专利名称：一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法
技术领域：
本发明属于生物工程的动物生物技术，特别是水牛繁殖与定向遗传改良领域。具体是一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法。
背景技术：
转基因动物(Transgenic animal)技术是借助基因工程技术将外源基因导入受体动物基因组内，并在体内稳定表达且外源导入基因能稳定遗传给后代的技术。其主要特点是人类有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传结构，而赋予转基因动物新的表型特征。水牛是我国南方的一种极具开发前景的重要家畜，因其适应性强、耐高温高湿、抗病力强、耐粗饲、容易饲养、使用年限长和乳品营养价值高等特性，而倍受人们关注与重视。 然而，目前我国水牛的品种的产奶量和繁殖率低，制约水牛奶业的发展，急需应用胚胎工程技术对其进行品种改良。与其他转基因技术相比，转基因克隆技术可以在细胞水平上进行遗传操作，实现基因的定点整合和敲除，并能在理论上使转基因的效率达到100%，此外还实现转基因动物的性别控制。因此，转基因克隆技术是一种目前生产转基因动物和改良动物遗传性状最为有效的理想方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法。本发明采用电穿孔法将EGFP基因导入水牛胎儿成纤维细胞中，然后结合体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛胚胎，并结合胚胎移植技术建立一种生产转基因水牛的新方法。本发明通过以下技术方案解决上述技术问题一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，包括如下步骤(1)水牛胎儿成纤维细胞的转染与筛选传代培养至三代的水牛胎儿成纤维细胞使用线性质粒DNA(pCE-EGFP-IRES-ne0)采用电穿孔法进行转染。然后用DMEM+10%胎牛血清+600 μ g/ml G418的培养液筛选培养，6 IOd后，挑取细胞数超过60个的细胞集落扩大培养。获得G418抗性的转EGFP基因细胞，可用于核移植。(2)转基因克隆水牛的生产水牛卵母细胞在体外成熟培养2 后，选择有第一极体的卵母细胞于装有Spindle-view系统的倒置显微镜下进行去核获得受体卵母细胞。供体细胞为转染筛选后且通过接触抑制法培养的水牛胎儿成纤维细胞，经倒置荧光显微镜观察确证表达EGFP后注入到去核的卵母细胞卵周隙中，然后采用安装在显微操作仪上可活动的距离为0. 2mm的两根钼金丝微电极针进行电融合。融合后的核移植重构胚用离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培养池进行化学激活处理，然后置于含颗粒细胞单层的微滴中共培养6 7d。将获得的克隆囊胚在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，筛选出表达EGFP的转基因克降囊胚移植到受体母水牛的子宫角中，受体水牛经妊娠足月后产下犊牛，在紫外灯照射下，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达有EGFP标记基因。本发明的突出优点在于用本发明的方法，成功生产了转基因克隆水牛胚胎，经过胚胎移植后有3头受体水牛获得妊娠到期并产下犊牛4头，其中3头成活，1头死亡，在紫外灯照射下，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达有EGFP标记基因。说明利用本发明可成功生产转基因克隆水牛。
图1是本发明获得的表达EGFP的转基因水牛胎儿成纤维细胞，其中，图A为常光下；图B为荧光灯下。图2是本发明获得的表达有EGFP的水牛转基因克隆囊胚，其中，图A为常光下；图 B为荧光灯下。图3是本发明获得的表达有EGFP的转基因克隆水牛，其中，图A为常光下；图B为荧光灯下。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步说明。本发明所述的利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，包括如下步骤1、水牛胎儿成纤维细胞的转染与筛选将水牛胎儿的耳部以及腹部皮肤组织剪成约0. 5cm2的组织块。用含有青、链霉素的PBS缓冲液多次清洗，放入75%酒精内浸泡约30s，再用含有青、链霉素的PBS缓冲液反复清洗，放于无菌培养皿中，用灭菌眼科剪将皮肤剪碎至2mm3小块，均勻地平铺于皿底。加入10% FBS的DMEM培养液0. 5ml，但要防止组织块飘起来，轻轻移入38. 5°C饱和湿度培养箱中培养4h，待组织块贴壁后，再加入含10% FBS的DMEM培养液，进行原代培养，每隔 3 4d换一次液。待原代细胞长到80 90%汇合时，开始进行细胞传代。先用无Ca2+、Mg2+的PBS 洗两遍，加入含0. 25%胰蛋白酶的Hank’ s液消化3 5min，待细胞变圆时，小心吸出消化液，再加入含10% FBS的DMEM培养液终止消化。弃去皿内组织块，用吸管轻轻吹打使细胞悬浮，收集悬浮液于5ml离心管，采用1200rpm离心5min，重悬液以IX IO6细胞/ml接种于新的培养皿中，放入培养箱中培养。此后每隔4 5d传一代，传代比例为1 3 1 4。传代培养至三代的水牛胎儿成纤维细胞使用线性质粒DNA(pCE-EGFP-IRES-ne0) 使用电穿孔转染。在转染前2 3d，将细胞转接到IOOmm培养皿内，加入适量DMEM+10% FBS置培养箱内培养。转染前池换新鲜培养液，准备转染时用PBS清洗两遍后，加入胰蛋白酶消化并收集细胞。用PBS稀释均勻后计数，制成IO7AiL的细胞悬液转移至内径为0. 4cm 的电击杯中。加入10 μ g线性化质粒混勻，室温放置5min。利用电融合仪按照150V，IOms, Ipulse的参数进行电击，电击后冰上放置5min，随后转移至新的IOOmm培养皿中培养；1 2d后待细胞生长状态恢复，加入600 μ g/ml G418进行抗性细胞筛选。每3 4d换液一次， 同时补加G418。每天观察细胞生长或死亡。6 IOd后，挑取细胞数超过60个的细胞集落扩大培养后用于核移植。2、转基因克隆水牛的制备从屠宰场收集水牛卵巢，置于含有K+、Ca2+、、Na+、Mg2+的；35 37°C生理盐水的保温瓶内，4h内送到实验室，用37°C的生理盐水洗净，剪掉卵巢周围的悬韧带，用带有12号针头的IOml注射器抽取直径为2 6mm的卵泡中卵母细胞。在实体显微镜下挑选出细胞质均勻，并有完整致密卵丘细胞的卵丘卵母细胞复合物，用洗卵液清洗两遍后，放入含1. 5ml水牛体外成熟液(TCM-199+5% 0CS+0. 1 μ g/ml FSH)的 30 X IOmm 玻璃平皿中，在 38. 5°C、5% CO2和最大饱和湿度的培养箱中体外成熟培养22h。选择具有第一极体的水牛卵母细胞，以10 15枚为一组，置于5 μ g/ml细胞松弛素B的操作液微滴中，并覆盖石蜡油。在装有Spindle-view系统的倒置显微镜下找到纺锤体区域。用固定管从第一极体对侧吸住卵母细胞，通过内径20 25 μ m左右的去核针调整位置，使极体以及核处于3 4点之间，吸取第一极体及其下方含有细胞核1/16 1/8的细胞质，去核后的卵母细胞待用于核移植的受体胞质。去核后的卵母细胞放入培养液中在培养箱里培养30min，使其形态恢复。转移到含 0. 聚乙烯醇PVA操作液的液滴中。本发明采用卵周隙注核法，将供核细胞用去核管吸取并沿去核时在透明带留下的切口注入。注核时在倒置荧光显微镜的引导下，挑选表面光滑、 胞质均勻的表达绿色荧光蛋白的细胞为供核细胞。注核时，先吸取少量细胞质，再将细胞质连同供体细胞一起注入卵周隙中，使供体细胞与卵膜紧贴在一起，以便有利于细胞融合。本发明所用的电融合仪为ECM-2001，电极为两根安装在显微操作仪上可活动的距离为0. 2mm的钼金丝，注核后的供体-卵母细胞胞质复合体先在融合液(融合液为 0. 28mol/L 甘露醇 +0. 05mmol/LCaCl2+0. Immo 1 /LMgS04+5mmo 1 /LHepes+0. 1 % BSA+5mg/L 酚红)中平衡2分钟，再移到电极间的100 μ 1融合滴中，用其中一根钼金丝轻轻拨动细胞，使待融合的两质膜平面与电场方向垂直，然后采用电融合参数为100v/mm，15yS，3次电脉冲进行融合。电激后的重组胚移入培养液中，在38. 5°C的培养箱中培养30min，然后在显微镜下检查其融合情况。将融合的重组胚进一步进行激活处理，未融合的重组胚弃之。将融合后的重构胚用5 μ mol/L的离子霉素激活处理5min，然后用2mmol/L的 6- 二甲氨基嘌呤培养池进行激活处理。而后将激活处理后的重构胚置于颗粒细胞单层微滴中，在38. 5°C,5% CO2培养箱中培养。培养液每隔48小时更换一次。水牛转基因克隆重构胎在体外培养6 7d后，将获得的核移植囊胚在倒置荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，挑选表达EGFP的转基因克隆囊胚装入胚胎移植管中，采用非手术法将胚胎移植到受体母牛的子宫角中。3个月后检测受体水牛妊娠情况。其中，3头受体母牛怀孕至足月后分娩，生下4头转基因克隆水牛，其中3头成活。实施例2010年，我们共将72枚新鲜或冷冻/解冻的表达有EGFP基因的水牛转基因克隆囊胚分别移植给36头受体水牛的子宫角中，每头受体牛移植2枚囊胚，其中2010年1月观日、2月5日和4月3日分别移植的3头受体水牛获得妊娠，经过300多天的妊娠足月后， 分别于2010年12月19日产下2头公牛犊，其中一头成活，一头死亡，2011年1月4日和
52011年3月19日分别产下1头公牛犊，在紫外灯照射下，这些转基因克隆水牛头部和四肢明显均表达有EGFP标记基因。这一实施例证明，本发明利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法是可行的。
权利要求
1. 一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)水牛胎儿成纤维细胞的转染与筛选传代培养至三代的水牛胎儿成纤维细胞使用线性质粒DNA(pCE-EGFP-IRES-neo)采用电穿孔法进行转染，然后用DMEM+10 %胎牛血清 +600 μ g/ml G418的培养液筛选培养6 IOd后，挑取细胞数超过60个的细胞集落扩大培养，获得G418抗性的转EGFP基因细胞，(2)转基因克隆水牛的生产水牛卵母细胞在体外成熟培养2 后，选择有第一极体的卵母细胞于装有Spindle-view系统的倒置显微镜下进行去核获得受体卵母细胞，供体细胞为转染筛选后且通过接触抑制法培养的水牛胎儿成纤维细胞，经倒置荧光显微镜观察确证表达EGFP后注入到去核的卵母细胞卵周隙中，然后采用安装在显微操作仪上可活动的距离为0. 2mm的两根钼金丝微电极针进行电融合，融合后的核移植重构胚用离子霉素处理 5min,再用2mmol/L的6- 二甲氨基嘌呤培养池进行化学激活处理，然后置于含颗粒细胞单层的微滴中共培养6 7d，将获得的克隆囊胚在荧光显微镜下观察EGFP的表达情况，筛选出表达EGFP的转基因克隆囊胚移植到受体母水牛的子宫角中，受体水牛经妊娠足月后产下犊牛，在紫外灯照射下，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达有EGFP标记基因。
全文摘要
一种利用体细胞核移植技术生产转基因克隆水牛的方法，是从水牛胎儿分离培养得到水牛胎儿成纤维(BFF)，再将携带新霉素抗性基因和增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的转基因载体(pCE-EGFP-IRES-neo)通过电穿孔法导入BFF，并通过G418筛选获得转EGFP基因的BFF；而后，将转EGFP基因的BFF移植到去核的水牛卵母细胞构建克隆重构胚，经5μmol/L离子霉素处理5min，再用2mmol/L的6-二甲氨基嘌呤培养3h进行化学激活处理后，置于颗粒细胞单层共培养6-7d后获得转基因克隆囊胚。在倒置荧光显微镜下挑选表达EGFP的转基因克隆囊胚移植到受体水牛，经过妊娠足月后分娩获得转基因克隆犊牛。经紫外灯照射，这些转基因克隆水牛犊头部和四肢明显均表达EGFP标记基因，证明用本发明的方法可成功生产转基因克隆水牛。
文档编号C12N15/873GK102250954SQ20111018531
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者刘庆友, 李楠, 李湘萍, 石德顺, 罗婵, 蒋建荣, 陆凤花, 韦英明 申请人:广西大学