专利名称：结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的快速检测方法。可用于临床结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的快速检测。
背景技术：
结核病是对人类威胁最大的传染病之一，尽管牛型结核分枝杆菌疫苗(BCG)和各种抗结核药物在全球范围内得到了广泛应用，但近年来，随着人口流动及人口密度的增高， 结核杆菌多重耐药菌株及同人体免疫缺陷病毒(HIV)双重感染的出现，结核病已在发达国家和发展中国家呈再度肆虐态势。据报道，2005年全球大约有880万新发结核病人，每年约有160万人死于结核病。由于结核病的历史悠久，结核病的耐药状况十分严重，多重耐药和超级耐药株的出现，已成为结核病治疗中的一个难题。结核杆菌的耐药性检测，对于指导临床正确用药和有效控制结核病具有非常重要的作用。由于结核分枝杆菌的生长十分缓慢， 传统的药敏试验需要长达1 2个月时间，不能及时指导临床用药，可能使感染耐药结核的病人在该期间得不到正确的治疗。因此，快速，灵敏，特异检测结核杆菌耐药性的方法对结核病的早期诊断、有效化疗和控制传播都有极其重要的意义。在目前使用的用于治疗结核病的临床药物中，吡嗪酰胺是一线抗结核药物之一。 目前临床上检测吡嗪酰胺的耐药性方法主要可以分为表型检测(细菌培养)和基因检测两类，并以前者为主。由于结核菌生长缓慢，不仅需要长达1 2个月时间，而且对吡嗪酰胺的耐药性检测需要在酸性培养基中进行，对培养基的PH值控制要求高，往往导致即使是同一实验室不同时间测定的结果也不一致。而基因检测的方法主要是测定与吡嗪酰胺耐药性产生密切相关的吡嗪酰胺酶基因(/7/7^)的位点突变。已报道的方法有基因芯片、基因测序列等方法。所有基因检测方法只能根据已经报道的与耐药性产生有相关性的突变位点来判断是否耐药。但是由于/^d基因的很多位点突变，都会导致吡嗪酰胺耐药性的产生，而且新的突变位点也在不断报道，因此，各种基因检测的结果容易产生假阴性，只能作为参考， 还需要传统药敏实验进行验证。一系列的研究表明，吡嗪酰胺耐药性产生与结核基因表达的吡嗪酰胺酶的活性丧失有90%以上的相关性，因此也有人报道通过直接测定结核分枝杆菌的吡嗪酰胺酶活性来测定结核杆菌的吡嗪酰胺耐药性。但由于结核杆菌中吡嗪酰胺酶的含量少，该方法同样需要对结核杆菌进行培养放大后才能进行，需要的时间与传统的药敏时间差不多。基于以上的原因，目前国际上还没有标准的测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。体外蛋白质无细胞表达系统是一种以外源DNA为模板，利用细胞抽提物中的蛋白合成机器、蛋白折叠因子及其他相关酶系，通过添加氨基酸、T7聚合酶和能量物质等来实现蛋白质体外快速表达的系统。经常使用的有兔网织红血球(rabbit reticulocyte)、小麦胚芽(wheat germ)、大肠杆菌0 Coli)的细胞裂解液。使用兔网织红血球表达系统，日本科学家于2001年报道过一种测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性的方法。由于兔网织红血球表达系统中，溶液为深红色，与吡嗪酰胺酶活性测定的反应产物颜色接近，需要对溶液进行脱色处理，增加了检测时间和成本，脱色不完全也会带来新的误差。该报道中，也采用了小麦胚芽表达系统，但效果不明显，检测灵敏度度比兔网织红血球差很多倍。此外，该报道中采用的PCR引物，由于部分与基因序列重合，PCR引物覆盖了部分的/Md基因突变位点，导致需要采用至少两对引物，才能对一个结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性进行完全检测，增加了检测的复杂性和成本。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂的快速检测方法(PCR引物设计方法和引物序列)，本发明能快速(24小时)，灵敏，特异检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，具有操作简便，成本低，无需细菌培养等特点。其主要技术特征在于使用一对引物就能测定结核分枝杆菌因 PncA基因突变导致的耐药性。一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其步骤是
A、裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；裂解结核分枝杆菌的方法包括加热煮沸法、超声破碎法、压力法等，主要目的在于将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组.
B、设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶基因；其特征之一在于PCR引物序列根据结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列来设计，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，能完整反应全长/^d基因。其特征之二在于PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子。C、浓缩扩增的/Md基因片段并定量；浓缩方法包括乙醇沉淀法、吸附提取法等；定量方法包括紫外吸收法、荧光定量法等。主要目的在于控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量。D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶；表达时间可以根据需要调节， 一般I-M小时。F、测定表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。 测定吡嗪酰胺酶活性的方法一般采用硫酸亚铁胺法，通过吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质显色。也可以采用其它如分光光度计、高效液相色谱法等来测定吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性。所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和/或3’端非编码区增强子。本发明所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子的引物对序列。引物对Pl 上游引物序列5’ -T AATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3，(SEQ NO. 1)，下游引物序列5，-GCCGCC AACAGTTCATCCCGGT-3’ (SEQ NO. 2)。所述的即能从结核杆菌基因组上扩增全长基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列引物对P2 列举三套包含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列5’-TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATT ACTATTTACAATTACACCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 3)；或
5’-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACT CCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 4)；或
5’-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAG ATCTTTTTATAATCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，(SEQ NO. 5)； 下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，(SEQ NO. 6)。通过采用本发明提供的以上方法和PCR引物，就可以在M小时内实现对结核杆菌吡嗪酰胺耐药性检测。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果
与传统的表型检测相比，本发明耗时短，仅一天就可以得出检测结果；与基因检测相比，本发明可同时检测多位点突变或者潜在的耐药位点突变，步骤简单，成本低，不会出现假阴性结果，具有很高的灵敏度和特异性。与现有报道的无细胞表达方法比较，本发明具有以下优点1.只使用一对引物就可对结核杆菌吡嗪酰胺酶全基因检测。本发明在设计 PCR扩增结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物时，选择了在吡嗪酰胺酶基因上下游的结核杆菌基因组上的临近序列。这样，引物序列不会与吡嗪酰胺酶基因序列重复，扩增产物能够包括全长的吡嗪酰胺酶基因，对吡嗪酰胺酶基因中任何位点的突变都能进行检测。如图2所示。2. 操作简单，无需构建质粒载体。由于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统一般需要将要表达蛋白的基因构建到一个质粒载体上，如:pIVEX1.3 WG和pIVEX1.4 WG.该步骤比较复杂， 不适合快速检测。本发明通过在吡嗪酰胺酶基因PCR引物上加上启动子，如T7启动子，使得小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统能对PCR扩增的蛋白基因进行表达，不需要构建到质粒载体上。如图3所示。3.本发明可以进一步在启动子，如T7启动子后，引入合适的提高蛋白合成效率的序列，例如5’非编码区的增强子。也可以在下游引物序列中引入提高蛋白合成效率的序列，如3’非编码区的增强子，来达到在短时间内，更多表达蛋白的目的，从而缩短蛋白表达时间，实现快速检测。如图4 (A) (B) (C)所示。
图1为一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法示意2为一种吡嗪酰胺酶基因上下游序列与PCR引物设计示意图
图3为一种PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子示意4为PCR引物含适合小麦胚芽无细胞表达系统启动子和增强子示意图。A、含有启动子和5’非编码区增强子的引物示意图。B、含有启动子和3’非编码区增强子的引物示意图。C同时含有启动子，5’非编码区增强子和3’非编码区增强子的引物示意图。图5为采用只带启动子的PCR引物扩增结核基因组上吡嗪酰胺酶基因的基因扩增电泳图(A)和小麦胚芽无细胞体外表达系统表达后检测效果图(B)。上游引物序列5，-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3，，下游引物序列 5’ -GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3'。吡嗪酰胺酶活性检测采用硫酸亚铁胺显色法。图6为采用带启动子和5’非编码区增强子的PCR引物扩增结核基因组上吡嗪酰胺酶基因的基因扩增电泳图(A)和小麦胚芽无细胞体外表达系统表达后检测效果图(B)。上游引物序列5，-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATA CTCCCCCACACAGCTTACAAATACTCCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，，下游引物序列 5’ -GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3’。吡嗪酰胺酶活性检测采用硫酸亚铁胺显色法。
具体实施例方式
一种基于小麦胚芽无细胞体外蛋白表达系统用于结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性试剂的快速检测方法，下面结合图1对本发明作进一步详细描述。实施例1
采用含T7启动子PCR扩增全长结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物-小麦胚芽无细胞体外蛋白表达测定结核吡嗪酰胺敏感株(H37RA)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)的吡嗪酰胺耐药性。1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于PCR反应的模板
取结核菌液1ml，4000rpm,离心lmin，去除上清，收集菌体后，加入IOOul双蒸水煮沸lOmin，然后5000rpm，离心5min，小心吸取上清作为扩增吡嗪酰胺酶基因(/^dJ的模板。2. PCR扩增基因的引物设计。上游引物序列Pl :5’-TAATACGACTCACTATAGG CCCGCCCGAACGTAAGGAGGAC-3，，下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，。PCR扩增条件
采用 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (购自美国 NEB 公司)作为 PCR 反应中的DNA聚合酶。98°C预变性30s，变性98°C 10s，退火60°C Imin延伸72°C 30s共；35个循环。采用以上引物对结核吡嗪酰胺敏感株(H37Rv)(购自美国菌种保藏中心， ATCC25177)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)(购自美国菌种保藏中心，ATCC19015)的吡嗪酰胺酶基因的扩增，经凝胶电泳，典型结果如图5A，可见得到了很好的扩增。3.浓缩扩增的卯M基因片段
(1)制备一定浓度的DNA溶液；
(2)加入1/10体积的3M CH3COONa (pH=5. 2)溶液，均勻混合;
(3)加入4μ 1的DNAmate溶液，均勻混合；
(4)加入2.5倍体积的-20°C预冷无水乙醇，充分混勻；
(5)12,000 rpm 4°C离心 15 分钟；
(6)弃溶液，留白色沉淀；
(7)加入-20°C预冷的70%(V/V，以下相同)乙醇1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。(8) 12,000 rpm 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇。(9)再加入_20°C预冷的70%(V/V)乙醇1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀。(10) 12,000 rpm 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥。4.采用BioiTek公司Take3 Multi-Volume Plate精确定量浓缩的基因片段浓度。适合的基因片段浓度一般为0. 1- 100微克/ml。5.采用美国5 PRIMER公司生产的RTS 100 Wheat Germ CECF Kit试剂盒体外无细胞反应1 - 20小时。表达目的蛋白吡嗪酰胺酶。6.酶活的测定
体外表达完成后，取体系中的20ul加入IOOul 10mg/ml浓度的吡嗪酰胺(PZA)(购自Sigma公司)，37°C孵育1小时。然后加入IOul浓度为10% (W/V)硫酸亚铁按，立即显色。 由于吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质，从而作为检测的指标。对结核吡嗪酰胺敏感株(H37Ra)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)的吡嗪酰胺酶活性检测结果如图5B所示，可见H37RA的酶活性高，产生肉眼明确可见的红棕色，而耐药的BCG的吡嗪酰胺酶活性几乎没有，活性低。更精确的定量可以采用分光光度计在450nm测定酶反应后溶液的吸收值。实施例2:
采用含T7启动子和增强子PCR扩增全长结核杆菌吡嗪酰胺酶基因引物-小麦胚芽无细胞体外蛋白表达测定结核吡嗪酰胺敏感株(H37RA)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)的吡嗪酰胺耐药性。1.煮沸裂解结核分枝杆菌快速制备用于PCR反应的模板
取菌液1ml，4000rpm,离心lmin，去除上清，收集菌体后，加入IOOul双蒸水煮沸lOmin，然后5000rpm，离心5min，小心吸取上清作为扩增吡嗪酰胺酶基因(/^dJ 的模板。2. PCR扩增得到基因的片段。上游引物序列P2 :5’-TAATACGACTCACTATAGG TATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATTACTATTTACAATTACACCCGAACGTA AGGAGGACGT-3，或
5’-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACT CCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3’ ； 或者采用
5’-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAG ATCTTTTTATAATCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3’， 下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，。PCR扩增条件
采用 Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (购自美国 NEB 公司)作为 PCR 反应中的DNA聚合酶。98°C预变性30s，变性98°C 10s,退火60°C Imin延伸72°C 30s共；35 个循环。采用以上引物对结核吡嗪酰胺敏感株(H37Ra)(购自美国菌种保藏中心， ATCC25177)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)(购自美国菌种保藏中心，ATCC19015)的吡嗪酰胺酶基因的扩增，经凝胶电泳，典型结果如图6A，可见得到了很好的扩增。3.浓缩扩增的卯M基因片段
(1)制备一定浓度的DNA溶液；
(2)加入1/10体积的3M CH3COONa (pH=5. 2)溶液，均勻混合;
(3)加入4μ 1的DNAmate溶液，均勻混合；
(4)加入2.5倍体积的-20°C预冷无水乙醇，充分混勻；
(5)12,000 rpm 4°C离心 15 分钟；
(6)弃溶液，留白色沉淀；
(7)加入-20°C预冷的70%(V/V)乙醇1 ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；(8)12,000 rpm 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇;
(9)再加入-20°C预冷的70%(V/V)乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；
(10)12,000 rpm 4°C离心5分钟后小心弃去乙醇，真空干燥；
4.采用BioiTek公司Take3 Multi-Volume Plate精确定量浓缩的基因片段浓度。适合的基因片段浓度一般为0. 1- 100微克/ml。5.采用5 PRIMER公司生产的RTS 100 Wheat Germ CECF Kit试剂盒体外无细胞反应1 - 20小时。表达目的蛋白吡嗪酰胺酶。6.酶活的测定
体外表达完成后，取体系中的20ul加入IOOul 10mg/ml浓度的吡嗪酰胺(PZA)(购自 Sigma公司)，37°C孵育1小时。然后加入IOul浓度为10% (W/V)硫酸亚铁按，立即显色。 由于吡嗪酰胺降解为吡嗪酸后，吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质，从而作为检测的指标对结核吡嗪酰胺敏感株(H37Rv)和吡嗪酰胺耐药株(BCG)的吡嗪酰胺酶活性检测。 结果如图6B所示，可见H37RA的酶活性高，产生肉眼明确可见的红棕色，而耐药的BCG的吡嗪酰胺酶活性几乎没有，活性低。与采用没有增强子引物序列进行扩增的实施例一比较， H37RA溶液的颜色更深，这显然是由于表达产生了更多的吡嗪酰胺酶。同样的，更精确的定量可以采用分光光度计在450nm测定酶反应后溶液的吸收值。
权利要求
1.一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其步骤是A、裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；裂解结核分枝杆菌的方法包括加热煮沸法、超声破碎法、压力法，将结核分枝杆菌的菌壁破碎，释放结核分枝杆菌基因组；B、设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶基因；在于PCR引物序列根据结核杆菌基因组中全长吡嗪酰胺酶基因的上下游序列来设计，引物序列不与吡嗪酰胺酶基因序列重叠，完整反应全长基因，在于PCR引物序列上同时带有适合小麦胚芽无细胞表达系统的启动子，或者同时带有启动子和增强表达子；C、浓缩扩增的_乂基因片段并定量；浓缩方法包括乙醇沉淀法、吸附提取法；定量方法包括紫外吸收法、荧光定量法，在于控制用于表达吡嗪酰胺酶的基因模板量；D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶；表达时间调节I-M小时；F、测定表达的吡嗪酰胺酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核分枝杆菌标准敏感株和耐药株的吡嗪酰胺酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，测定吡嗪酰胺酶活性的方法采用硫酸亚铁胺法，通过吡嗪酸能与亚铁离子反应生成棕红色物质显色，采用高效液相色谱法来测定。
2.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其特征在于所述的小麦胚芽无细胞表达系统的启动子为T7启动子，增强表达子为5’端非编码区增强子和 /或3’端非编码区增强子。
3.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其特征在于所述的结核杆菌基因组上扩增全长基因适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子的引物对序列上游引物序列5，-TAATACGACTCACTATAGGCCCGCCCGAACGTAAGGAG GAC-3，，下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，。
4.权利要求1所述的一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，其特征在于所述的结核杆菌基因组上扩增全长基因适合小麦胚芽无细胞表达系统增强表达吡嗪酰胺酶的含T7启动子和5’端非编码区增强子的引物对序列列举三套含不同5’端非编码区增强子的上游引物序列5’-TAATACGACTCACTATAGGTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAAACAACAAACAACATTACAATT ACTATTTACAATTACACCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，；或5’-TAATACGACTCACTATAGGATACTCCCCCACAACAGCTTACAATACTCCCCCACACAGCTTACAAATACT CCCCCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3，；或5’-TAATACGACTCACTATAGGGATTGTGAGCGATTTGCGTGCGTGCATCCCGCTTCACTGATCTCTTGTTAG ATCTTTTTATAATCAGTCGCCCGAACGTAAGGAGGACGT-3’ ；下游引物序列5，-GCCGCCAACAGTTCATCCCGGT-3，。
全文摘要
本发明公开了一种结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性检测方法，步骤是A、裂解结核分枝杆菌用于PCR反应的模板；B、设计PCR引物，扩增全长的吡嗪酰胺酶(pncA)基因；C、浓缩扩增的pncA基因片段并定量；D、采用小麦胚芽无细胞表达系统表达pncA酶；F、测定表达的pncA酶转化吡嗪酰胺为吡嗪酸的活性，并与同样表达的结核杆菌标准敏感株和耐药株的pncA酶活性比较，测定结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性。其特征在于使用一对引物就能测定因pncA基因突变导致的耐药性；同时公开了即能从结核杆菌基因组上扩增全长pncA基因又适合小麦胚芽无细胞表达系统表达吡嗪酰胺酶的引物序列。本发明能快速、灵敏检测结核分枝杆菌吡嗪酰胺耐药性，无需细菌培养。
文档编号C12Q1/34GK102174652SQ20111004779
公开日2011年9月7日 申请日期2011年2月28日 优先权日2011年2月28日
发明者危宏平, 周满, 张先恩, 张治平, 王殿冰 申请人:中国科学院武汉病毒研究所