专利名称：一种新的促性腺激素释放激素导向融合蛋白突变体的制作方法
技术领域：
目前治疗癌症的传统方法包括手术、放疗和化疗等，其中运用手术治疗是一种非常直接有效的方法，但实际上会受到病种和病程等多种复杂因素的制约，很多情况下难以实施，放疗和化疗是治疗癌症最常见的方法，但众所周知其副作用非常大，效果却大多不理想，所以医学界试图寻找一种副作用小、药效显著的生物治疗方法来替代放、化疗法，近来导向治疗以惊人的速度和独特的疗效引起了广大从事肿瘤治疗的研究者的广泛关注。本发明涉及到一种融合蛋白，以促性腺激素释放激素(&1RH)为导向部分，能够特异性地与过量表达促性腺激素释放激素受体(&1RHR)的肿瘤细胞相结合，以假单胞杆菌外毒素A的缺失体PE40，并且其C末端5个氨基酸突变为Lys-Asp-Asp-Leu，即为PE40KDDL 作为毒性部分，特异性地杀死肿瘤细胞。
背景技术：
1.本项目融合蛋白的导向部分促性腺激素释放激素(&1RH)促性腺激素释放激素(Gonadotropin releasing hormone，GnRH)，又称促黄体激素释方文激素(Luteinizing hormone releasing hormone。LHRH),是一个由 10 个氨基酸组成的多肽激素，主要由下丘脑弓状核分泌细胞产生，调控人体激素水平及生殖功能。此外， 在脑干、杏仁核等下丘脑以外的神经组织中也存在&iRH神经纤维。实际上，&iRH在整个脑区均有分布。研究还发现，松果腺、视网膜、性腺、胎盘、肝脏、消化道及颂下腺等多种器官组织存在&iRH或&iRH样肽。说明这种激素的来源和分布十分广泛。促性腺激素释放激素受体是视紫红质相似的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员， 其在许多人类肿瘤细胞膜表面高密度表达。生殖系统的癌组织，如子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌等癌细胞的细胞膜表面、生殖系统以外的腺癌细胞如黑色素瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、肺癌等的表面都有过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、 发展和浸润等方面发挥了重要作用。2.本项目融合蛋白的毒素部分PE40KDDL假单胞杆菌外毒素A (PEA)是一种多肽毒素，它通过和靶细胞表面的PEA受体结合进入细胞，催化延长因子2 (EF-2)的ADP核糖基化，阻止蛋白质合成，而导致细胞死亡。PEA 分子由3个部分组成，包括受体结合结构域、转位(跨膜)结构域和活性结构域。为了消除PEA与细胞的非特异性结合，我们将PEA分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端 1-252位氨基酸后，得到了 PE40分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变， 突变为Lys-Asp-Asp-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDDL。3.导向部分与毒素部分的连接通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GnRH)-5肽-毒素部分(PE40KDDL)，融合蛋白序列见SEQ ID NOl。4.本发明融合蛋白的特点基于前面所述，促性腺激素释放激素受体在许多人类肿瘤细胞膜表面高密度表达。生殖系统的癌组织，如子宫内膜癌、卵巢癌和乳腺癌等癌细胞的细胞膜表面、生殖系统以外的腺癌细胞如黑色素瘤、胃癌、肝癌、胰腺癌、肠癌、肺癌等的表面都有过量表达，对肿瘤组织具有重要的生长效应，并且其在肿瘤的发生、发展和浸润等方面发挥了重要作用。所以目前有很多报道是针对促性腺激素释放激素受体进行肿瘤治疗的。这些技术在针对肿瘤治疗存在了一定的局限性，比如，促性腺激素释放激素与化疗药相藕联，由于其藕联方式的问题，化疗药容易脱落，造成药物失效，并且化疗药由于不具有选择性，在整体药物到达肿瘤部位之前会侵害正常细胞。通过本发明有效地解决了上述缺点，本发明是使用&iRH作为导向，PE40KDDL作为毒素部分，能够高效地杀死肿瘤细胞。由于二者是通过5肽肽键进行相连，所以不会有药物脱落的问题；并且毒素部分只有在进入肿瘤细胞后，才能够发挥杀死细胞的作用，而正常细胞表面没有&iRH受体或含量极低，所以其对于正常细胞的毒性非常小，而是特异性杀死肿瘤细胞，并且由于PE40KDDL杀死肿瘤细胞的高效率，作为治疗手段能够控制肿瘤的发展。 本专利发明了一类新型导向药物，是选择促性腺激素释放激素以及细胞毒素的小功能片段组成的融合蛋白导向药物，其具有分子量小，用量少和特异性强等特点。
三.
发明内容
本专利中的药物导向部分包括促性腺激素释放激素(&1RH)，我们将假单胞杆菌外毒素A(PEA)分子的受体结构域去除，即去除PEA分子N末端1-252位氨基酸后，得到了 PE40 分子，然后我们将PE40分子的C末端5个氨基酸进行突变，突变为Lys-Asp-Asp-Leu，得到了活性更高的毒素部分，PE40KDDL。通过5肽(-His-Met-Ala-Glu-Glu-)将两部分通过肽键连接起来，顺序为导向部分(GnRH)-5肽-毒素部分(PE40KDDL)，融合蛋白序列见SEQ ID NOl。作为本发明中的融合蛋白，是一类自然界没有的人工蛋白，其特征为&1RH和 PE40KDDL组成的融合蛋白，可以使用一种具有序列表中SEQ ID NOl的序列，也可以使用对序列表SEQID NOl中融合蛋白的氨基酸序列加以修饰，如插入，缺失，突变某个或某些氨基酸而得到的序列，只要基本保持原分子的生物活性即可。换句话说，也可以使用采用其氨基酸序列大体上与序列表SEQ ID NOl中融合蛋白氨基酸序列相同的蛋白，即使用氨基酸序列具有大于等于90%序列同一性的变体或其功能性片段。本发明的另一方面，涉及一种药物组合物，其含有本发明所述的融合蛋白，以及任选的药物上可接受的载体。在本发明知，术语“药物上可接受的”意味着制约领域公认的可用于动物，更特别的是可用于人的。术语“载体”指稀释剂、佐剂(例如(完全或不完全)弗氏佐剂)、赋形剂、或用于容纳或施用治疗剂的介质。这些药用载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括源自石油、动物、植物、或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、诸如此类。静脉内施用药用组合物时，水是优选的载体。盐水溶液以及水性右旋糖和甘油溶液也可用作液态载体，特别是用于可注射溶液。合适的药用赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油、滑石、氯化钠、奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇、诸如此类。如果需要， 组合物还可以包含较少数量的润湿或乳化剂如透明质酸钠，或是PH缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳状液、片剂、丸剂、胶囊粉剂、缓释配方、诸如此类的形式。在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物为冻干注射剂形式，其中含有 0. 01% -0. 2%的融合蛋白，以及5%的甘露醇，以及药物上可接受的载体。本领域普通技术人员知晓，所述融合蛋白可以通过基因重组表达的方法或者化学合成的方法制备。在本发明中，所述融合蛋白是通过基因工程重组表达的方法获得的。实例一重组融合蛋白质粒的构建和工程菌的获得以设计好的SEQ ID NOl氨基酸序列为模板，根据中心法则，选择大肠杆菌偏好的密码子，得到融合蛋白的所对应的核酸序列，再使用全基因合成技术得到上述目的基因片段。通过本领域普通技术人员知晓的重组技术获得重组基因载体pUC-GnRH，对插入载体的基因片段进行序列测定。验证其基因序列的正确性后，扩增保存，从该载体上切取下目的基因片段，插入表达载体中，重组质粒命名为P&iRH。然后用CaCl2法转化大肠杆菌BL21， 涂布在含有抗生素的筛选平板培养基表面，挑选阳性菌落在液体培养基中培养至0D600为 0. 6-0. 8时加入IPTG诱导后离心收集菌体，破菌后12% SDS-PAGE电泳时出现一条明显的蛋白表达带，表达量为38%。经天然型PE的单克隆抗体免疫印迹检定，显示阳性反应，再把重组表达载体导入表达宿主菌中，经培养表达，疏水层析和离子交换层析得到目的蛋白 GnRH-PE40KDDL，用MTT细胞测活法测定GnRH_PE40KDDL的杀伤肿瘤细胞的活性，所获得的高效表达融合蛋白的工程菌命名为P&1RH/BL21。实例二目的蛋白的表达1)摇瓶表达将如上述制备的基因工程菌p&iRH/BL21，在LB培养基中摇瓶过夜培养(37°C，210rpm)，再按体积比1 30接种至LB培养基中，37 °C培养3小时后，加入 0. ImMIPTG诱导5小时。收集菌体经SDS-PAGE电泳分析，发现融合蛋白(43KD)以可溶性表达为主，表达量占菌体总蛋白的38%。2)大规模发酵表达a.培养基组成a)种子液培养基(LB)胰蛋白胨10克/升、酵母粉5克/升、氯化钠10克/升。b)上罐培养基(15升)磷酸氢二钠250克，磷酸二氢钾110克，氯化钠13.克，氯化铵30克，胰蛋白胨120克。以上成分一起在罐中灭菌；下面的成分单独灭菌后加入发酵罐。硫酸镁30克，葡萄糖450克，补料(500克/升)葡萄糖。b.发酵及诱导表达i)种子培养从已鉴定的平皿上划取菌种，接种到50毫升Q50毫升的三角瓶)LB中，36°C、220 转/分、8小时后将这50毫升种子液转接到700毫升LB中，36°C、210转/分，培养过夜。ii)发酵及诱导表达过程将培养好的种子液(0D600 = 5-8)加入罐中，调好各参数，36 °C、150转、溶氧 100%,开始发酵；5小时后开始以2. 5速流加2小时，约加入800毫升补料，加入0. 5克IPTG 诱导(四小时)。
5
实例三目的蛋白纯化(1)疏水层析采用疏水层析介质(Octyl Sepharose 4 Fast Flow)，平衡液A采用25mM Tris-HCl,pH8, IM硫酸铵，平衡后，裂菌的离心上清上样(补硫酸铵至1M)，用A平衡5个柱体积后，线性梯度洗脱，0-20个柱体积，1-0. IM硫酸铵，收集融合蛋白峰。(2)阴离子交换层析采用Source 30Q阴离子交换层析介质，平衡液A为25mM Tris-HCl，pH8，平衡，上一步得到的样品用水稀释4倍上样，平衡，线性梯度洗脱，0-20个柱体积，0-0. 5M NaCl，收集目的融合蛋白峰。(3)阴离子交换层析采用 Q Sepharose High Performance 层析介质，平衡液为 20mM PB, pH7. 4，上一步得到的样品用水稀释3倍进行上样，平衡后采用20mM PB，pH7.4，0-lM NaCl，0_10个柱体积的梯度洗脱，收集目的蛋白洗脱峰。实例四杀伤肿瘤细胞的活性测定(1)GnRH-PE40KDDL对肿瘤细胞的靶向性测定(ELISA法)将LOVO(人结肠癌细胞)及293T(人胚肾细胞)细胞用RPMI-1640基础培养液制成细胞悬液，取96孔细胞培养板，每孔接种细胞数为1 X IO4,100 μ L/孔，37°C 5% CO2培养箱孵育12h使之贴壁后，弃去上清RPMI1640培养液，分别加入用RPMI 1640等比稀释的 GnRH-PE40KDDL融合蛋白，LHRH-PE40融合蛋白样品，100 μ 1/孔，复孔5个为1组，加等体积的基础培养液作为空白对照，置37°C 5% CO2培养箱作用60min，弃上清，洗涤3次，再加入一抗(抗PE抗血清300 X)和二抗酶结合物(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体IgG-HRP) 后，OPD染色，2mol/LH2S04终止，酶标仪490nm波长测每孔光密度值(0D值)并记录。结果见表1表lGnRH-PE40KDDL对肿瘤细胞的靶向性测定数据
融合蛋白药品给药浓度(μ g/ml)
12.525501002004008001600GnRH-PE0.846士1.324±1.537±1.752土1.934士1.952土1.941±1.937士LOVO40KDDL0.0230.0560.0720.0890.1060.1210.1260.116LHRH-PE0.722士1.161±1.416±1.624土1.806土1.946土1.924±1.908士400.0210.0630.0690.0820.1020.1250.1290.123GnRH-PE0.045士0.032±0.048±0.086士0.068i0.034土0.072土0.058士293Τ40KDDL0.0030.0020.0030.0050.0040.0020.0050.004LHRH-PE0.034±0.056±0.061±0.038±0.054士0.095士0.088士0.052士400.0040.0030.0040.0030.0020.0060.0060.005 由表可见，以基础培养液组为空白对照，经ELISA反应后，测得过度表达&iRH受体的LOVO细胞分别加入GnRH-PE40KDDL，LHRH-PE40融合蛋白纯化样品，在融合蛋白浓度值不大于其受体能容纳的饱合浓度前提下，随着浓度的递增，GnRH-PE40KDDL, LHRH-PE40与 GnRH受体结合的OD值的平均值明显增加，与细胞表面几乎不表达GnRH受体的细胞的阴性对照组相比有显著意义；在相同浓度的情况下，&1RH-PE40KDDL融合蛋白与其受体结合的OD值显著高于LHRH-PE40融合蛋白。LOVO细胞表面的受体在融合蛋白的浓度达到饱和之后，随着给融合蛋白浓度的加大，结合量不再上升。实验结果说明GnRH-PE40KDDL对肿瘤细胞的靶向性高，GnRH_PE40KDDL的靶向杀死肿瘤的活性高于LHRH-PE40。(2) GnRH-PE40KDDL对体外细胞的杀伤力(流式法)将H0-8910 (人卵巢癌细胞)细胞用RPMI-1640基础培养液制成细胞悬液，以接种细胞数为2X105/ml在培养瓶中，37°C 5% CO2培养箱孵育1 使之贴壁后，弃去上清 RPMI1640培养液，分别加入用RPMI 1640稀释的GnRH_PE40KDDL融合蛋白，LHRH-PE40融合蛋白样品，使其终度为0. 03ymol/L，对照组为只加RPMI1640培养液的H0-8910细胞，培养 72h后，胰酶消化，PBS洗两次，1000r/min离心，弃上清，加入顶冷的75%酒精固定4°C，2h， 离心，弃去固定液，PBS重悬细胞lOmin，离心，RnaseI消化30min (37°C )，用PI染液染色， 4°C避光30min ；流式细胞仪检测凋亡细胞的百分数。流式细胞仪检测结果(图略)在PI荧光的直方图上，GnRH-PE40KDDL组细胞和LHRH-PE40组细胞Gl峰前出现了代表凋亡细胞的亚二倍体峰，而对照组没有代表凋亡细胞的亚二倍体峰，两者比较差异显著。说明GnRH-PE40KDDL和LHRH-PE40引起了人卵巢癌细胞H0-8910的凋亡。细胞周期分析结果显示，与对照组比较Gl期细胞增加但不显著，S期细胞明显减少。在同等条件下，GnRH-PE40KDDL组和LHRH-PE40组中的业二倍体峰比较可知， GnRH-PE40KDDL使肿瘤细胞凋亡的效果优于LHRH-PE40，即GnRH_PE40KDDL的靶向杀死肿瘤的活性高于LHRH-PE40。(3) GnRH-PE40KDDL对移植于裸鼠的人非小细胞肺癌NCI-H460 (实体型)的活性测
定取生长良好的人非小细胞肺癌NCI-H460瘤块，用无血清培养基勻浆制备成1 XlO7ceIVml浓度的细胞悬液，每只小鼠腋皮下接种0. anl，接种后待肿瘤长至 0.3X0. 3cm体积大小后随机分组。设生理盐水对照组、环磷酰胺(cyclophosvnamidhCTX) 阳性对照组(100mg/kg)，GnRH-PE40KDDL融合蛋白，LHRH-PE40融合蛋白组分别50、25和 12. 5 μ g/kg三个剂量组，分组后生理盐水对照组每天静脉1次，连续7天，给药0. 2ml/20g 体重；CTX组每大给药1次，连续2天，一周后再给药1次；GnRH-PE40KDDL融合蛋白和 LHRH-PE40融合蛋白组连续静脉注射7天，每天1次，给药体积为0. 2ml/20体重，接种14 日后颈椎脱白处死小鼠，解剖取出瘤块，称瘤重，根据以下公式计算肿瘤生长抑制率(抑瘤率)
对照组平均瘤重一给药组平均瘤重
抑瘤率％ = _ χ 100%
对照纟R平均瘤屯试验结果GnRH-PE40KDDL融合蛋白在50、25、12. 5μ g/kg的剂量下，连续注射7次，对人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤率分别为82. 56,75. 48,46. 22，表明GnRH_PE40KDDL融合蛋白对体内实体瘤的杀伤力强；与LHRH-PE40融合蛋白相比，GnRH-PE40KDDL融合蛋白的杀伤实体肿瘤效果更显著。结果见表2。表2GnRH-PE40KDDL对移植于裸鼠的人非小细胞肺癌NCI-H460的抑瘤作用
权利要求
1.一种新的基因工程融合蛋白突变体，具有SEQ ID NOl所示的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸序列，其编码如权利要求1所述的新的融合蛋白突变体。
3.权利要求1中的新的融合蛋白突变体为主要成分的药物组合物，主要攻击促性腺激素释放激素(&iRH)受体异常表达的各类肿瘤细胞。
4.权利要求3中的重组载体的宿主细胞包括细菌、酵母和哺乳动物细胞。
5.权利要求1中的新的融合蛋白突变体，是使用基因工程重组表达载体经过转化、发酵和纯化而得到。
全文摘要
本专利涉及一种可以定向杀死肿瘤细胞的融合蛋白突变体，是由促性腺激素释放激素(GnRH)组成的导向部分和由细胞毒素组成的效应部分构成，具有定向到达并杀死过量表达GnRH受体的肿瘤细胞的特性。
文档编号C12N15/63GK102321178SQ201110119270
公开日2012年1月18日 申请日期2011年5月10日 优先权日2011年5月10日
发明者刘存莲, 刘波, 武靖 申请人:北京易德新奥生物科技有限公司