专利名称：酵母展示脂肪酶催化合成维生素a乳酸酯的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A 乳酸酯的方法。
背景技术：
维生素A(视黄醇)是一种天然的脂溶性维生素，具有维持正常视觉反应、骨骼发育、上皮组织功能，维护皮肤细胞功能、促进生长发育及清除自由基、提高免疫能力等功效， 因此维生素A已经广泛应用于化妆品、保健食品等行业。维生素A系列中最常用的是维生素A和维生素A醋酸酯，但它们在光、空气、氧化剂和高温的条件下极易被氧化，现在已经有大量的研究集中于发展合成性质稳定的维生素A衍生物如维生素A脂肪酸酯(维生素棕榈酸、油酸酯)。α-羟基酸(最常见的乙醇酸和乳酸)在改善皮肤、促进角质层再生等防止皮肤老化方面功效已被证实，但由于这些酸可以迅速渗透到表皮深处，浓度超过5%时，就会严重伤害皮肤组织，维生素A的α -羟基酸酯可以有效的克服以上缺点，并且保持较高的维生素A活性，与非酯化形式相比具有更明显的护肤作用。目前市场上维生素A乳酸酯 (retinyl lactylate)是用化学合成制得，然而化学法合成不仅存在化学催化剂带来的有毒物质，而且高温、高压条件下很容易发生副反应，产生有毒副作用的产物，同时还有能耗高、对设备和仪器要求高、对环境污染严重等问题，酶法合成可以避免这些问题。目前已有利用脂肪酶合成维生素A乳酸酯的报道，但是由于脂肪酶(游离酶或固定化)制作复杂、生产成本高限制了这一生物催化过程的商业化、规模化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，可显著降低维生素A乳酸酯生产成本，同时达到较高的酯化反应效率和产率。一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，包括将维生素A醋酸酯和乳酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于 50 60°C反应10 14小时，分离、纯化制得维生素A乳酸酯。优选的，所述的有机溶剂为正己烷。优选的，每升有机溶剂中维生素A醋酸酯、乳酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为 20 100g、30 100g、50 100g。搅拌速率为200 250转/分钟。所述的分离、纯化为将反应液离心，取上清液，旋转蒸发除去有机溶剂，水洗后溶于正己烷，重结晶。所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体PPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia paStoriS)GS115为商业化产品，可从^witrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的 Genbank 号为]\C8164。载体pPIC9K为商业化产品(如hvitrogen公司)，它存在MF α 1信号肽序列(Genbank号Μ17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOXl启动子(Genbank号 Ζ46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化，可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性，由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生，终转化率(以维生素A计)在87%以上。
具体实施例方式实施例1制备酵母展示脂肪酶通过人工合成的方法，合成米根霉(lihizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank 号AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为Μ28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS (linker)，连接后得到核苷酸序列 pro-ROL-linker-α -agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中 pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，上游引物5，-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3，；下游引物5，-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3，PCR反应体系为模板DNA为1 μ 1，高保真DNA聚合酶0. 5 μ 1，dNTP (50mM) 0. 4 μ 1， 上下游引物各0. 5 μ 1，10XPCR缓冲液5 μ 1，加水至50 μ 1。PCR运行条件为94°C 3分钟，；35个循环(94°C 30秒，60°C 1分钟，72°C 30秒)， 72 V 10分钟。用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成PPIC9K-R0L质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115 发生His 4单位点置换重组，用Ml I对pPIC9K-R0L质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15 μ 1加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Q，25uF条件下电击10ms，并加入约Iml预冷的山梨醇。将上述混勻的电转产物约400μ 1涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5% (体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞， 用水冲洗后，接种至YGC培养基中30°C培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80°C下预冻后再经德国 Christ真空冷冻干燥机干燥Mh，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。实施例2酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯实例1取维生素A醋酸酯0. 328g、乳酸0. 35g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，然后加入酵母展示脂肪酶0. 5g，充队密封，置于85_1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在45°C，反应1 后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4°C 结晶得维生素A乳酸酯产品，烘干、粉碎即可。实例2取维生素A醋酸酯0.656g、乳酸0. 7g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，然后加入酵母展示脂肪酶lg，充队密封，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50°C，反应1 后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂，水洗3次后加入正己烷于4°C 结晶得维生素A乳酸酯产品，烘干、粉碎即可。实施例3采用传统化学法合成维生素A乳酸酯实例1取维生素A醋酸酯0. 328g、乳酸0. 35g，加入含有IOmL正己烷的磨口三角瓶，混合、预热lOmin，充N2密封，置于85_1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/ 分钟，反应温度保持在45°C，反应1 后停止搅拌，取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂， 水洗3次后加入正己烷于4°C结晶得维生素A乳酸酯产品，烘干、粉碎即可。实施例4测定转化产率和转化率取ImL未分离的反应产物，离心去除催化剂，旋转蒸发溶剂，用100%甲醇准确定容至10mL，该溶液经0. 22μπι有机滤膜过滤后用高效液相色谱(HPLC)测定溶液各组分浓度。HPLC条件如下Agilent Technologies 1200系列高效液相色谱液，色谱柱: Grace Prevail Organic Acid 5ul50mmX4. 6mm，柱温40 °C，流动相甲醇 / 水 / 磷酸 (85/15/0. 1)，流速lmL/min，进样量10 μ L，检测波长:280nm。转化率计算公式如下C retinyl acetate-C ester/C retinyl acetate κ 100%。式中C ester为HPLC测定样品中维生素A乳酸酯的浓度，C retinylacetate为反应前样品中维生素A醋酸酯的浓度。通过上述方法检测计算，实施例2中，实例1合成维生素A乳酸酯的转化率达 87%，实例2合成维生素A乳酸酯的转化率达85%。而实施例3利用采用传统化学法合成维生素A乳酸酯的转化率仅为38%。
权利要求
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，包括将维生素A醋酸酯和乳酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50 60°C反应10 14小时，分离、纯化制得维生素A乳酸酯； 所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia paSt0riS)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72 144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；所述的重组质粒由原始载体PPIC9K和依次插入原始载体PPIC9K中MF α 1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以每升有机溶剂计，维生素A醋酸酯、乳酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20 100g、30 100g、50 100g。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的有机溶剂为正己烷。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述生物印迹中所采用的配体为油酸。
全文摘要
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成维生素A乳酸酯的方法，包括将维生素A醋酸酯和乳酸溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应10～14小时，分离、纯化制得维生素A乳酸酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成维生素A乳酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。
文档编号C12N9/20GK102212602SQ201110110429
公开日2011年10月12日 申请日期2011年4月28日 优先权日2011年4月28日
发明者何国庆, 周陈伟, 地里热巴, 徐娟, 林吉恒, 王睿之, 阮晖 申请人:浙江大学