专利名称：检测土拉弗朗西斯菌的试剂及复合探针荧光定量pcr检测土拉弗朗西斯菌的方法
技术领域：
本发明涉及检测土拉弗朗西斯菌的试剂及土拉弗朗西斯菌的检测方法，尤其涉及复合探针土拉弗朗西斯菌标识基因进行扩增，进而利用复合探针荧光PCR技术检测土拉弗朗西斯菌的方法。
背景技术：
土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)是一种革兰氏阴性球杆菌，能引起人畜共患的土拉菌病(Tularemia)，是最具传染性的致病菌之一，在自然界中已发现一百种以上的动物感染此菌。因其传播途径多样，易扩散、毒性强而被美国疾病控制预防中心列入A 类生物恐怖制剂。土拉菌病致死率非常高，毒力最强的A型土拉热亚种在缺乏有效治疗的情况下，感染10个细菌就可致命。因此及时、准确的检测土拉菌对于土拉菌病患者及时治疗和防止扩散具有重要的意义。土拉弗朗西斯菌生长缓慢，可通过气溶胶传播，细菌培养诊断难度较大，通常采用免疫学或者分子生物学方法，如微凝集实验、酶联免疫吸附、快速检测试纸条、生物传感器、PCR、核酸杂交检测、质谱分析、基因芯片等。但到目前为止还没有一种成熟的用于土拉菌检测方法，其主要原因在于土拉菌致病性强，且不易分离培养。传统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的推动了细菌检测技术的发展，但存在容易交叉污染、无法定量分析等缺陷。实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR技术的不足， 已经成为细菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技术可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高效、快速、特异的优点，非常适用于单一病原体的检测。Taqman探针、分子信标、杂交探针(Lightcycler)等用广泛应用于传染病病原体监测、食品安全、卫生检疫等领域中。发展快速、敏感、特异、系统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物分离和检测方法，可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传染病的口岸传入，并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速应急反应和处理能力。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对当前常规土拉弗朗西斯菌检测方法还不完善，提供一种检测土拉弗朗西斯菌的试剂，可以用于快速准确地检测土拉弗朗西斯菌。为此，本发明采用以下技术方案它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列FTFl为5' -aagcaagtgttgactacagat-3‘，其基因序列如序列表SEQ =NO 1所示；下游引物的基因序列FTRl为5' -caccaaagaaccatgttaaac-3‘，其基因序列如序列表SEQ =NO 2所示；荧光探针的基因序列 FPFTl 为5' -FAM_aatcatgttagtacccgctctgcca-P_3 ‘，其基因序列如序列表SEQ :N03所示；
淬灭探针的基因序列QPFTl 为5' -agcgggtactaacatgat-Dabcyl-3‘，其基因序列如序列表SEQ NO 4所示。本发明另一个目的是提供一种复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法，可以快速准确地检测土拉弗朗西斯菌。为此，本发明采用以下技术方案它采用直接水煮法提取土拉弗朗西斯菌基因DNA 取50 μ 1的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，IOOOOXg离心2分钟，取2 μ 1上清作为扩增PCR模板；所述方法的PCR 反应体系为 25 μ 1 :10mmol/L 的 Tris-HCl, pH 为 8. 0 ；50mmol/L 的 KCl ；体积百分比 3% 甲酰胺；6mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ； 0. 5ymol/L的上述上游引物，0. 5ymol/L的上述下游引物，1. 5U Taq酶，100nmol/L的上述荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为预变性95°C 3min、95°C 5s、扩增的退火温度为30s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤将扩增模板按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用非土拉弗朗西斯菌，阳性对照采用土拉弗朗西斯菌标准株；反应结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中土拉弗朗西斯菌的浓度。本发明相对于传统的土拉弗朗西斯菌检测技术，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。选取 ^ορΑ基因为目的基因，编码土拉弗朗西斯菌外膜蛋白，该基因在弗朗西斯菌属中高度保守，可作为土拉弗朗西斯菌的核酸诊断标志，与整个genbank数据库进行BLAST 检索，发现其只对土拉弗朗西斯菌上的 ^ορΑ基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法大大缩短了土拉弗朗西斯菌的检测时间，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，对土拉的早期诊断具有重要意义。
图Ia为实施例1中组合1的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 CMCC52502的实时扩增曲线，2为CMCC52503的实时扩增曲线，3为CMCC52504的实时扩增曲线。图Ib为实施例1中组合2的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 CMCC52502的实时扩增曲线，2为CMCC52503的实时扩增曲线，3为CMCC52504的实时扩增曲线。图2实施例2中质粒参考品的灵敏度分析实时扩增图，其中，1为IX IO6个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，2为IX IO5个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，3为IX IO4个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，4为IX IO3个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，5为IXlO2个拷贝/ μ 1的实时扩增曲线，6为IXlO1个拷贝/μ 1的实时扩增曲线，7为1X10°个拷贝/μ 1的实时扩增曲线。图3为本发明实施例2绘制的荧光定量PCR标准曲线。
具体实施例方式实施例1引物与探针的制备
1靶基因选择R)PA基因编码土拉弗朗西斯菌的外膜蛋白，人在恢复期血清中仍然存在抗fopA 抗体，该基因在弗朗西斯菌属中高度保守，可作为土拉弗朗西斯菌的核酸诊断标志。根据 genbank数据库检索获得该基因序列。2PCR引物的设计和筛选遵循复合探针设计原则，根据R)PA基因序列，设计了两组引物和探针。荧光探针5'端标记荧光分子FAM作为报告基团，3'端标记磷酸，以阻断其延伸。 淬灭探针的3'端连接一淬灭基团Dabcyl。为了从两组复合探针及引物组合中筛选出扩增效率高的一个组合，将这些组合进行实时PCR分析，采用土拉弗朗西斯菌CMCC52502，CMCC52503，CMCC52504为检测样本，研究它们扩增同一样品的效率来确定最佳组合。结果如表1和图la、图Ib所示，采用组合1进行检测时，其检测样品时的CT值较小，而且荧光响应强度值△ RFU较高，说明该组合扩增效率较高，组合2荧光响应强度值 Δ RFU低，说明该组合扩增效率也比较低，因此，在后述的所有实验中，均采用组合1。表1引物及探针组合对扩增效率的影响
权利要求
1.检测土拉弗朗西斯菌的试剂，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列 FTFl 为5' -aagcaagtgttgactacagat-3‘；下游引物的基因序列 FTRl 为5' -caccaaagaaccatgttaaac-3‘；荧光探针的基因序列 FPFTl 为5' -FAM-aatcatgttagtacccgctctgcca-P-3'；淬灭探针的基因序列 QPFTl 为5' -agcgggtactaacatgat-Dabcyl-3‘。
2.一种复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法，其特征在于它采用直接水煮法提取土拉弗朗西斯菌基因组DNA 取50 μ 1细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟， IOOOOXg离心2分钟，取2 μ 1上清作为扩增模板；所述方法的 PCR 反应体系为 25 μ 1 :10mmol/L 的 Tris-HCl，ρΗ 为 8.0 ；50mmol/L 的 KCl ； 体积百分比 3% 甲酰胺；6mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；0. 5 μ mol/ L的权利要求1所述的上游引物，0. 5 μ mol/L的权利要求1所述的下游引物，1. 5U Taq酶， 100nmol/L的权利要求1所述的荧光探针，200nmol/L的权利要求1所述的淬灭探针；PCR反应程序为预变性95°C 3min、95°C 5s、扩增的退火温度为30s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤将扩增模板按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用非土拉弗朗西斯菌，阳性对照采用土拉弗朗西斯菌标准株；反应结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中土拉弗朗西斯菌的浓度。
3.如权利要求2所述的一种荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法，其特征在于 荧光定量PCR标准曲线采用以下步骤制得将克隆有目的基因片段的质粒作为标准品DNA扩增模板，取不同DNA载量的质粒标准品各2 μ 1，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增； 反应结束后根据得到的各个浓度的循环阈值C (t)，采用计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。
全文摘要
本发明提供了一种检测土拉弗朗西斯菌的试剂，它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列FTF1为5′-aagcaagtgttgactacagat-3′；下游引物的基因序列FTR1为5′-caccaaagaaccatgttaaac-3′；荧光探针的基因序列FPFT1为5′-FAM-aatcatgttagtacccgctctgcca-P-3′；淬灭探针的基因序列QPFT1为5′-agcgggtactaacatgat-Dabcyl-3′。本发明还提供一种利用上述试剂的复合探针荧光定量PCR检测土拉弗朗西斯菌的方法。本发明相对于传统的土拉弗朗西斯菌检测技术，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。
文档编号C12Q1/68GK102154487SQ20111004800
公开日2011年8月17日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者吕沁风, 吴忠华, 李 禾, 杨永耀, 郑伟 申请人:浙江国际旅行卫生保健中心