专利名称：白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中基因的分子生物学检测方法，特别是涉及白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒。
背景技术：
人类对白血病的识别已逾一个半世纪，造血干、祖细胞由于发生恶性改变，失去进一步分化、成熟的能力，使细胞阻滞在不同的造血阶段，从而导致的一组异质性造血系统恶性肿瘤。白血病是儿童和青少年最常见的一种恶性肿瘤，占据儿童和青少年恶性肿瘤的第一位；我国的年发病率和死亡率约为3-4/10万，在各种肿瘤中居第6位。t(8 ；21) (q22, q22)主要见于急性髓细胞白血病(acutemyeloid leukemia, AML) 患者，约占AML患者的10% -17%,以及极少数继发性AML和治疗相关性AML患者。1999 年世界卫生组织(WHO)提出的造血和淋巴系统疾病最新分型，建议只要检出克隆性重现性细胞遗传学异常 t (8 ；21) (q22 ；q22)或 AML1/ET0，即可诊断为 t (8 ；21)AML。t (8 ；21)是 8q 上的ET0(eight twenty one)基因与21q22上的AMLl基因交互易位，形成AML1/ET0融合基因。目前共有两种AML1/ET0融合基因亚型被发现，但较为常见的是1型，即通常所提的 AMLl/ETO融合基因。AML1/ET0阳性AML患者，约30%的患者出现KIT基因突变，目前研究发现AML1/ET0融合基因患者，若无KIT基因突变，则预后良好；有KIT基因突变者，一般建议进行造血干细胞移植。同时研究发现，对于t(8 ；21)AML患者，若缓解期融合基因数量较之初治时下降3个log值，同时无KIT基因突变，则预后较好，不建议造血干细胞移植。因此，进行AML1/ET0融合基因检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于AML1/ET0融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。利用定量PCR检测白血病患者AML1/ET0融合基因检测，有以下主要功能1.辅助确诊急性非淋巴细胞白血病(ANLL)分型，并初步进行预后评估；2.监测药物的使用效果通过检测骨髓或者外周血中AML1/ET0融合基因，可以初步监测药物治疗的效果；3.微小残留疾病(MRD)的检测。BCR/ABL融合基因见于95 %以上CML患者，也见于20 % -25 %成人ALL和2 % -4% 儿童ALL患者。约6%成人急性髓细胞性白血病(acutemyeloblastic leukemia，AML)、
儿童AML和10%急性混合细胞型白血病(acute mixed lineageleukemia, AMLL)患者中也可检测到Ph染色体和BCR/ABL融合基因，在特发性血小板增多症(essential thrombocythemia，ET)患者中也有Ph的报道。多数Ph AML患者由CML进展而来，对于原发性Ph AML的诊断应注意排除CML病史，原发性的Ph AML少见。CML是一种多潜能造血干细胞恶性克隆性疾病，特征性染色体易位t (9 ；22) (q34 ； qll)形成的BCR/ABL融合基因为其分子基础，由此表达的具有很强酪氨酸激酶活性的BCR/ABL蛋白导致信号传导通路异常是CML发生的根本原因。Ph染色体t (9:22) (q34:qll)，见于95%以上CML患者。其中5% 10%患者表现为变异Ph易位，该易位有3种类型；简单变异易位、复杂变异易位、遮蔽或隐匿的Ph易位。分子生物学研究证实，它们与典型Ph易位有相同的分子病理学基础，即BCR/ABL融合基因。急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是一种异质性疾病， 以原始和幼稚淋巴细胞恶性克隆为主，细胞大量增殖、广泛浸润，抑制正常造血，是基于形态学、免疫表型、细胞遗传学和分子异常的白血病细胞。目前病因尚未完全清楚，根据淋巴细胞类型，可分为急性B淋巴细胞白血病(B-ALL)和急性T细胞白血病(T-ALL)。研究表明约25%的成人ALL和5%儿童ALL都存在Ph染色体，形成BCR/ABL融合基因，从而导致 BCR/ABL融合蛋白产生，它们对于细胞增殖、黏附、凋亡信号的转导有着显著的干扰作用，从而诱发白血病的发生。按BCR基因断裂点的不同，BCR/ABL融合基因表现为ela2、b3a2 (el4a2)、 b2a2 (el3a2)、el9a2、b3a3、ela5、b2a5、b3a5等多种亚型，它们可单独或同时出现，表达 BCR/ABL融合蛋白。由于BCR基因断裂点集中在约5. 8kb的断裂点丛集区(也称M-bcr)内， 绝大多数CML患者BCR/ABL融合基因b2a2和b3a2型，翻译表达为P210，而其余几种亚型相对较为少见。目前对于CML的诊断，除了传统的形态学诊断以及临床特点分析之外，BCR/ ABL融合基因的出现成为该病确诊的金标准。因此及时检测BCR/ABL融合基因，对于CML的诊断、治疗、预后评估等提供直接的理论依据。BCR-ABL阳性的ALL患者，主要见于B-ALL，该类白血病患者往往预后较差，因此，及时检测BCR-ABL融合基因对于ALL患者的诊断，危险度评估，疗效指导等有重要的理论价值。对于ALL患者来说，最为常见的ela2型，表达P190 融合蛋白，参与ALL的发生。目前也有研究报道，不同的BCR/ABL融合基因亚型对白血病的危险度评估提供一定的指导价值。Ela2型BCR/ABL融合基因所表达的P190融合蛋白的酪氨酸激酶活性高于 b2a2/b3a2型BCR/ABL融合基因所表达的P210融合蛋白，因此其治疗方案也不同。另外，不同的BCR/ABL融合基因亚型对格列卫以及传统治疗方案的反应性也不同，目前研究报道， b3a2型BCR/ABL融合基因较之b2a2型BCR/ABL融合基因来说，对格列卫及其传统治疗方案的反应性较差，而且也发生ABL激酶区突变以及疾病进展。因此，进行白血病患者的分子生物学检测是选择靶向治疗策略的首要步骤，也是进行白血病危险度评估以及预后评估的首要步骤；研发一套用于BCR/ABL融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。检测白血病患者BCR/ABL融合基因，有以下主要功能1.辅助确诊CML :95%以上的CML都伴有BCR/ABL融合基因的存在。检测BCR/ABL 融合基因可以为确诊CML提供相对于费城染色体(Ph)更可靠的分子生物学证据；2.检测BCR/ABL融合基因可以指导选择分子靶向治疗药物格列卫BCR/ABL融合基因的产物酪氨酸激酶是分子靶向治疗药物格列卫的作用目标，临床可以根据患者是否存在BCR/ABL融合基因来选择性的使用药物格列卫；3.辅助急性白血病BCR与ABL基因包含多种亚型，通常绝大多数的CML患者为 BCR/ABLb2a2型和b3a2型。而10% -15% ALL患者以及3% -5% AML患者也会出现BCR/ABL融合基因，对于ALL患者来说，主要的BCR/ABL亚型为ela2型和b2a2/b3a2型，而AML 患者，多数由CML急变而来，通常不存在ela2型融合基因，这样临床就可以结合患者的其它体征，更有效地对患者进行鉴别诊断；4.监测药物的使用效果通过检测骨髓或者外周血中BCR/ABL融合基因，可以初步监测药物治疗的效果；5.微小残留疾病(MRD)的检测。急性早幼粒细胞白血病(actue promyelocytic leukemia, APL)是临床上第一个应用诱导分化治疗取得显著疗效的人类恶性肿瘤，是人类从分子水平上认识白血病的一个成功例子。在APL中，染色体易位使得17号染色体的RARA基因上，即导致维甲酸受体与位于其它染色体上的配偶基因发生融合，并表达相应的融合蛋白。PML/RARA融合基因是由于 15号染色体的PML基因与位于17号染色体上的RARA基因发生易位而形成。该融合蛋白具有不同于正常RARA等位基因编码的野生型维甲酸受体的功能，可阻断粒细胞的分化成熟， 导致APL发生，是治疗的靶向基因。研究认为，17号染色体的断裂点主要是位于RARA基因的第2内含子，而15号染色体的断裂点则可能在PML基因的3个可能区域，即第6内含子， 第3内含子和第6外显子。因断裂点的不同所形成的PML/RARa融合基因相应的可分为长型(L)、短型⑶和变异型(V)。因此，L型是PML基因的第6外显子与RARA基因的第3外显子融合而成，S型则为PML基因的第3外显子与RARA基因第3外显子融合而成，V型是 PML基因的第6外显子的可变区与RARA基因第3外显子融合的产物。通常PML/RARA融合基因L型出现在50 % -60 %的APL患者，S型出现在20 % -30 % 的APL患者，而V型则较为少见。研究发现L型APL患者通常对维甲酸的反应性较好，而仅仅只有部分S型患者对维甲酸的反应性较好，一般V型APL患者对维甲酸的反应性相对较差。此外研究发现规范化定量检测PML/RARA融合基因，对于疗效评估有一定意义。因此，进行PML/RARA融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于PML/RARA融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。检测白血病患者PML/RARA融合基因，有以下主要功能1.辅助确诊ANLL-M3型90%左右的ANLL-M3都伴有PML/RARA融合基因的存在， 检测PML/RARA融合基因可以为确诊ANLL-M3提供更可靠的分子生物学证据；2.检测PML/RARA融合基因可以指导选择分子靶向治疗药物维甲酸；3.监测药物的使用效果通过检测骨髓或者外周血中PML/RARA融合基因，可以初步监测药物治疗的效果；4.微小残留疾病(MRD)的检测。CBF β-MYHll 融合基因由 inv (16) (pl3 ；q22)及 t(16 ； 16) (pl3 ；q22)染色体易位形成，见于90%以上的M4E0和10%不伴异常嗜酸细胞M4，少见于M2。CBF β-MYHll具有多种变异型，其中最常见的为A型，占80%。具有CBF β-MYHll的患者对化疗敏感，预后较好。RT-PCR检测CBF β -MYHl 1进行MRD监测显示大部分患者在完全缓解时CBF β -MYHl 1 转阴性。因此，进行CBF β-MYHll融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于CBF β-MYHll融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。E2A-PBX1融合基因由t(l ；19) (q23 ；pl3)染色体易位形成，见于3_5 %的儿童和 3 %的成人ALL患者，约占儿童前驱B细胞ALL (precursor-B ALL)患者的25 %，和胞浆免疫球蛋白(Ig)P链表达密切相关。过去的研究认为，E2A-PBX1阳性的患者对化疗反应差，并且只能获得短期缓解，但是最近的一些研究认为提高化疗强度后该亚型ALL患者可有较好的治疗反应。E2A-PBX1阳性的儿童ALL病例初诊时白细胞计数较高，使用强化疗方案后， EFSs现已接近80%。因此，进行E2A-PBX1融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于E2A-PBX1融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。MLL-AF4融合基因由t(4 ;11) (q21 ；q23)染色体易位形成，在婴儿ALL中最多见， 为50 70%，而在儿童和成人中较低，分别为2%和3 6%。MLL-AF4阳性的患者63%同时有CD15表达。由于MLL基因和AF4基因的断裂位点都有多个，可形成多种不同的MLL-AF4 融合基因剪切体。此类患者发病年龄低(通常<2岁)，白细胞计数高，常伴有肝、脾、淋巴结肿大并累及中枢神经系统。不论成人还是儿童，MLL-AF4阳性的患者病情凶险，预后差。因此，进行MLL-AF4融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于MLL-AF4融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。SIL-TALl融合基因是染色体1ρ32缺失时由TALl基因和其上游的SIL基因融合形成的融合基因，该融合基因见于16% 26%的T-ALL患者。该融合基因仅见于T-ALL，是 T-ALL的一个有用的克隆标志。因染色体缺失的序列较短(90-100kb)，常规细胞遗传学方法检测不到这一异常，需要用FISH或RT-PCR方法进行检测。因此，进行SIL-TALl融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于SIL-TALl融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。TEL-AMLl融合基因由t (12 ;21) (pl3 ;q22)染色体易位形成，见于25 %的儿童 B-ALL患者，是儿童B-ALL中最常见的分子异常。此类患者发病年龄小(2 10岁)，WBC计数低(< 50000/L)，免疫表型为前驱B-ALL。TEL基因重排是独立预后因素，此类患者对治疗反应佳，完全缓解时间长，预后好。由于12p和21q末端在常规显带时很相似，因此常规细胞遗传学方法检出率仅0. 05%，需应用FISH或RT-PCR方法提高检测阳性率。因此，进行TEL-AMLl融合基因以及亚型的检测，对于治疗方案选择以及疗效评估有一定的理论指导意义。研发一套用于TEL-AMLl融合基因的检测方法及试剂盒，既可以为临床实验室检测提供服务，也可以应用于科学研究以及病例统计分析。聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一种利用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术，可检出微量靶序列(甚至少到1个拷贝)。在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，可扩增至100万-200万份拷贝。PCR反应分三步变性、退火及延伸。以上三步为一循环，每一循环的产物作为下一个的模板，这样经过多个循环，可得到大量复制的特异性DNA片段。
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。TaqMan荧光探针PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR 扩增时，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成， 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。MGB探针技术是在TaqMan探针发展起来的一种新技术，TaqMan探针的3'端结合上MGB (minor groove binger)，MGB即DNA小沟结合物，是源于某些抗菌素分子的化学基团，其能嵌入DNA双螺旋结构中的小沟形成非共价结合，有效提高探针的退火温度，即在相同Tm值的普通寡聚核苷酸探针具有较少核苷酸单体，从而使单个碱基突变更敏感地干扰不匹配的探针与等位基因间的退火，降低不匹配的探针与等位基因间的交叉反应，更有效地检测出匹配的探针与等位基因间的结合。本发明提供了一种白血病融合基因的TaqMan-MGB实时荧光PCR检测方法，以解决目前白血病融合基因检测方法特异性和灵敏度不高、费时费力的问题。
发明内容
本发明提供了用于对白血病融合基因进行实时荧光PCR检测的引物和 TaqMan-MGB 探针。本发明所提供的引物和TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如下1)用于检测AML 1-ET0基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示；2)用于检测BCR-ABL190和BCR-ABL210基因的上游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 6 所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 7所示；3)用于检测 CBFb-MYHl 1 (A)、CBFb-MYHl 1 (D)和 CBFb-MYHl 1 (E)基因的上游弓丨物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :8所示，下游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO 12 所示；4)用于检测E2A-PBX1基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :13所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 14所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 15所示；5)用于检测MLL-AF4基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :16或 SEQ ID NO :17所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 18所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 19所示；
6)用于检测 PML-RARa (bcrl)、PML-RARa (bcr2)和 PML-RARa (bcr2)基因的上游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:23所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 24所示；7)用于检测SIL-TALl基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :25所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 26所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 27所示；8)用于检测TEL-AMLl基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :28所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 29所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 30所示。为方便检测，所述引物和TaqMan-MGB探针中还包括用于检测ABLl内参基因的引物和TaqMan-MGB探针，上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :31所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :32所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 33 所示。所述TaqMan-MGB探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团(Importer，R)， 如FAM、VIC等，3，端标记的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non-Fluorescent Quencher), 本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10°C左右，因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。实验证明，TaqMan MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。本发明的第二个目的是提供一种灵敏度较高、结果准确可靠的白血病融合基因的 TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法。本发明所提供检测方法，是以本发明的引物和TaqMan-MGB探针进行的 TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法，具体方法包括以下步骤1)提取受试者骨髓、外周血或组织的RNA ；2)将步骤1)提取的RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在所述引物和 TaqMan-MGB探针的引导下进行实时荧光PCR扩增；3)根据荧光信号的变化，定性检测受试者标本中白血病融合基因的RNA，出现荧光扩增曲线表明含有相应的白血病融合基因，未出现荧光扩增曲线表明样本不含有相应的白血病融合基因。在上述检测方法中，所述步骤2)中20μ L实时荧光PCR反应体系可包括 样品cDNA 2 μ L(10ng-40ng)，预混合液18 μ L ；所述预混合液包括TaqMan-MGB探针 1 μ L(l. 25uM)，上游引物 1-3 μ L(2. 5-7. 5uM)，下游引物 1-3 μ L(2. 5-7. 5uM)，PCR 的 Universal Master Mix (2X) 10μ RNA Sl/jC 1-5 μ L。所述步骤2)中的实时荧光PCR反应条件可为先防污染50°C 2min ；然后预变性 950C IOmin ；最后扩增95°C 15sec，60°C 60sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。此外，为验证检测结果的正确性，所述步骤2)中还包括对ABLl内参基因进行 TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的步骤。
本发明的第三个目的是提供一种用于对白血病融合基因进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的试剂盒。本发明所提供的试剂盒，包括上述用于对白血病融合基因进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的引物和TaqMan-MGB探针。为方便检测，所述试剂盒还包括携带有ABLl基因的阳性对照质粒和阴性对照品 (如H2O或空载质粒)。本发明提供了一种白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物和TaqMan-MGB探针。该方法是以待检样品中的白血病融合基因(AML1-ET0、 BCR-ABL190 或 210、CBFb-MYHlI(A)(D)或(E)、E2A_PBX1、MLL-AF4、PML-RARa(bcrl)(bcr2) 或(bcr3)、SIL-TALl和TEL-AML1)为检测对象，准确度及精密度均较好。本发明具有以下优点1、首次建立了白血病融合基因的TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测方法，利用此检测方法可以快速地对待测样本中的多种白血病融合基因同时进行检测，使用TaqMan-MGB 分子可以使探针的长度缩短，提高配对与非配对模板间的Tm值差异，此外，由于在探针的 3’端的淬灭荧光基团为不发光的荧光基团，淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰，并且与报告荧光基团在空间的位置更接近，使杂交的稳定性和重复性大大提高，检测结果更精确、分辨率更高。2、本检测方法与白血病融合基因的其它常规检测方法如普通PCR和基于普通 TaqMan探针的实时荧光定量PCR相比，灵敏度(最低检测浓度达到0. 01 %，S卩10000个细胞中有1个白血病细胞就能够被检测出)和特异性极高，检测效率(可达100% )得到了很大的提高，并且有效地防止了污染。3、本检测方法具有操作程序简单易用的特点，并可进一步制成检测试剂盒，可同时检测携带不同白血病融合基因的多个样本，使用时只需将含有不同样本的不同的反应体系添加到排管中一次扩增完成，操作程序化，省时省力，适合大面积推广和应用。4、本检测方法不仅能够评价人的白血病融合基因及其亚型，同时也为白血病的致病机理等相关领域的研究提供了依据。综上所述，本发明能快速、准确地检测出白血病融合基因，对保障人类健康和人民用药安全意义重大。本发明的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(骨髓、外周血或组织等)中白血病融合基因的定性、定量检测，应用前景广阔。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图IA-图II为用本发明的白血病融合基因的TaqMan-MGB实时荧光PCR检测方法检测临床样本的结果。
具体实施例方式下述实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook J.等人所编《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。所用引物由英杰公司合成，所有序列测定工作均由英杰公司完成。实施例1、用于对白血病融合基因进行实时荧光PCR检测的引物和TaqMan-MGB探针的设计及筛选根据白血病融合基因AML 1-ET0、BCR-ABL190, BCR-ABL210、CBFb-MYHll (A)、 CBFb-MYHll (D)、CBFb-MYHll (E)、E2A-PBX1、MLL-AF4、PML-RARa (bcrl)、PML-RARa (bcr2)、 PML-RARa (bcr3) ,SIL-TALl和TEL-AMLl的保守区设计用于对其进行TaciMan-MGB实时荧光 PCR检测的引物和探针，其中探针的5’端荧光标记有报告发光基团FAM，3’端标记有非荧光淬灭基团NFQ，同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团。引物/探针的筛选原则为在目的保守区中选择PCR扩增效率和探针结合效率较高的引物和探针作为候选引物和探针。经筛选，得到本发明的引物及TaqMan-MGB探针，具体序列如下检测AML 1-ET0基因的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(AML1-ET0-F) :5，-GTCGCCACCTACCACAGAGCC_3，(序列表中 SEQ ID NO: 1)；下游引物(AML1-ET0-R) :5，-TTCACATCCACAGGTGAGTCTG-3，(序列表中 SEQ ID NO 2)；TaciMan-MGB 探针(AML l-ETO-P) 5，FAM-CGAAATCGTACTGAGAAGC-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 3)。检测 BCR-ABL190 和 BCR-ABL210 基因的引物及 TaciMan-MGB 探针上游引物(BCR-ABL190-F)5，-CTGGCCCAACGATGGCGA-3，(序列表中 SEQ ID N0: 4)；上游引物(BCR-ABL210-F) 5，-CAGCATTCCGCTGACCATCAA-3，(序列表中 SEQ ID NO 5)；下游引物(BCR-ABL-R):5，-GAGCGGCTTCACTCAGACC_3，(序列表中 SEQ ID NO 6)；TaciMan-MGB 探针(BCR-ABL-P) 5，FAM-AGCGGCCAGTAGCATCTGA-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 7)。检测CBFb-MYHll (A)，(D)和(E)基因的引物及 TaqMan-MGB 探针上游引物(CBFb-MYHIl(ADE) -F) 5，-GGATGCATTAGCACAACAGGCC-3，(序列表中 SEQ ID NO 8)；下游引物(CBFb-MYHll(A)-R):5，-AGGGCCCGCTTGGACTT_3，(序列表中 SEQ ID N0: 9)；下游引物(CBFb-MYHll(D)-R):5，-CCTCGTTAAGCATCCCTGTGA_3，(序列表中 SEQ ID NO 10)；下游引物(CBFb-MYHll(E)-R):5，-CTCTTTCTCCAGCGTCTGCTTAT-3，(序列表中 SEQ ID NO 11)；TaciMan-MGB 探针(CBFb-MYH Il(ADE) -Τ) 5，FAM-TCGCGTGTCCTTCTCCG-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO :12)。检测E2A-PBX1基因的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(E2A-PBX1-F) 5，-CCTCATGCACAACCACGCG-3，(序列表中 SEQ ID N0: 13)；
下游引物(E2A-PBX1-R):5，-CTCCTGGGCTCCTCGGATACT-3，(序列表中 SEQ ID NO 14)；TaciMan-MGB 探针(E2A-PBX 1-T) :5，FAM-CCCTGACCTGTCTCGGC-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 15)。检测MLL-AF4基因的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(MLL-AF4-F1) :5，-CCCGCCCAAGTATCCCTGTAAAACA_3，(序列表中 SEQ ID NO 16)上游引物(MLL-AF4-F2) 5，-AGTCCACAGGATCAGAGTGGACT-3，(序列表中 SEQ ID NO 17)下游引物(MLL-AF4-R)5，-AAACTTGGATGGCTCAGCTGT-3，(序列表中 SEQ ID NO: 18) ；TaciMan-MGB 探针(MLL-AF4-T) :5，FAM-CCGCCTCCTTTGACAGC-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 19)。检测PML-RARa(bcrl，bcr2, bcr3)基因的引物及 TaciMan-MGB 探针上游引物(PML-RARa(bcrl)-Fl)5，-CTGCCCAACAGCAACCACGT-3，(序列表中 SEQ ID NO 20)；上游引物(PML-RARa(bcr2)-F2)5，-ACCCCACCTGGATGGACC-3，(序列表中 SEQ ID NO 21)；上游引物(PML-RARa(bcr3)-F3) :5，-GCTTCGACGAGTTCAAGGT_3，(序列表中 SEQ ID NO 22)；下游引物(PML-RARa-R):5，-AAGCAAGGCTTGTAGATGCGG-3，(序列表中 SEQ ID NO 23)；TaciMan-MGB 探针(PML-RARa-T) :5，FAM-AAGCAAGGCTTGTAGAT-NFQ-MGB3，(序列表中 SEQ ID NO 24)。检测SIL-TALl基因的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(SIL-TAL1-F) 5，-CTACCCTGCAAACAGACCT-3，(序列表中 SEQ ID NO:
25)；下游引物(SIL-TALl-R)5，-GGAAGCCGAGGAAGAGGAT-3，(序列表中 SEQ ID NO:
26)；TaciMan-MGB 探针(SIL-TAL1-T) 5，FAM-AGCTCCGCGGAAGTTG-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 27)。检测TEL-AMLl基因的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(TEL-AMLl-F)5，-GCCTGAAGAGCACGCCATG-3，(序列表中 SEQ ID NO: 28)；下游引物(TEL-AMLl-R):5，-GCGGCGGCTCGTGCTG-3，(序列表中 SEQ ID NO 29)；TaciMan-MGB 探针(TEL-AML 1-T) 5，FAM-CTGCTATTCTCCCAATG-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 30)。检测ABLl基因(内参基因)的引物及TaqMan-MGB探针上游引物(ABL1-F) :5，-CTCCATTATCCAGCCCCAAA_3，(序列表中 SEQ ID NO 31)；下游引物(ABL1-R) :5，-CCCAGCTTGTGCTTCATGGT_3，(序列表中 SEQ ID NO 32)；
TaciMan-MGB 探针(TEL-ABL 1-T) 5，FAM-CGCAACAAGCCCA-NFQ-MGB 3，(序列表中 SEQ ID NO 33)。实施例2、白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测用本发明的白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测方法检测 13份临床样本，具体方法包括以下步骤1)提取13份确诊的白血病病人(已知分别携带AML 1-ET0、BCR-ABL190, BCR-ABL210、CBFb-MYHl 1 (A)、CBFb-MYHl 1 (D)、CBFb-MYHl 1 (E)、E2A-PBX1、MLL-AF4、 PML-RARa (bcrl)、PML-RARa (bcr2)、PML-RARa (bcr3)、SIL-TALl 禾口 TEL—AML1 基因)及 1 份健康人受试者(对照)的外周血标本(骨髓或组织也可)的RNA及1份健康人受试者外周血的RNA。2)将步骤1)提取的受试者外周血的RNA反转录成cDNA，20ul反转录体系为(所有试剂均购自Promega公司):RNA 4ul (400ng)，反转录预混合液5. 75ul (MMLVO. 5ul,MMLV 反应缓冲液4ul，RNA酶抑制剂0. 25ul,dNTP混合液0. 5ul，随机引物0. 5ul)，用无核酸酶水补充反应体系至20ul ；反转录条件为37°C 120min，10°C保存。3)以步骤2)合成的cDNA为模板，在实施例1中与模板所携带的白血病融合基因相对应的引物和TaqMan-MGB探针的引导下进行荧光PCR扩增，以ABLl作为内参基因 (模板用携带有ABL基因的阳性对照质粒，100000拷贝数，构建方法为由上海英杰公司合成ABL基因序列，并克隆至pGEM-T Easy载体(购自Promega公司)多克隆位点的NoT I和EcoR I酶切位点之间，得到重组载体p-ABL)，每份样本重复平行检测3次，20 μ L检测反应体系为样品cDNA 2 μ L (10ng-40ng)，TaqMan-MGB探针1 μ L (1. 25uM)，上游引物 1-3 μ L(2. 5-7. 5uM)，下游引物 1-3 μ L(2. 5-7. 5uM),PCR 的 Universal Master Mix(2X，购自ABI公司)10 μ L，补充无RNA酶水至20 μ L ；检测反应条件为先防污染50°C 2min ；然后预变性95°C IOmin ；最后扩增95°C 15sec,60°C 60sec，共40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。所有样本的检测用排管一次完成。4)根据荧光信号的变化，定性检测受试者标本中白血病融合基因的RNA。结果如图IA-图II所示(图IA为AML 1-ET0阳性样本和内参基因的扩增曲线， 图IB为BCR-ABL阳性样本和内参基因的扩增曲线，图IC为CBFb-MYHll阳性样本和内参基因的扩增曲线，图ID为E2A-PBX1阳性样本和内参基因的扩增曲线，图IE为MLL-AF4阳性样本和内参基因的扩增曲线，图IF为PML-RARa阳性样本和内参基因的扩增曲线，图IG为 SIL-TALl阳性样本和内参基因的扩增曲线，图IH为TEL-AMLl阳性样本和内参基因的扩增曲线，图II为健康人样本的扩增曲线)，以确诊的携带不同融合基因白血病病人的外周血标本cDNA为模板用本发明各融合基因相应的引物和TaqMan-MGB探针进行实时荧光PCR检测均出现了目的荧光扩增曲线，以其余1份健康人样本的DNA为模板时，均无扩增曲线，用内参基因的引物和TaqMan-MGB探针对内参模板进行检测也出现了目的荧光扩增曲线，与预期结果相符。检测结果表明，本发明的引物及探针可用于白血病融合基因的TaqMan-MGB 探针实时荧光PCR检测。实施例3、白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测试剂盒的制备本发明用于对白血病融合基因进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的反应液(预混合液)由以下组分组成上游引物1-3 μ L (2. 5-7. 5uM)，下游引物1-3 μ L (2. 5-7. 5uM)，TaqMan-MGB 探针 1 μ L (1. 25uM)，PCR 的 Universal Master Mix (2 X， 购自ABI公司)10 μ L，用无核酸酶水补足至18 μ L。具体来讲，本发明的试剂盒包括以下组份(1)反转录体系，成份如下
试剂公司化π 见亏体积(20ul*20)丽LVPromegaΜ17050. 5ul*20MMLV反应缓冲液PromegaΜ17054ul*20RNA酶抑制剂PromegaΝ26150.25ul*20无核酸酶水QIAGEN12911210.25ul*20dNTP混合液PromegaC1141S0.5ul*20随机引物PromegaC11810.5ul*20样本RNA4ul*20(2) AML 1-ΕΤ0预混合液，成份如下
试剂公司化π 见亏体积(l8ul*2〇)Universal master mixABI430443710*20 = 200AMLl-ETO-FABI-lul/2. 5uMAMLl-ETO-RABI-lul/2.5uMAMLl-ETO-PABI-lul/1. 25uM无核酸酶水QIAGEN1291125*20 = 100 (3) BCR-ABL预混合液，成份如下
试剂公司化π 见亏体积(l8ul*2〇)Universal master mixABI430443710*20 = 200BCR-ABL-F 1ABI-lul/2. 5uMBCR-ABL-F2ABI-lul/2.5uMBCR-ABL-RABI-lul/1. 25uMBCR-ABL-PABI-lul/1. 25uM无核酸酶水QIAGEN1291124*20 = 100(4) CBFb-MYHl 1预混合液，成份如下
试剂公司化π 见亏体积(l8ul*2〇)Universal master mixABI430443710*20 = 200CBFb-MYHll-FABI-lul/2. 5uMCBFb-MYHll(A)-RABI-lul/2.5uMCBFb-MYHll(D)-RABI-lul/2. 5uMCBFb-MYHll(E)-RABI-lul/2. 5uMCBFb-MYHll-PABI-lul/1. 25uM无核酸酶水QIAGEN1291123*20 = 100(5) Ε2Α-ΡΒΧ1预混合液，成份如下
试剂公司化π 见亏体积(l8ul*2〇)Universal master mixABI430443710*20 = 200E2A-PBX1-FABI-lul/2. 5uME2A-PBX1-RABI-lul/2.5uME2A-PBX1-PABI-lul/1. 25uM
权利要求
1.用于对常见的白血病融合基因进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的引物和 TaqMan-MGB探针，其核苷酸序列如下1)用于检测AML1-ET0基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:1所示， 下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :2所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 3所示；2)用于检测BCR-ABL190和BCR-ABL210基因的上游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :4和SEQ ID NO :5所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :6所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 7所示；3)用于检测CBFb-MYHll(A)、CBFb-MYHll (D)和CBFb-MYHll (E)基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :8所示，下游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO 9,SEQ ID N0:10iPSEQ ID NO 11所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 12所示；4)用于检测E2A-PBX1基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQID N0:13所示， 下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:14所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 15所示；5)用于检测MLL-AF4基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQID NO :16或SEQ ID NO :17所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:18所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 19所示；6)用于检测PML-RARa(bcrl)、PML-RARa(bcr2)和 PML-RARa(bcr2)基因的上游引物的核苷酸序列分别如序列表中SEQ ID NO :20、SEQ ID NO 21和SEQ ID NO 22所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:23所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中 SEQ ID NO 24 所示；7)用于检测SIL-TALl基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQID NO 25所示， 下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:26所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 27所示；8)用于检测TEL-AMLl基因的上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQID N0:28所示， 下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:29所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 30所示。
2.根据权利要求1所述的引物和TaqMan-MGB探针，其特征在于还包括用于检测ABLl 内参基因的引物和TaqMan-MGB探针，上游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO :31所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 32所示，TaqMan-MGB探针的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO 33所示。
3.根据权利要求1或2所述的引物和TaqMan-MGB探针，其特征在于所述TaqMan-MGB 探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告基团，3’端标记有非荧光淬灭基团，同时探针上还连接有MGB修饰基团。
4.一种用权利要求1或2所述的引物和TaqMan-MGB探针进行的白血病融合基因的 TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法，包括以下步骤1)提取受试者骨髓、外周血或组织的RNA；2)将步骤1)提取的RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，在所述引物和TaqMan-MGB探针的引导下进行实时荧光PCR扩增；3)根据荧光信号的变化，定性检测受试者标本中白血病融合基因的RNA，出现荧光扩增曲线表明样本含有相应的白血病融合基因，未出现荧光扩增曲线表明不含相应的白血病融合基因。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述步骤2)中20yL荧光定量PCR反应体系包括样品cDNA 2 μ L(10ng-40ng)，预混合液18 μ L ；所述预混合液包括TaqMan-MGB探针1 μ L (1. 25uM)，上游引物1_3 μ L (2. 5-7. 5uM)，下游引物 1-3 μ L (2. 5-7. 5uM)，PCR 的 Universal Master Mix (2 X) 10 μ L，无 RNA 酶水 1-5 μ L。
6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述步骤2)中荧光定量PCR反应条件为先防污染50°C 2min ；然后预变性95°C IOmin ；最后扩增95°C 15sec,60°C 60sec，共 40个循环，在每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于所述步骤2)中还包括用权利要求2 所述的引物和TaqMan-MGB探针对ABLl内参基因进行TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测的步骤。
8.一种包括权利要求1或2或3所述引物和TaqMan-MGB探针的白血病融合基因的 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测试剂盒。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括携带有ABLl基因的阳性对照质粒和阴性对照品。
全文摘要
本发明公开了一种白血病融合基因的TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测方法及其专用引物、探针与试剂盒。本发明的方法是以待检样品中的白血病融合基因(AML1-ETO、BCR-ABL190、BCR-ABL210、CBFb-MYH11(A)、CBFb-MYH11(D)、CBFb-MYH11(E)、E2A-PBX1、MLL-AF4、PML-RARa(bcr1)、PML-RARa(bcr2)、PML-RARa(bcr3)、SIL-TAL1和TEL-AML1)为检测对象，准确度及精密度均较好。利用本发明试剂盒检测白血病患者8种融合基因特异性好，可达100％；灵敏度高，达到0.01％，即10000个细胞中有1个白血病细胞就能够被检测出。本发明的试剂盒对于白血病的诊断可提供直接的理论依据，并为疗效观察、预后判断、微小残留病检测等提供有力手段，而且，操作简便、稳定性好，具有深远的临床意义和推广性。本发明的检测方法及试剂盒可用于多种临床样本(骨髓、外周血或组织等)中白血病融合基因的定性检测，应用前景广阔。
文档编号C12Q1/68GK102251031SQ20111018492
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年6月30日
发明者吴赓, 徐玉现, 毛吉扬 申请人:北京思尔成生物技术有限公司