origin，GAL1启动子，α-结合因子分泌引导序列，终止子和麦芽糖假丝酵母His5基因。经验证该表达系统可用于多种蛋白的表达，表达效率和表达量良好。
文档编号C12N15/56GK102212546SQ20111004796
公开日2011年10月12日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者傅仙玉, 叶秀云, 应喜娟, 张洋, 罗鋆琳, 陈萍, 靳伟刚 申请人:福建福大百特科技发展有限公司