专利名称：人纤溶酶原功能性突变体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术制药领域，具体涉及人纤溶酶原的功能性突变体及其制备方法和应用。
背景技术：
栓塞是导致心脑血管疾病死亡的重要原因之一，溶栓治疗是一种有效的手段。 目前临床使用的主要溶栓药物，如组织纤溶酶原激活剂(Tissue-type ρ 1 asminogen activator, t_PA)、尿激酶(Urokinase-type plasminogen activator, UK)、链激酶 (Streptokinase, SK)等，尽管表现出一定的治疗效果，但由于需激活血液内的纤溶酶原 (PLG)为纤溶酶(PLM)后方能发挥溶栓作用，因此对陈旧性血栓的效率较低，导致治疗时间窗短、出血并发症较高等缺点。且由于无抗栓功能，易出现溶栓后再栓的情况。PLM是血液内直接发挥纤溶及栓溶作用的蛋白酶。体内实验表明与目前临床使用的溶栓剂相比，PLM 具有可直接溶栓、出血并发症低等特点。PLM还可有效地治疗黄斑变性、木质结膜粘连等多种疾病，以及用于动静脉插管设备的清洗。此外，PLM还参与一系列与蛋白水解相关的生理、 病理过程，如组织重构、排卵、炎症、肿瘤细胞侵袭和转移等。因此，PLM具备广阔的药用前景和研究价值。然而一直以来，PLM的应用均采用混合人血浆提取，受到血浆来源的限制，难以大规模生产，且存在病毒污染的风险。基因工程的发展为大规模生产提供可能。人PLG是由 791个氨基酸残基组成的糖蛋白，包含N端多肽(NTP)、五个同源的Kringle区(K1-K5)、 丝氨酸蛋白酶区(SP) 7个结构域。PLG经纤溶酶原激活剂(PA)特异性水解激活环上的 Arg561-Val562肽键后，转变为活性PLM。然而，近年来通过大肠杆菌、哺乳动物细胞表达均未获得高水平的活性蛋白。一些学者通过构建包含SP结构域和部分K区的小分子突变体，提高了表达水平，且保留了较好的纤溶活性，其中部分进入临床实验研究。尽管溶栓治疗可以有效地使血管再通，但仍然不能阻止溶栓后再栓。目前尚无兼具溶栓与抗凝、防栓作用的PLG突变体报道。Arg-Gly-Asp (RGD)序列可与纤维蛋白原竞争结合与血小板聚集相关的膜受体GPIIb/IIIa，阻断血栓形成的最后共同通路，其模拟物临床上常用于预防再栓塞。目前已构建了多种包含R⑶的融合蛋白，且显示出较好的抗栓作用。Arg-Pro-Gly (RPG)是纤维蛋白原α链N端附近的三个氨基酸残基，在凝血酶的作用下曝露出来成为末端三肽，参与纤维蛋白单体之间聚合，从而形成牢固的纤维蛋白栓子，而RPG三肽本身是一种纤维蛋白单体聚合抑制剂。近年来研究表明一些合成的类似 RPG多肽，如GPRP, GPR-sarcosine亦显示出抗纤维蛋白单体聚合活性，其中以GPRP活性最高。且修饰后的多肽可耐受蛋白酶水解，具有更好的稳定性。尽管目前已构建出多种包含SP结构域的PLM突变体，且显示较好的溶栓活性， 但尚无兼具溶栓与抗凝、防栓作用的PLM突变体报道。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中纤溶酶不能兼具溶栓、抗凝、防栓作用的缺点， 提供兼具纤溶与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的双功能重组蛋白，即人纤溶酶原功能性突变体。本发明的另一个目的是提供上述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法。本发明的又一目的是提供上述人纤溶酶原功能性突变体的应用。本发明通过以下技术方案实现上述目的
一种人纤溶酶原功能性突变体，为人纤溶酶原蛋白的ftx)544 - Asn791多肽，去除了 5个 Kringle区，保留了酶催化活性区，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，命名为hPLG-ΔΚ ；还包括在SEQ ID NO: 1限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纤溶酶原功能性突变体hPLG-ΔΚ的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。一种人纤溶酶原功能性突变体，是将hPLG-ΔΚ的Pro559突变为Asp559，其氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示，命名为RGD-hPLG-ΔK;还包括在SEQ ID NO:3限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如RGD-hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纤溶酶原功能性突变体RGD-hPLG-ΔΚ的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。一种人纤溶酶原功能性突变体，是将hPLG-ΔΚ的Gly56°突变为His56tl,其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示，命名为RHP- hPLG-ΔΚ ；还包括在SEQ ID N0:5限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有如RHP- hPLG-ΔΚ活性的蛋白。上述人纤溶酶原功能性突变体RHP- hPLG-ΔΚ的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:6所示。人纤溶酶原功能性突变体hPLG-ΔΚ的制备方法，包括以下步骤
以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID N0:7和下游引物 SEQ ID N0:8进行第一轮PCR;再以第一轮PCR产物为模板，设计上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR;第二轮PCR产物连接载体转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母进行表达，表达产物即为人纤溶酶原功能性突变体hPLG-ΔΚ。人纤溶酶原功能性突变体RGD-hPLG-ΔΚ的制备方法，包括以下步骤
以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物 SEQ ID N0:8进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR ;PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 10进行第三轮PCR ；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行第四轮PCR; 最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第五轮PCR ；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母GSl 15菌株进行表达，表达产物即为 RGD-hPLG-ΔΚ。人纤溶酶原功能性突变体RHP- hPLG-ΔΚ的制备方法，包括以下步骤
以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板，上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR ;PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 11进行第三轮PCR ；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行第四轮PCR;最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第五轮PCR ；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，所得产物以巴斯德毕赤酵母GSl 15菌株进行表达， 表达产物即为RHP- hPLG-ΔΚ。以上所述人纤溶酶原功能性突变体在制备预防或治疗炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默或黄斑水肿疾病的药物中的应用。其中，人纤溶酶原hPLG的核苷酸序列Genebank编号BC060513. 1。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果
本发明的突变体去除了人PLG的所有K区和部分SP区序列，其优势在于(1)进一步缩减了分子量，有利于重组蛋白质的复性，从而增加了利用大肠杆菌获得高水平表达的可能性；(2)由于PLG的两个糖基化位点均位于K区，去除K区后避免了在酵母菌中表达时的过糖基化问题；(3) K区是PLG与促炎症细胞上受体相结合的主要结构域，去除后可避免重组蛋白激活中性粒细胞、巨噬细胞、血小板、血管内皮细胞，从而降低溶栓时可能存在的促炎症副作用。(4) K区也是PLG与血浆中的抑制物Ci2-抗纤溶酶结合位点，因此去除K区可延长药物在血浆中的半衰期。本发明在获得重组人PLG突变体高水平表达的基础上，通过定点突变激活环上部分氨基酸序列，从而构建局部RGD、RPG及类似功能模序。激活环是由Cys558-Cys566 二硫键形成的环袢结构，晶体衍射数据表明该9肽的环袢结构曝露于分子表面，是PLG与 PA相互作用的主要界面，且位于PLM蛋白水解结构域外。在PA特异性水解激活环上的 Arg561-Val562肽键后，其下游游离出来的V562V563G564G565通过二硫键旋转进入到PLM的催化活性区，其中末端的Val542与Asp74tl形成氢键，引起结构改变，最终形成酶活性口袋。研究显示，激活环激活位点Arg561上游的突变对PLG的激活影响较小，且不参与活性中心的形成，因此可能是进行功能突变的较好位点。本发明从多个突变体中筛选出具有溶栓与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的重组人PLG。所构建的三个突变体cDNA序列经分泌型表达载体整合入巴斯德毕赤酵母染色体中，甲醇诱导后获得高水平表达，表达产物经Ni-NTA亲和层析后纯度达90%以上。将纯化后的蛋白hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ，经UK激活后，再经Ni-NTA亲和层析获得可稳定保存的hPLM-AK、RGD-hPLM-AK和RHP- hPLM-ΔΚ。体外活性测定显示尽管突变体RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ被UK激活的速率低于PLG、hPLG_AK，但24h时的激活比例无明显差别，且激活后产生的RGD-hPLM-ΔΚ和RHP-hPLM _ΔΚ纤溶活性与PLM及 hPLM-ΔΚ相近。所构建的RGD-hPLG-ΔΚ能显著地抑制ADP诱导的血小板聚集，尽管激活后RGD的环袢结构被破坏，抑制活性有所下降，但与hPLM-ΔΚ相比，其抑制活性仍然提高了约10倍，表明激活后RGD三肽依然位于分子表面，可与血小板充分作用；而构建的RHP-hPLG-ΔΚ使纤维蛋白单体聚合时间延长约1倍。总之，本研究成功构建了可替代人PLG而用于临床治疗的突变体hPLG-ΔΚ，在此基础上构建了 RGD-hPLG-ΔΚ和RHP- hPLG-ΔΚ，分别显示出抗血小板聚集和抗纤维蛋白单体聚合作用，并且详述了其制备过程和稳定保存方法。为进一步应用于炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默、黄斑水肿等疾病的预防、治疗及相关病理研究提供了基础。
图1 实施例1中hPLG-ΔΚ的cDNA序列构建电泳图，M为DNA marker, 1为第一轮 PCR产物，2为第二轮PCR产物。图2 实施例2中RGD-hPLG-ΔΚ的cDNA序列构建电泳图，M为DNA maker, 1为第一轮PCR产物，2为第二轮PCR产物，3为第三轮PCR产物。图3 实施例3中RHP-hPLG-ΔΚ的cDNA序列构建电泳图，M为DNA maker, 1为第一轮PCR产物，2为第二轮PCR产物。图4 :hPLG-AK核苷酸序列的测序图。图5 RGD-hPLG-ΔΚ核苷酸序列的测序图。图6 RHP-hPLG-ΔΚ核苷酸序列的测序图。图7 构建的pGME载体质粒经损a I和损ο I酶切鉴定电泳图，其中M为DNA marker, 1 为 pGEM-T-hPLG-ΔΚ，2 为 pGEM-T-RGD-hPLG-ΔΚ，3 为 pGEM-T-RHP-hPLG-ΔΚ，4 为 pPICZa A。图8:实施例1中hPLG-ΔΚ在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白 Marker，1 5分别为hPLG-ΔΚ工程菌甲醇诱导0，24，48，72，96h。图9 实施例2中RGD-hPLG-ΔΚ在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白 Marker，1 5 分别为 RGD-hPLG-ΔΚ 工程菌甲醇诱导 0，24，48，72，％h。图10 实施例3中RHP-hPLG-ΔΚ在巴斯德毕赤酵母中的表达检测电泳图，M为蛋白Marker，1 5分别为RHP-hPLG-ΔΚ工程菌甲醇诱导0，24，48，72，96h。图 11 :hPLG-AK ,RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的纯化、鉴定图，其中 A 为 Ni-NTA 亲合层析图，组分IV含目的蛋白；B是还原性SDS-PAGE分析纯化过程电泳图，M为蛋白 Marker，1为发酵液上清，2为组分I (上升峰)，3为组分I (下降峰)，4为组分II，5为组分 III，6 为组分 IV ；C 是 Wfeston bloting 鉴定电泳图，1 为 hPLG-ΔΚ, 2 % RGD-hPLG-ΔΚ, 3 % RHP-hPLG-ΔΚ。图 12 =UK 激活 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的动力学分析图。图13 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP-hPLG-ΔΚ的纤溶活性检测图，A是纤维蛋白板法测定纤溶活性图，1为0.02 mol/L PBS，2 6为5、2. 5、1. 25、0. 62、0. 32 U/mL牛血清 PLG，7 10 为 0. 1、0. 2、0. 4、0. 8 mg/mL hPLG-ΔΚ，11 13 为 0. 1、0. 2、0. 4 mg/mL RGD-hPLG-ΔΚ, 14 17 为 0. 1、0· 2、0· 4、0· 8 mg/mL RHP-hPLG-ΔΚ ；B 是纤溶活性对应于溶圈直径平方的标准曲线。图14 RGD-hPLG-ΔΚ抑制ADP诱导的血小板聚集活性* P=O. 0001, n=5。
具体实施例方式以下实施例中所用材料、试剂及仪器为
大肠杆菌T0P10由本实验室保存，pDNR-LIB-hPLG质粒购自南京恩晶生物科技有限公司，pPICZ α A质粒、巴斯德毕赤酵母GS115 Jeocin购自美国hvitrogen公司，牛血清PLG、PLM购自美国Sigma公司，pGM-T质粒购自上海Generay生物技术有限公司，损a I,Xho I、 Sac I、T4 DNA ligase、Premix Taq、DNA Marker、蛋白 Marker 购自大连宝生物工程有限公司，引物合成由上海生工生物工程公司提供，测序由深圳华大测序公司完成，质粒抽提、 DNA回收试剂盒购自天根生化科技有限公司，Ni-NTA亲和介质为北京瑞达恒辉公司产品； LBY-NJ血液凝聚仪购自北京普利生公司，冷冻干燥仪ZMD-MS为Waters公司产品。实施例1 hPLG-ΔΚ的制备
1. hPLG-ΔΚ基因的亚克隆以含人PLG全长cDNA序列的pDNR_LIB_hPLG质粒作为模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8进行第一轮PCR，其中上游引物SEQ ID NO: 7中引入6个组氨酸残基的编码序列标签，下游引物SEQ ID N0:8中加上损a I的酶切位点，反应条件94°C 5 min ； 94 °C 30 s,40°C 30 s，72°C 30 s，30 个循环；72°C 延伸 7 min，PCR产物1.0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定。再以该产物为模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR，其中引物SEQ ID N0:9中含损ο I 酶切位点和^fer 2酶识别位点的编码序列，PCR反应条件94°C 5 min ；94°C 30 s,40°C 30 s，72V 30 8，30个循环；721延伸7 min，PCR产物1. 0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定。2. pGME-T-hPLG-ΔΚ质粒的构建将上述浓度测定后的hPLG-ΔΚ片段连接pGME_T 载体，转化感受态大肠杆菌T0P10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCR和测序鉴定突变体 pGME-T-hPLG-ΔΚ质粒构建成功。3. pPICZ α A- hPLG-ΔΚ质粒的构建将鉴定正确的pGME-T-hPLG-ΔΚ 以炀ο !,Xba I酶切，1. 0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZ α A载体，再转化感受态大肠杆菌T0P10，涂布于含有25 Pg/mL Zeocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落PCR鉴定重组子。构建结果以含全长人PLG基因cDNA序列的质粒pDNR_LIB_hPLG为模板，经第一轮、第二轮PCR在800 bp附近均显示单一条带，分别与理论计算的778 bp,792 bp相符(见图1)。经测序证实在指定位置进行了突变(见图4，下划线为定点突变的位置)。4.巴斯德毕赤酵母的转化与筛选将构建的pPICZ α A- hPLG-ΔΚ质粒以fee I 线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后，涂布含 100 Pg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含200 μδ/ mL、800 Pg/mL Zeocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。同理进行pPICZ α A-hPLG-ΔΚ的转化与筛选。5. hPLG-ΔΚ基因的表达从含800 Pg/mL Zeocin的YPD酵母培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30°C培养16-18 h，直到0D600达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4°C离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。 菌体以15 mL的BMMY重悬，30°C摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 μ ，样品12 000 rpm离心5 min，上清-20°C保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇(终浓度1%)。样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。表达结果SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达24 h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值(见图8)。6. hPLG-ΔΚ的纯化与鉴定采用m-NTA亲和介质进行纯化，层析柱(2.5 cm X 15cm)先以 A 液(0.05 mol/L KH2PO4 — Na2HPO4 缓冲液(pH 7. 4),0. 5 mol/L NaCl )平衡 5 个柱床体积，流速为2 mL/min;发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL上样(流速 1 mL/min)，再以A液冲洗至A280近基线(流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/L 咪唑的A液进行阶段洗脱(流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15%还原性SDS-PAGE和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐(透析液0. 02 mol/L KH2PO4 -Nei2HPO4 缓冲液(pH 7. 4),0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，_20°C保存备用。取纯化、透析后的hPLG-ΔΚ，以摩尔比100 1加入UK，37°C分别反应20min、40min、 60min,80min,6hU2hU8h,24 h，还原性SDS-PAGE分析最适激活时间。激活后反应液通过 Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同上，洗脱液以0.02 mol/L KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、浓缩后冷冻干燥保存。统计数据以(i 士 s)表
示，采用SPSS 12. 0软件进行处理，两均数间的比较采用t检验，P<0. 05为有统计学意义。纯化和UK激活结果发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的hPLG-ΔΚ。将 hPLG-ΔΚ经UK激活12h后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的 hPLM-ΔΚ。免疫印迹实验表明hPLG-ΔΚ可与兔抗人PLG抗血清反应，证实为预期构建的蛋白 (见图11)。UK激活动力学通过还原性SDS-PAGE分析可见未激活hPLG-ΔΚ显示单一条带，而被UK激活为hPLm-ΔΚ后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带(见图 12)。实施例2 RGD-hPLG-ΔΚ的制备
1. pGME-T- RGD-hPLG-ΔΚ质粒的构建通过三轮PCR反应，第一轮以实施例1中构建好 WpGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游突变引物SEQ ID NO: 10 进行PCR ；第二轮以线性化的pGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，用第一轮PCR片段为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行PCR;第三轮用第二轮PCR产物为模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8。PCR产物经1. 0%琼脂糖电泳、胶回收、浓度测定后连接pGME-T载体，转化感受态大肠杆菌T0P10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCR和测序鉴定pGME-T- RGD-hPLG-ΔΚ质粒构建成功。2. pPICZ α A-RGD-hPLG-ΔΚ 质粒的构建将鉴定正确的 pGME_T_ RGD-hPLG-ΔΚ 以 Xho I、Xba I酶切，1. 0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZ α A载体，再转化感受态大肠杆菌riFlO，涂布于含有25 Pg/mL kocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落 PCR鉴定重组子。构建结果以实施例1的pGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，通过三轮PCR构建了突变体RGD-hPLG-ΔΚ的cDNA片段(见图2)；经测序证实在指定位置进行了突变(见图5，下划线为定点突变的位置)。3.巴斯德毕赤酵母的转化与筛选将构建的pPICZ α A- RGD- hPLG-ΔΚ质粒以 Sac I线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后， 涂布含100 Pg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含200 Pg/mL、800 Pg/mL Zeocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。按实施例1方法进行 pPICZ α A- RGD- hPLG-ΔΚ质粒的转化与筛选。4. RGD- hPLG-ΔΚ基因的表达从含800 Pg/mL Zeocin的YPD培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30°C培养16-18 h，直到0D600 达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4°C离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。菌体以15 mL的BMMY重悬，30°C摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 μ ，样品12 000 rpm离心5 min，上清_20°C保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇(终浓度1%)。 样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。表达结果SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达24 h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值(见图9)。5. RGD- hPLG-ΔΚ的纯化与鉴定采用m-NTA亲和介质进行纯化，层析柱(2.5 cm X15 cm)先以A液(0.05 mol/L KH2PO4 — Na2HPO4缓冲液(ρΗ 7·4)，0·5 mol/L NaCl )平衡 5个柱床体积，流速为2 mL/min;发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL上样(流速1 mL/min)，再以A液冲洗至A280近基线(流速2 mL/min)。依次以含5、10、500 mmol/ L咪唑的A液进行阶段洗脱(流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15%还原性SDS-PAGE和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐(透析液0. 02 mol/L KH2PO4 -Na2HPO4 缓冲液(ρΗ 7. 4)，0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，_20°C保存备用。取纯化、透析后的RGD- hPLG-ΔΚ蛋白，以摩尔比100 1加入UK，37°C分别反应 20min、40min、60min、80min、6h、12h、18h、24 h，还原性 SDS-PAGE 分析最适激活时间。激活后反应液通过Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同5所述，洗脱液以0.02 mol/L KH2PO4 -Na2HPO4缓冲液(ρΗ 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、浓缩后冷冻干燥保存。统计数据以G 士 S)表示，采用SPSS 12.0软件进行处理，两均数间的比较采用t 检验，P<0. 05为有统计学意义。纯化和UK激活结果发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的R⑶-hPLG-ΔΚ蛋白。将R⑶-hPLG-ΔΚ蛋白经M激活12h后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的RGD- hPLm-ΔΚ蛋白。免疫印迹实验表明RGD- hPLG-ΔΚ蛋白可与兔抗人PLG 抗血清反应，证实为预期构建的蛋白(见图11)。UK激活动力学通过还原性SDS-PAGE分析可见未激活RGD-hPLG-ΔΚ蛋白显示单一条带，而被UK激活为RGD- hPLm-ΔΚ蛋白后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带，经光密度扫描分析显示激活RGD-hPLG-Δ K显著的速率比hPLG-ΔΚ要慢，两者在24 h时的激活百分比无显著差别(见图12)。实施例3 RHP-hPLG-ΔΚ的制备
1. pGME-T-RHP-hPLG-ΔΚ质粒的构建通过三轮PCR反应，第一轮以实施例1中构建好 WpGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游突变引物SEQ ID NO: 11 进行PCR ；第二轮以线性化的pGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，用第一轮PCR片段为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行PCR;第三轮用第二轮PCR产物为模板，以上游引物 SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8。PCR产物经1. 0%琼脂糖电泳、胶回收、浓度测定后连接pGME-T载体，转化感受态大肠杆菌T0P10，Amp-LB培养板筛选白斑，菌落PCROXo I和 Xba I酶切测序鉴定pGME-T-RHP-hPLG-ΔΚ质粒构建成功。2. pPICZ α A-RHP-hPLG-ΔΚ质粒的构建将鉴定正确的 pGME-T- RHP -hPLG-ΔΚ 以 Xho I、Xba I酶切，1. 0%琼脂糖凝胶电泳、胶回收、浓度测定后连接pPICZ α A载体，再转化感受态大肠杆菌T0P10，涂布于含有25 Pg/mL kocin的LB固体培养基上筛选转化子，菌落 PCR鉴定重组子。构建结果以实施例1的pGME-T -hPLG-ΔΚ质粒为模板，通过二轮PCR构建了突变体RHP -hPLG-ΔΚ的cDNA片段(见图3);经测序证实在指定位置进行了突变(见图6，下划线为定点突变的位置)。3.巴斯德毕赤酵母的转化与筛选将构建的pPICZ α A- RHP - hPLG-ΔΚ质粒以 Sac I线性化，酚氯仿抽提进行纯化浓缩，电击转化感受态巴斯德毕赤酵母GS115菌株后， 涂布含100 Pg/mL Zeocin YPDS培养板，待长出菌落后再用无菌芽签挑单菌落，接种至含 200 Pg/mL、800 Pg/mL kocin的YPD培养板，筛选高拷贝重组子。按实施例1方法进行 pPICZ α A- RHP - hPLG-ΔΚ 的转化与筛选。4. RHP - hPLG-ΔΚ基因的表达从含800 Pg/mL kocin的YPD培养板上挑选2个单克隆菌落，接种到30 mL的BMGY液体培养基中，250 RPM，30°C培养16-18 h，直到0D600 达到3.0左右。等体积预冷的灭菌水洗涤，1500 rpm，4°C离心5 min，弃上清，重复洗涤一次。菌体以15 mL的BMMY重悬，30°C摇床，250 rpm培养，每隔12 h取样300 μ ，样品12 000 rpm离心5 min，上清_20°C保存，直至培养72 h，其间每隔24 h补加甲醇(终浓度1%)。 样品以还原性12% SDS-PAGE检测目的蛋白表达；纤维蛋白板法鉴定发酵液活性。表达结果SDS-PAGE检测显示各重组菌经甲醇诱导表达M h，在31 kDa处均出现单一条带，与理论计算的分子量接近，诱导72 h时即达到峰值(见图10)。5. RHP - hPLG-ΔΚ的纯化与鉴定采用Ni-NTA亲和介质进行纯化，层析柱(2. 5 cm X 15 cm)先以 A 液(0.05 mol/L Iffl2PO4 — Nei2HPO4 缓冲液(pH 7. 4),0. 5 mol/L NaCl )平衡5个柱床体积，流速为2 mL/min;发酵液12 000 rpm离心5 min后，上清取35 mL 上样(流速1 mL/min)，再以A液冲洗至A^O近基线(流速2 mL/min)。依次以含5、10、 500 mmol/L咪唑的A液进行阶段洗脱(流速2 mL/min)，收集各阶段洗脱峰，15%还原性 SDS-PAGE和纤维蛋白板法鉴定目的蛋白组份。合并活性组分，透析除盐(透析液0. 02 mol/L Iffl2PO4 — Nei2HPO4 缓冲液(pH 7. 4),0. 15 mol/L NaCl )和 PEG 20 000 浓缩，冷冻抽干，-20°C保存备用。取纯化、透析后的RHP - hPLG-ΔΚ，以摩尔比100 1加入UK，37°C分别反应20min、 40min,60min,80min,6h, 12h, 18h,24 h，还原性SDS-PAGE分析最适激活时间。激活后反应液通过Ni-NTA亲和色谱去除UK，纯化方法同5所述，洗脱液以0. 02 mol/L KH2PO4 一 Na2HPO4 缓冲液(pH 3.0,0. 15 mol/L NaCl )透析、浓缩后冷冻干燥保存。统计数据以(i 士 s)表示，采用SPSS 12.0软件进行处理，两均数间的比较采用t 检验，P<0. 05为有统计学意义。纯化和UK激活结果发酵液经Ni-NTA亲和层析纯化，可见位于97 kDa的杂带以及大部分的色素不能结合而流出，通过咪唑洗脱可得到纯度90%以上的RHP - hPLG-ΔΚ。将 RHP - hPLG-ΔΚ经UK激活1 后，再通过Ni-NTA亲和层析去除UK，得到具有直接纤溶活性的R⑶-hPLm-ΔΚ (未显示)。免疫印迹实验表明RHP - hPLG-ΔΚ可与兔抗人PLG抗血清反应，证实为预期构建的蛋白(见图11)。UK激活动力学通过还原性SDS-PAGE分析可见被UK激活为RHP - hPLm-ΔΚ后，由于蛋白水解作用失去一段小肽，显示为分子量稍小的条带，经光密度扫描分析显示UK激活RGD-hPLG-Δ K显著的速率比hPLG-ΔΚ要慢，而RHP-hPLM-ΔΚ与hPLG-ΔΚ无显著差别，且三者在24 h时的激活百分比无显著差别(见图12)。实施例4 hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ、RHP-hPLG-ΔΚ 的活性测定
分别取hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ和RHP-hPLG-ΔΚ冻干品，以0. 5 mL双蒸水复溶，BCA法测定蛋白浓度后，再以0. 02 mol/L PBS分别调整hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ至相同浓度0. 2 mg/mL,0. 4 mg/mL。1. hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ 和 RHP-hPLG-ΔΚ 的纤溶活性
1 %琼脂糖凝胶板中含有0.05 mol/L PBS CpH 7. 4)、1.5%纤维蛋白、800 U/mL UK、 0. 02% NaN3。凝胶打孔后，各孔中加等体积的样品液或PLG标准品，37°C湿盒保温过夜。游标卡尺测定各孔溶圈直径，以溶圈直径的平方与标准品活性作标准曲线，计算样品的比活性。2. RGD-hPLG-ΔΚ的抗血小板聚集活性
兔心脏取血18 mL加入2 mL 0.109 mol/L的枸椽酸钠溶液充分混勻，800 rpm离心
10 min，取上清为富血小板血浆(PRP);剩余血液再以2500 rpm离心20 min，取上清即为贫
血小板血浆(PPP)。血细胞计数板计数，PPP调节PRP使血小板浓度为2. 5-4. OX 108/mL。
将PRP、PPP转移至硅化的三角瓶中室温保存，1 h内用血小板聚集仪分别测定hPLG-ΔΚ、
RGD-hPLG-ΔΚ及其激活产物的血小板聚集抑制率(Ri)。测定时，将200 μ PRP加入搅拌
子后调零，加入5 μ ADP (终浓度lOumol/L)，反应5 min，记录最大聚集率(PAGm)，以此为
空白对照(PAGm. blank)；样品测定时，200 μ PRP 分别加入 5 μ 0.4 mg/mL PLG, PLM R
hPLG-ΔΚ、RGD-hPLG-ΔΚ、hPLM-ΔΚ、RGD-hPLM-ΔΚ 制备液，室温反应 15min 后检测样品 PAGm
(PAGm. sample) ；hPLG-ΔΚ的测定方法同上。血小板聚集抑制率的计算公式为
权利要求
1.一种人纤溶酶原功能性突变体，为人纤溶酶原蛋白的ftX)544 - Asn791多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2.权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID N0:2所示。
3.一种人纤溶酶原功能性突变体，是将权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体中的 Pro559突变为Asp559，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
4.权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID NO:4所示。
5.一种人纤溶酶原功能性突变体，是将权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体中的 Gly56tl突变为His56°，其氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示。
6.权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体的编码基因，其核苷酸序列如SEQID N0:6所示。
7.权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤 以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，设计上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8进行第一轮PCR;再以第一轮PCR产物为模板，设计上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR;第二轮PCR产物连接载体转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母进行表达，表达产物即为权利要求1所述人纤溶酶原功能性突变体。
8.权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤 以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID NO:8进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第二轮PCR ;PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板，用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 10进行第三轮PCR ；再以线性化的质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行第四轮PCR;最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID N0:8进行第五轮 PCR ；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，以巴斯德毕赤酵母GS115菌株进行表达，表达产物即为权利要求3所述人纤溶酶原功能性突变体。
9.权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体的制备方法，其特征在于包括以下步骤 以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板，以上游引物SEQ ID N0:7和下游引物SEQ ID N0:8进行第一轮PCR;以第一轮PCR产物为模板，上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第二轮PCR ；PCR产物连接载体转化大肠杆菌，构建质粒；以构建的质粒为模板， 用上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO: 11进行第三轮PCR ；再以线性化质粒为模板，以第三轮PCR产物为上游引物，与下游引物SEQ ID N0:8进行第四轮PCR;最后以第四轮PCR产物为模板，以上游引物SEQ ID N0:9和下游引物SEQ ID NO:8进行第五轮PCR ；第五轮PCR产物转化大肠杆菌，所得产物以巴斯德毕赤酵母GSl 15菌株进行表达，表达产物即为权利要求5所述人纤溶酶原功能性突变体。
10.权利要求1、3或5所述人纤溶酶原功能性突变体在制备预防或治疗炎症、肿瘤、血栓、阿茨海默或黄斑水肿疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了人纤溶酶原功能性突变体，分别为hPLG- K人纤溶酶原蛋白的Pro544-Asn791多肽；RGD-hPLG- KhPLG- K中的Pro559突变为Asp559；和RHP-hPLG- KhPLG- K多肽的Gly560突变为His560。本发明还公开了上述功能性突变体的制备方法，是以含人纤溶酶原全长cDNA序列的质粒为模板进行PCR后构建质粒，用巴斯德毕赤酵母进行表达，获得产物。本发明的功能性突变体兼具纤溶与抗血小板聚集或抗纤维蛋白单体聚合作用的双重功能。
文档编号C12N15/81GK102199587SQ20111007113
公开日2011年9月28日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者吴敬源, 吴茂材, 张鑫涌, 杨健忠, 陈振林, 陈武, 黄智慧 申请人:广东药学院