专利名称：少动鞘氨醇单胞菌的番茄红素环化酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及少动鞘氨醇单胞菌的番茄红素环化酶基因(crtY)、缺失该基因的重组少动鞘氨醇单胞菌及其应用。
背景技术：
结冷胶是由β-1，3-D-葡萄糖、β-1，4_D-葡萄糖醛酸、β-1，3-D-葡萄糖、α-1， 4-L-鼠李糖连接聚合构成的微生物胞外多糖。与同类产品相比，它具有很多优越性能，如用量少；凝固点、熔点等可调；耐酸，耐碱，热稳定性高；良好的水溶性、呈味性、保湿性、成膜性、缓释性等。近年来，结冷胶被作为新型乳化剂、悬浮剂、增稠剂、稳定剂、凝胶剂、缓释剂、 成膜材料等日益广泛地应用于食品、医药、化工等工业领域。此外，结冷胶可与其他食品胶复配使用，使食品能够获得最佳的感官、质构和稳定性要求。结冷胶应用前景广阔，然而其较高的生产成本限制了推广应用。结冷胶是由少动鞘氨醇单胞菌发酵生产的。少动鞘氨醇单胞菌是一种革兰氏阴性，好氧的杆菌且端生鞭毛，其发酵产结冷胶的同时产黄色类胡萝卜素。类胡萝卜素的生物合成途径已被广泛研究并取得了巨大进展，大量关键酶基因得到克隆。所有的类胡萝卜素均通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成。IPP(异戊烯焦磷酸)是该合成途径的前体物质。在大部分细菌中，IPP是由丙酮酸和3-磷酸甘油醛经MEP(2-C-甲基-D-赤藓糖醇)途径合成。IPP在IPP异构酶作用下生成DMAPP ( 二甲基丙烯基二磷酸)，然后再与 3个IPP缩合生成GGPP (栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸)。两分子GGPP在八氢番茄红素合成酶的作用下形成第一个无色的类胡萝卜素-八氢番茄红素，之后合成途径形成很多分支。在大部分的细菌中，八氢番茄红素在八氢番茄红素脱氢酶的作用下经过4个连续的脱氢步骤后形成红色的番茄红素。番茄红素再经过环化酶、羟化酶、酮化酶等一系列不同酶的作用下形成各种类胡萝卜素。番茄红素是类胡萝卜素的一种，由11个共轭及2个非共轭碳-碳双键组成的直链型碳氢化合物。番茄红素具有很强的抗氧化性，能高效淬灭单线态氧，清除体内自由基，具有抗癌抑癌、预防心血管疾病、增强人体免疫系统和延缓衰老的功效。作为功能性天然色素，番茄红素在食品、保健品、化妆品和医药等方面的应用日趋广泛，需求量越来越大，市场前景广阔。目前尚未有少动鞘氨醇单胞菌番茄红素环化酶基因序列以及利用基因敲除技术敲除少动鞘氨醇单胞菌番茄红素环化酶基因从而结冷胶发酵联产番茄红素的报道。
发明内容
本发明的目的是提供少动鞘氨醇单胞菌的番茄红素环化酶基因的DNA序列和该酶缺失的重组菌株及其应用。本发明采用的技术方案是少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)的番茄红素环化酶基因(crtY)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。该序列长度为1158bp，编码一个由385个氨基酸组成的蛋白质。本发明还涉及一种crtY基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌，由少动鞘氨醇单胞菌经基因敲除去除SEQ ID NO. 1所示的crtY基因序列获得。基因敲除为本领域常规技术，在已知被敲除的基因序列情况下，本领域普通技术人员可根据常识选择常规方法进行基因敲除操作。具体可按如下进行1、以少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板，利用PCR方法扩增crtY基因的上、下游片断，分别将上、下游片断插入常规敲除载体PL03构建crtY基因敲除载体pL03- Δ Y ；2、将crtY基因敲除载体pL03_ Δ Y通过三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌中；3、第一次同源重组时整个敲除质粒插入基因组中的同源位点、四环素抗性筛选得到阳性重组子，并用PCR方法扩增sacB基因鉴定。将筛选得到的同源重组第一次交换阳性重组子接种入预培养培养基中传代三次，然后涂布在含8%蔗糖的筛选平板上以筛选第二次同源重组交换体。筛选得到的第二次同源重组体影印至含四环素的抗性平板并用PCR方法进一步鉴定，从而获得crtY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌。本发明中，所述基因敲除可借助SEQ ID NO. 2所示的核苷酸片断进行。具体如下 分别将SEQ ID NO. 2中上游(SEQ ID NO. 2第396 773位碱基)下游(SEQ ID N0. 2第 1542 2018位碱基)片断插入敲除载体pL03构建crtY基因敲除载体pL03_ Δ Y ；然后将crtY基因敲除载体pL03- Δ Y通过三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌中，经筛选得到 crtY基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌。SEQ ID N0. 2的DNA序列包括crtY基因在内共 2018bp,由如下方法获得根据少动鞘氨醇单胞菌ATCC31461crtY的部分序列(NCBI登录号HQ2(^920)设计基因特异性引物，进而通过SiteFinding-PCR技术获得包括crtY基因的完整序列及与NCBI登录号为HQ2(^920的序列拼接获得基因敲除所需的部分侧翼序列。本发明还涉及所述的重组少动鞘氨醇单胞菌在微生物发酵制备结冷胶和番茄红素中的应用。本发明的有益效果主要体现在本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌番茄红素环化酶基因(crtY)的DNA序列为少动鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素生物合成途径进行遗传改造奠定基础。另外，本发明通过基因敲除的方法构建的番茄红素环化酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株与野生型菌株相比，结冷胶产量基本不变并产番茄红素，从而可以结冷胶发酵联产番茄红素，同时，该菌株还可以应用于进一步的代谢工程改造。
图1为pL03质粒的结构示意图；图2为PCR法鉴定crtY基因敲除的电泳图1以构建的crY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板(1107bp)，2以野生型少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板作对照 (1869bp)。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1 少动鞘氨醇单胞菌crtY基因DNA序列的获得
根据少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461 crtY的部分序列(NCBI登录号HQ2(^920) 设计上游基因特异性引物，通过SiteFinding-PCR技术获得包括crtY基因的完整序列及与 NCBI登录号为HQ2(^920的序列拼接获得基因敲除所需的部分侧翼序列。所用的上游基因特异性引物、SiteFinder、SFP引物序列如下上游序列特异性引物UPl 5' -GCTGTAATAGGTGTCCTCGACGA-3‘UP2 5' -TGAACGGCAGGCAATAGACGAAG-3‘SiteFinder SiteFl 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGG-3‘SiteF2 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNCATGC-3‘SiteF3 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCT-3‘SiteF4 5 ‘ -CACGACACGCTACTCAACACACCACCACGCACAGCGTCCTCAANNNNNNGCCACG-3‘SFP 引物SFPl 5' -CACGACACGCTACTCAACAC-3‘SFP2 5' -ACTCAACACACCACCACGCACAGC-3‘从少动鞘氨醇单胞菌Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 (从 ATCC 购买) 中提取基因组DNA(使用Axyft^p细菌基因组DNA小量制备试剂盒)作为PCR模板利用 SiteFing-PCR技术扩增得到的目标DNA片断割胶回收(使用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒)纯化后连接到PMD19-T (Takara)载体上，转化大肠杆菌ToplO感受态细胞，挑取氨苄抗性克隆，菌落PCR鉴定pMD19-T中是否插入回收的PCR片段。对阳性克隆测序anvitrogen 公司测定)，并作BLAST分析，发现得到的上游目标DNA片断包含起始密码子，将上述序列与 NCBI登录号为HQ2(^920的序列中用于敲除crtY基因的序列拼接后获得一段长为2018bp 的DNA序列，如SEQ ID No. 2所示，其中包含的crtY基因(SEQ ID No. 1)全长为1158bp (SEQ ID No. 2第621位碱基 第1778位碱基)。实施例2 番茄红素环化酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株的构建1、基因敲除载体pL03_ Δ Y的构建根据获得的DNA序列设计引物。从少动鞘氨醇单胞菌Sphingonmonas paucimobilis ATCC 31461 (ATCC购买)中提取基因组DNA(使用AxyPr印细菌基因组DNA 小量制备试剂盒)作为PCR模板。YU Y2为引物Taq酶(Takara)扩增上游同源序列，PCR 反应程序为95°C预变性5min进入循环过程；94°C变性30sec，62°C退火30sec，72°C延伸 30seC，30个循环，最后以72°C延伸IOmin。Y3、W为引物Taq酶(Takara)扩增下游同源序列，PCR反应程序为95°C预变性5min进入循环过程；94°C变性30sec，63°C退火30sec， 72°C延伸40s，30个循环，最后以72°C延伸IOmin0上述引物序列如下Yl 5' -ATGAGCTCCAACCTGTTCAACACCAC-3‘下划线为 SacI 酶切位点Y2 5' -GCGTCTAGAGAACGACCAGAGGTGATT-3‘下划线为 XbaI 酶切位点
Y3 5' -CGTCTAGATATTCCCGTGGGCTCTGG-3‘下划线为 XbaI 酶切位点Y4 5' -ACGTTTAAACTCAGCGTCACATCTTCCG-3'下划线为 PmeI 酶切位点PCR产物1 %琼脂糖凝胶电泳，然后用AxyPr印DNA凝胶回收试剂盒割胶回收。回收的上游片断(SEQ ID NO. 2第396 773位碱基)、常规基因敲除质粒pL03 (来自德国的Oliver Lenz博士)经Me I JbaI 37°C双酶切过夜后，上游片断PCR清洁回收(使用AxyPr印PCR清洁回收试剂盒)，质粒1 %琼脂糖凝胶电泳并割胶回收后T4DNA Iigase 4°C连接过夜，转化大肠杆菌S17-1感受态细胞。LB平板(添加25yg/ml的四环素)筛选阳性克隆。筛选所得阳性克隆菌落PCR验证，提取质粒进一步酶切验证并测序。通过验证的克隆提取质粒，命名为PL03-Y1。pL03-Yl (SEQ ID NO. 2 第 1542 2018 位碱基)经 XbaI、PmeI37°C双酶切过夜后进行类似的克隆和验证，构建好的基因敲除载体命名为PL03- Δ Y。2、基因敲除载体pL03-AY转化基因敲除载体pL03- Δ Y采用三亲接合方法导入少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461 和DSM 6314中。三亲接合过程需要三种细菌①含有重组质粒pL03-Δ Y的大肠杆菌供体菌S17-l/pL03- Δ Y (按前述方法获得)；②含有常规辅助质粒pRK2013的大肠杆菌“协助”(helper)菌HB101/pRK2013 (来自中国科学院遗传研究所)；③少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461或者DSM 6314(来自菌种保藏中心DSM)(受体菌)。当三种菌混合时，协助质粒PRK2013游动进入大肠杆菌内，提供游动 (mob)和转移(tra)功能，把供体的重组质粒pL03_ Δ Y转移进入少动鞘氨醇单胞菌内。该系统中重组载体质粒需要带有一个特定的转移起始点(oirT)，以使协助质粒的tra和mob 基因对它起作用，被驱动转移。PL03质粒为四环素抗性，含有蔗糖反向筛选标记sacB基因、 pBR322_origin复制起点和oriT_RP4转移起点。该质粒能够在大肠杆菌中复制，但不能在少动鞘氨醇单胞菌中复制，因此PL03质粒进入少动鞘氨醇单胞菌时，只能经同源同组整合入染色体，和染色体一起复制，而不能以游离形式存在于染色体外。利用PL03质粒的这些特点，将欲敲除基因两侧的同源片断克隆入PL03质粒从而定位pL03质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重组的原理，构建基因缺失菌株。三亲接合具体方法如下所述少动鞘氨醇单胞菌于预培养培养基中30°C、200rpm培养过夜。以10%接种量转接预培养培养基30°C、200rpm培养8h。S17_l/pL03- Δ Y、HB101/pRK2013于加相应抗生素的 LB液体培养基(抗生素添加量四环素25yg/ml、卡那霉素50yg/ml)中37°C培养过夜。 取 S17-l/pL03- Δ Y、HB101/pRK2013 菌液各 2ml 离心收集菌体(3000rpm、5min)；取少动鞘氨醇单胞菌5ml，6000rpm离心5min，弃上清，分别用无菌去离子水洗涤两次，离心。将上述 3种菌合并，用5ml无菌去离子水重悬混勻后用0. 45 μ m孔径直径5cm的滤膜抽滤。滤膜菌体朝上贴在LB平板中，37°C静置培养几后用5ml无菌去离子水将滤膜上的菌体洗下，梯度稀释至合适浓度后涂布含25 μ g/ml链霉素、5 μ g/ml四环素的YM平板。所用的培养基组成如下预培养培养基酵母膏0.2%，牛肉膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl 0.1%，葡萄糖 0.5%，溶剂为蒸馏水，pH7.2 ；YM固体培养基酵母粉0.3%，麦芽粉0.3%，蛋白胨0.5%，葡萄糖1%，琼脂粉 1.5%，溶剂为蒸馏水，pH7.2 ；
注本发明中培养基浓度均指质量体积百分比浓度，某组分浓度表示IOOmL培养基中含有Ig该物质。3、crtY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株的筛选第一次同源重组时，质粒整合入基因组。四环素抗性筛选得到的克隆提取基因组， sacB引物PCR扩增sacB基因鉴定阳性重组子。PCR反应程序为95°C预变性5min进入循环过程；94°C变性30sec，50°C退火30sec，72°C延伸90sec，30个循环，最后以72°C延伸 IOmin0 PCR产物为1151bp片断的为阳性重组子。上述验证引物序列如下sacBsense 5' -CGAACCAAAAGCCATATAAG-3‘sacBanti 5' -AGCGAAGTGTGAGTAAGTAA-3‘第二次同源重组质粒脱离基因组DNA，产生两种交换类型缺失突变菌株(红色) 和野生型菌株(黄色)。第一次同源重组筛选得到的阳性克隆接种入预培养培养基中传代三次，然后涂布在8%蔗糖筛选平板上以筛选第二次同源重组交换体。由于sacB基因编码的蔗糖果聚糖酶能使蔗糖转化为果聚糖。果聚糖对细胞有毒性，在高浓度蔗糖存在下只有丢失sacB基因才能生长。因此能利用高浓度蔗糖可反向筛选得到去除整合敲除质粒的野生型菌株或者缺失突变菌株。筛选得到的第二次交换体影印含有5 μ g/ml四环素的YM平板培养基，以进一步确认第二次交换抗性标记已丢失。随机选择第二次同源重组表型为红色的交换体用TO、Y6为引物I^rimeSTAR HS DNA Polymerase酶(Takara) PCR进一步确认crtY基因是否已敲除。PCR反应程序为95°C预变性5min进入循环过程；98°C变性10sec，59°C退火15sec，72°C延伸2min，30个循环。同时以野生型菌株基因组为模板作PCR对照，电泳结果如图2所示，以野生型菌株基因组为模板的PCR产物为1869bp，而以crtY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌基因组为模板的PCR产物为 1107bp。经此实验证明，表型为红色的确是为crtY基因缺失突变株。Y5 5' -CCAAGATCACCCAGGACC-3‘Y6 5' -CAGCGTCACATCTTCCGA-3‘实施例3 :crtY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌菌株产胶能力的测定1、野生型菌株(Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461)和 crtY 基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌(Δ Yl Δ Y7，其中Δ Yl Δ W来源于少动鞘氨醇单胞菌ATCC 31461， 而Δ TO Δ Υ7则来源于少动鞘氨醇单胞菌DSM 6314)接YM培养基斜面上，30°C培养72h ；2、一级种子培养分别将斜面种子接入50ml —级种子培养基(盛于250ml三角瓶)，于30°C，200rpm振荡培养Mh，即为一级种子液；3、二级种子培养分别将一级种子液以5%体积比的接种量接入IOOml 二级种子培养基(盛于500mL三角瓶)，于30°C，200rpm振荡培养12h，即为二级种子液；4、发酵将二级种子液以5%体积比的接种量接入IOOmL级发酵培养基中(盛于 500mL三角瓶)，于30°C，200rpm振荡发酵48h ；5、分别测定对照(野生型菌株)和crtY基因缺失的少动鞘氨醇单胞菌(Δ Yl ΔΥ7)的发酵液的粘度及出胶率，结果如表1 表1、野生菌株和突变菌株发酵48h出胶率、粘度菌林黏度(cP) 出胶率(％)-Δ -^867-Γ 77
ΔΥ251331.208
Δ 3565Q1.239
ΔΥ455671.245
ΔΥ556171.199ΔΥ657501.187
ΔΥ755671.169
对照51671.178与对照相比，Δ Y菌株出胶率和粘度并没有明显的变化，出胶率相对于对照菌株处于同一水平，因此可以选用Δ Y作为生产菌株，结冷胶产量不会降低，并且可以结冷胶发酵联产番茄红素。所用培养基组成为一级种子培养基酵母膏0. 20% ；牛肉膏0. 30% ；蛋白胨0. 50% ；氯化钾0. 10%， 溶剂为蒸馏水，ΡΗ7.2 ；二级种子培养基葡萄糖1.50% ；酵母膏.0.50% ；蛋白胨0.50% ；磷酸二氢钾 0. 06% ；磷酸氢二钾0. 06% ；硫酸镁0. 06%，溶剂为蒸馏水，ρΗ7· 2 ；发酵培养基葡萄糖3. 00% ；酵母膏0. 05% ；蛋白胨0. 30% ；磷酸二氢钾0. 06% ； 磷酸氢二钾0. 10% ；硫酸镁0. 06% ；溶剂为蒸馏水，ΡΗ7. 2。实施例4 番茄红素环化酶缺失菌株高酰基结冷胶的制备工艺及番茄红素的提取工艺1、发酵液预处理发酵液100L，用10% (ν/ν)的HCl调ρΗ6. 0，升温至60°C，保温 lh；2、蛋白杂质去除降温至40°C时，用10% (W/v)NaOH调pH7.0，加入50g的溶菌酶 (20万U/g，庞博生物)及IOOg的碱性蛋白酶O万U/g，庞博生物)，保温池；3、结冷胶絮凝沉淀，分离及番茄红素提取经过预处理及蛋白去杂处理后的发酵液中加入50L乙醇丙酮溶液(v/v = 2 1 1 2，优选1 1) 40°C避光搅拌提取浊。提取4次之后板框压滤，收集滤液，加入适量BHT。4、结冷胶干燥、粉碎压滤所得纤维料90°C干燥池后粉碎，制得高酰基结冷胶成品，为乳白色粉末，含氮量为0. 05 0. 30%。5、滤液用旋转蒸发仪35°C真空浓缩至500mL，大孔吸附树脂吸附番茄红素，用丙酮对吸附了番茄红素的大孔树脂在常温下洗脱。6、将得到的洗脱液浓缩至一定体积，放入45°C真空干燥箱中干燥，得到番茄红素晶体。7、将得到的番茄红素晶体溶于适量丙酮，过滤重结晶，得到0. 85g番茄红素晶体。 高效液相色谱检测番茄红素纯度为97%。
权利要求
1.少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.)的番茄红素环化酶基因(crtY)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.—种crtY基因缺失的重组少动鞘氨醇单胞菌，由少动鞘氨醇单胞菌经基因敲除去除SEQ ID NO. 1所示的crtY基因序列获得。
3.如权利要求2所述的重组少动鞘氨醇单胞菌，其特征在于所述基因敲除借助SEQID NO. 2所示的核苷酸片断进行。
4.如权利要求1所述的重组少动鞘氨醇单胞菌在微生物发酵制备结冷胶和番茄红素中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种少动鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)的番茄红素环化酶基因(crtY)的DNA序列和该酶缺失的重组菌株及其应用。所述crtY基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的少动鞘氨醇单胞菌番茄红素环化酶基因(crtY)的DNA序列为少动鞘氨醇单胞菌类胡萝卜素生物合成途径进行遗传改造奠定基础。另外，本发明通过基因敲除的方法构建的番茄红素环化酶缺失的少动鞘氨醇单胞菌重组菌株与野生型菌株相比，结冷胶产量基本不变，可以在发酵产结冷胶的同时联产番茄红素。另外，该菌株还可以应用于进一步的基因敲除或代谢工程改造。
文档编号C12N15/60GK102286504SQ20111018474
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月1日 优先权日2011年7月1日
发明者吴雪昌, 朱亮, 李欧 申请人:浙江大学