专利名称：融合蛋白GPR174-Gi1α及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种融合蛋白GPR174-Gil α及其编码基因和应用。
背景技术：
G蛋白(G-protein)是一种在细胞内信号传导途径中起着重要作用的GTP结合蛋白，由α，β，Y三个不同亚基组成。G蛋白具有GTP酶活性，有α，β，Υ三聚体G蛋白、低分子量的单体小G蛋白和高分子量的其他G蛋白三类。G蛋白偶联受体(G-protein coupled receptor),是一种与三聚体G蛋白偶联的 细胞表面受体，含有7个穿膜区，是迄今发现的最大的受体超家族，其成员有1000多个。G蛋白偶联受体与配体结合后通过激活所偶联的G蛋白，启动不同的信号转导通路并导致各种生物效应。G蛋白偶联受体与其配基-激素、神经递质和细胞激素等相互作用，并且充当促进或关闭一很多功能生物过程的分子开关。G蛋白偶联受体在血压调节、炎症和心理疾病等多种疾病中扮演关键角色。现代新药研究与开发的关键首先是寻找、确定和制备药物筛选靶-分子药靶。药物靶点是指药物在体内的作用结合位点，包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子。选择确定新颖的有效药靶是新药开发的首要任务。迄今已发现作为治疗药物靶点的总数约500个，而G-蛋白偶联的受体(GPCR)靶点占其中受体的绝大多数。高通量药物筛选是开发药物早期阶段的最重要工具之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种融合蛋白GPR174_Gil α及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列I衍生的蛋白质。为了使(a)中的蛋白质便于纯化，可在(a)的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列
标签__残基__序歹Li_
-Poly-Arg_5-6(通常为 5 个) _RRRRR 一
-Poly-His_2-10(通常为 6 个)IhHHHH 一
.flag~8Iykddddk —
.Str印-tag II ~8~SHPQFEK —
c-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得
至IJ。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个
或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表I所示的标签的编码序列得到。编码所述蛋白的基因也属于本发明的保护范围。所述基因具体可为如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表中序列2自5’末端I至2061位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列2所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有G蛋白抗原活性 的蛋白的DNA分子。含有所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞(转基因细胞系)或重组菌均属于本发明的范围。可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于所述蛋白进行纯化，可对所用重组表达载体进行加工,如加入亲和标签等。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pFASTBacl质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述重组表达载体还可为将所述重组质粒导入大肠杆菌DHlOBac菌株，通过菌内重组得到的含有所述基因的杆状病毒质粒。本发明还保护一种制备所述蛋白的方法，包括如下步骤(I)将所述杆状病毒质粒转染昆虫细胞，培养后收集上清，即为Pl代病毒液；(2)将所述Pl代病毒液感染昆虫细胞，培养后得到所述蛋白。所述步骤(I)和/或所述步骤(2)中，所述昆虫细胞具体可为sf9细胞。所述步骤(2)中，所述感染的感染剂量具体可为MOI = 5，所述培养的培养时间具体可为72h。所述步骤(I)中，所述培养的培养时间具体可为72小时。本发明还保护一种表达所述蛋白的试剂盒，包括大肠杆菌DHlOBac菌株、昆虫细胞和含有所述基因的重组表达载体。所述重组表达载体具体可为将所述基因插入pFASTBacl质粒的多克隆位点得到的重组质粒。所述昆虫细胞具体可为sf9细胞。所述蛋白可用于药物筛选。本发明提供的融合蛋白GPR174_Gila可以被Gil α蛋白的特异性抗体识别，说明融合蛋白具有良好的抗原活性和应有的高级结构。单独的6 町74或611(!蛋白脱离了生命状态(活细胞环境)是无法结合在一起的，需要借助细胞内环境，才能结合成为被Gil a蛋白特异性抗体识别的蛋白复合物。而本发明提供的融合蛋白，脱离了生命状态(活细胞环境)即具有Gil a蛋白的抗原活性，可以作为体外筛选系统，对候选的作为药物的化合物或小分子进行筛选(考察其能否与融合蛋白结合)。
图I为pFASTBacl质粒的结构示意图。图2为Gila蛋白的编码基因和GPR174蛋白的编码基因的PCR扩增产物电泳图；1:DNA Marker D2000 (2000，1000，750，500，250，100) ；2 Gil α 蛋白的编码基因(约1065bp) ；5 GPR174 蛋白的编码基因(约 1002bp)。图3为融合蛋白GPR174_Gil α的编码基因的PCR扩增产物电泳图；1 DNA Marker D2000 (2000,1000,750,500,250,100) ;2 :融合蛋白 GPR174_Gil α 的编码基因。图4为在LB平板上通过蓝白斑筛选含有重组杆粒pBacmid-GPR174_Gil α的阳性克隆的照片。图5为重组杆粒pBacmid-GPR174_Gil α的PCR鉴定电泳图；I DNAMarkerD15000 (15000,10000，7500，5000，2500，1000) ；4 :重组杆粒 pBacmid-GPR174_Gil α的PCR扩增产物。图6为sf9细胞转染Pl代病毒液后的形态；1 :正常sf9细胞(阴性对照);2 :转染Pl代病毒液72h后的Sf9细胞。图7为实施例2中GPR174_Gil α融合蛋白的Western-blot检测结果。图8为不同感染剂量条件下膜总蛋白(含GPR174_Gila融合蛋白)Western-blot检测结果；1 M0I = I ；2 M0I = 2 ；3 M0I = 5 ；4 M0I = 10 ；5 :正常 sf9 细胞。图9为不同感染时间条件膜总蛋白(含GPR174_Gil α融合蛋白)Western-blot检测结果；1 24h ；2 48h ；3 72h ；4 :96h。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为白常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。总DNA提取试剂TRIzol :Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒TaKaRa公司。新生小牛血清GIBC0-BRL公司。TransFast TM转染试剂Promega公司。IPTG :北京欣经科生物技术公司。多功能DNA纯化回收试剂盒博迈德公司。sf900II培养液GIBC0-BRL公司。抗Gila蛋白多克隆抗体Ga i-l/2/3(N-20) :SANTACRUZ公司。辣根酶标记的兔抗山羊二抗中杉金桥生物技术有限公司。Super ECL Plus超敏发光液普利莱基因技术有限公司。pMD18-T 载体TaKaRa 公司。pFASTBacl 质粒Invitrogen 公司，产品目录号10359_016。HepG2 细胞ATCC 产品，编号HB8065。sf9 细胞ATCC 产品，编号CRL_1711。大肠杆菌(E. coli) DHlOBac菌株大肠杆菌(E. coli) DHlOBac菌株为商购菌株,本身含有杆状病毒穿梭杆粒(Bacmid)和辅助质粒；Invitrogen公司，产品目录号10361012。实施例I、重组质粒的构建一、重组质粒pMD18T_Gil α的构建I、参照 GenBank 中的 GNAIl 蛋白(GenBank Accession number :ΝΜ_002069,又称Gila蛋白；该蛋白的编码基因存在于H印G2细胞，且没有内含子)的编码基因设计一对引物Gil a -Pl (上游引物，下划线标注EcoR I识别序列)和Gil a -P2 (下游引物，下划线标注HindIII识别序列)。Gil a -Pl 5/ ~CGGAATTCATGGGCTGCACGCTGAGCG~3'；Gil a -P2 5/ ~CCCAAGCTTTTAAAAGAGACCACAATC~3'。 2、提取H印G2细胞的基因组DNA，将基因组DNA作为模板，用Gil a -Pl和Gil a -P2组成的弓I物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PCR扩增产物的电泳图见图2的泳道2)。3、将步骤2的PCR扩增产物与pMD18_T载体连接，得到重组质粒pMD18_T_Gil α。对重组质粒pMD18-T-Gil α进行测序，测序结果表明，在pMD18_T载体中插入了序列表的序列2自5’末端第1000至2064位核苷酸所不的DNA(编码序列表的序列I自N末端第334至687位氨基酸残基所示的蛋白，即Gil α蛋白)。二、重组质粒 pMD18-T-GPR174 的构建I、参照 GenBank 中的 GPR174 蛋白(GenBank Accession number NM_032553 ；该蛋白的编码基因存在于HepG2细胞，且没有内含子)的编码基因设计一对引物GPRl74-PI (上游引物，下划线标注BamH I识别序列)和GPRl74-P2 (下游引物，下划线标注HindIII识别序列)。GPR174-P1 5/ -CGGGATCCATGCCTGCTAATTACACGTGT-3'；GPR 174-P2 5/ -CCCAAGCTTGCATAATTCAGGTGTCATGG-3;。2、提取H印G2细胞的基因组DNA，将基因组DNA作为模板，用GPR174-P1和GPR174-P2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PCR扩增产物的电泳图见图2的泳道5)。3、将步骤2的PCR扩增产物与pMD18-T载体连接，得到重组质粒pMD18_T_GPR174。对重组质粒PMD18-T-GPR174进行测序，测序结果表明，在pMD18_T载体中插入了序列表的序列2自5’末端第I至999位核苷酸所示的DNA(编码序列表的序列I自N末端第I至333位氣基酸残基所不的蛋白，即GPR174蛋白)。三、重组质粒pFASTBacl-GPR174_Gil α 的构建I、以重组质粒pMD18-T-GPR174为模板，用GPR174-P1和GPR174-P2,组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。GPR 174-Ρ2' 5/ -GCGTGCAGCCCATGCATAATTCAGGTGTCATG-3;。PCR 扩增条件-MV 45s,520C 30s、72°C I. 2min, 25 个循环。2、以重组质粒pMD18-T_Gila为模板，用Gil a (85)^31和Gil a-P2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Gil a (174)-P3/ 5/ -ACCTGAATTATGCATGGGCTGCACGCTGAGC-3'。PCR 扩增条件-MV 45s,550C 30s、72°C I. 2min, 25 个循环。3、将步骤I的PCR扩增产物和步骤2的PCR扩增产物等量混合后作为模板，用GPR174-P和Gil α -Ρ2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(PCR扩增产物的电泳图见图3的泳道2)。PCR 扩增条件 940C 45s, 55°C 30s, 72°C I. 2min, 25 个循环。4、用限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切pFASTBacl质粒(结构示意图见图
I)，回收载体骨架(约4775bp)。6、将步骤4的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pFASTBacl-GPR174-Gil α。根据测序结果对重组质粒pFASTBacl-GPR174_Gil α进行结构描述如下以pFASTBacl质粒为骨架载体，在骨架载体的EcoRI和HindIII酶切位点之间插 入了序列表的序列2所不的DNA(序列表的序列2所不DNA即为融合蛋白GPR174_Gil α的编码基因，编码序列表的序列I所示的融合蛋白GPR174-Gil α )。实施例2、融合蛋白GPR174_Gila的表达和鉴定采用Bac-to-Bac杆状病毒昆虫细胞表达系统实现融合蛋白GPR174_Gila的高效快速表达。原理如下将含有融合蛋白编码基因的重组质粒导入大肠杆菌DHlOBac菌株后，重组质粒在辅助质粒作用下发生位点特异性转座，融合蛋白编码基因插入杆状病毒穿梭杆粒中，得到重组杆粒；将纯化后的重组杆粒转染昆虫sf9细胞，转染后的细胞可分泌重组杆状病毒；再将重组杆状病毒转染sf9细胞，可以实现融合蛋白的表达。一、重组杆粒的获得I、在1.5ml Ep管中加入IOOul大肠杆菌DHlOBac菌株感受态细胞和Ing (约5 μ I)重组质粒pFASTBacl-GPR174-Gil α，轻轻敲打管壁使之混匀，冰水混合物中放置30min，然后转移到42°C水浴中热休克45s，快速取出放置于冰水混合物中2min。2、在步骤I的Ep管中加入900 μ I LB培养液，在摇床中(37°C、225rpm)振荡培养5h (4 6h均可)ο3、将步骤2的细胞悬液用LB培养液稀释后涂布于LB培养基平板(含卡那霉素50 μ g/ml、庆大霉素 7 μ g/ml、四环素 10 μ g/ml、X-gal 100 μ g/ml、IPTG 40 μ g/ml)上,置于37 °C培养箱中培养36h(24 48h均可)。4、步骤3的LB平板上显示蓝白两种斑点(见图4)，选取一个蓝色克隆作为对照，同时挑取10个白色克隆划线到新的LB培养基平板(含卡那霉素50 μ g/ml、庆大霉素7 μ g/ml、四环素 10 μ g/ml、X-gal 100 μ g/ml、IPTG 40 μ g/ml)上，37°C培养箱中倒置培养过夜；挑取单个白色克隆至3ml LB培养液(含卡那霉素50 μ g/ml、庆大霉素7 μ g/ml、四环素
10μ g/ml)，37°C摇床275rpm(250 300rpm均可)振摇过夜(约12小时)。5、重组杆粒 pBacmid-GPRl74-Gil α 的提取①取I. 5ml步骤4的培养物于I. 5ml Ep管中，14000g离心lmin,真空抽吸移弃上清，倒立于吸水纸上。②加入0.3ml 溶液 I (Tris-HCl 15mM、EDTA IOmM,RNaseA 100 μ g/ml ;过滤除菌并4°C保存)用枪头轻轻吹打重悬细胞。③加入O. 3ml溶液II (NaOH O. 2M、I % SDS ;过滤除菌并4°C保存)，轻轻混匀。室温孵育5min。
④缓慢加入O. 3ml溶液III (乙酸钾3M，调pH值至5. 5 ;过滤除菌并4°C保存)，边加边轻轻震荡，当观察到大量白色沉淀时，将样品置于冰上8min(5 IOmin均可)。⑤14000g室温离心lOmin，将上清转移到含有异丙醇的Ep管中，轻轻倒转Ep管数次混勻，置于冰上8min (5 IOmin均可)。⑥14000g室温离心15min，移弃上清，在每一管沉淀中加入70%乙醇O. 5ml，翻转
Ep管数次清洗沉淀。⑦14000g室温离心5min，移弃上清，使沉淀在空气中自然干燥。⑧加入40ul TE溶液，轻敲管底，使之溶解，_20°C保存备用。6、重组杆粒 pBacmid-GPRl74-Gil α 的 PCR 鉴定用针对杆状病毒穿梭杆粒中IacZa互补区内的小_attTn7位点的两端的引物对(PUCF和PUCR)对重组杆粒(步骤5保存的溶液)进行PCR鉴定，如果插入外源基因会导致PCR扩增产物增大(原始的杆状病毒穿梭杆粒的PCR扩增产物约为2. 2kp，插入融合蛋白GPR174-Gil α的编码基因的重组杆粒的PCR扩增产物预期为4. 4kb左右)。PUC F(pUC/M13 上游引物)5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3'；PUC R(pUC/M13 下游引物)5' -TCACACAGGAAACAGCTATGAC-3'。PCR 条件94°C 45s、55°C 45s、72°C 5min, 35 个循环。PCR扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳，见图5 (泳道4代表PCR扩增产物)。PCR产物为4. 4kb左右，与理论值相同，说明融合蛋白GPR174-Gil α的编码基因已经成功克隆到杆状病毒穿梭载体中，重组杆粒pBacmid-GPR174-Gil α构建成功。二、重组杆状病毒母株的制备I、重组杆粒转染sf9细胞(I)转染前一天将sf9细胞按9 X IO5个/孔接种于6孔板，使细胞贴壁。(2)借助TransFast TM转染试剂(Promega公司)将步骤一获得的重组杆粒pBacmid-GPR174-Gila转染步骤(I)的sf9细胞，按说明书进行操作，27°C孵育。转染方法具体如下配制溶液A(将5μ I重组杆粒pBacmid-GPR174_Gila与100 μ I 8作0011培养液混合)和溶液8(将5“1 TransFast TM转染试剂与ΙΟΟμΙ sf900II培养液混合)，溶液A和溶液B混匀，得到A-B混合液，室温孵育30min (15_45min均可)；用2ml sf900II培养液清洗每孔细胞一次；在将A-B混合液与800 μ I sf900II培养液轻轻混匀，加入清洗后的细胞孔中；27°C孵育5h ;移弃细胞孔中的上清液，加入2ml sf900II培养液，27 °C孵育。2、病毒母株的分离与贮存当步骤I的细胞出现病毒感染迹象(转染后约72h)时，将上层培养液(约2ml)转移到无菌Ep管中，500g离心5min (以去除细胞及大的碎片)，收集上清液，即为Pl代病毒液，其中含重组杆状病毒的病毒母株(PD。Pl代病毒液保存于无菌EP管。3、空斑实验测定病毒滴度
通过固定的单细胞层培养物形成的空斑确定Pl代病毒液的滴度，具体方法如下①6孔板中每孔加入I X IO6个对数生长期的sf9细胞，置于27°C培养箱培养至少lh，使细胞贴壁，吸弃上清。②将40ml 4%琼脂凝胶微波炉融化后置于70°C水浴防止其凝结；将一个IOOml锥形瓶与一瓶I. 3Xsf900II培养液置于40°C水浴加热。③在灭菌离心管中将Pl代病毒液用sf900II培养液进行10倍梯度稀释，得到各个稀释液(病毒接种液)。④将步骤①的6孔板中的各个细胞孔分别接种各个病毒接种液，每孔2ml，27°C孵育Ih，吸弃上清。⑤准备空斑覆盖液迅速将30ml步骤②中的I. 3Xsf900II培养液与IOml步骤②中的4%琼脂凝胶加入步骤②中的锥形瓶中，轻轻混匀，置于40°C水浴直至使用。⑥将步骤④的6孔板中的各个细胞孔每孔加入2ml步骤⑤的空斑覆盖液，置于27°C培养箱中倒置培养，每天观察并计数空斑，直至其连续2天数目不变为止。⑦用6孔板上每一孔最佳计数范围3-9个空斑测定病毒接种液效价(pfu/ml)，计算公式如下病毒滴度(pfu/ml) = I/稀释倍数X每孔空斑数X I/(每孔接种ml数)。结果表明，Pl代病毒液的滴度介于I X IO6 I X IO7之间。
4、病毒母株的扩增采用如下方法进行病毒母株的扩增采用六孔板，每孔接种2 X IO6个sf9细胞(活力> 97 % )，在每个孔中加入2ml Pl代病毒液，孵育48h ( 一般感染48h收集的病毒能扩增将近100倍，超过48h收集的病毒质量较低)后收集上清，500g离心5min，收集上清液，即为P2代病毒液。P2代病毒液保存于无菌EP管。将P2病毒液再次按上述方法进行扩增，得到P3代病毒液，检测P3代病毒液的滴度，方法同步骤3，病毒滴度液P3代病毒液的滴度介于I X IO7 I X IO8之间。三、对照病毒液的制备I、用pFASTBacl质粒(即空质粒pFASTBacl)代替重组质粒pFASTBacl-GPR174-Gil α进行步骤一，得到对照杆粒。2、用对照杆粒代替重组杆粒pBacmi d-GPR174_Gil α进行步骤二，得到Pl代对照
病毒液。四、融合蛋白GPR174_Gila的获得和鉴定I、在25cm2细胞培养瓶中接种IX IO7个对数生长期的sf9细胞，置于27°C培养箱至少Ih (使细胞贴壁)，加入Pl代病毒液，使MOI等于5 (Μ0Ι的定义是平均每个细胞感染病毒的数量)；置于27°C培养箱培养72h。培养72小时后的照片见图6，可见细胞病变比较明显，表现为细胞增殖缓慢、形态肿胀变圆且折光性增强，细胞更易漂浮。 2、收集转染Pl代病毒液72h后的sf9细胞，采用膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统试剂盒(普利莱基因技术有限公司)提取细胞膜总蛋白，按试剂盒的说明进行操作。3、将步骤2提取的细胞膜总蛋白进行SDS-PAGE电泳(12 %分离胶，5 %浓缩胶；60V恒压跑浓缩胶，90V恒压跑分离胶)。4、将步骤3得到的电泳胶进行Western Blot, —抗为抗Gil α蛋白多克隆抗体G a i-1/2/3 (N-20)(工作浓度为I : 500稀释)，二抗为辣根酶标记的兔抗山羊二抗(工作浓度为I : 2000稀释)，在暗室内以Super ECL Plus超敏发光液进行化学发光，检测融合蛋白的表达。结果见图7，融合蛋白GPR174_Gil α可以被Gil α蛋白的特异性抗体识别。单独的GPR174或Gila蛋白脱离了生命状态(活细胞环境)是无法结合在一起的，需要借助细胞内环境，才能结合成为被Gila蛋白特异性抗体识别的蛋白复合物。而本发明提供的融合蛋白，脱离了生命状态(活细胞环境)即具有Gila蛋白的抗原活性，可以作为体外筛选系统，对候选的作为药物的化合物或小分子进行筛选(考察其能否与融合蛋白结合)。5 JfPl代对照病毒液代替Pl代病毒液进行步骤I至步骤4，没有显示出杂交信号。实施例3、融合蛋白表达条件的优化一、感染剂量的优化I、在25cm2细胞培养瓶中接种IX IO7个对数生长期的sf9细胞，置于27°C培养箱至少Ih (使细胞贴壁)，加入Pl代病毒液，分别设置4个感染剂量(Μ0Ι = 1、2、5或10);置 于27 °C培养箱培养72h。2、收集转染Pl代病毒液72h后的sf9细胞，采用膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统试剂盒(普利莱基因技术有限公司)提取细胞膜总蛋白。3、将步骤2提取的细胞膜总蛋白进行SDS-PAGE电泳(12 %分离胶，5 %浓缩胶；60V恒压跑浓缩胶，90V恒压跑分离胶)。4、将步骤3得到的电泳胶进行Western Blot, —抗为抗Gil α蛋白多克隆抗体G a i-1/2/3 (N-20)(工作浓度为I : 500稀释)，二抗为辣根酶标记的兔抗山羊二抗(工作浓度为I : 2000稀释)，在暗室内以Super ECL Plus超敏发光液进行化学发光，检测融合蛋白的表达。结果见图8。当MOI = 5时，融合蛋白表达量最高。二、感染时间的优化I、在25cm2细胞培养瓶中接种IX IO7个对数生长期的sf9细胞，置于27°C培养箱至少Ih (使细胞贴壁)，加入Pl代病毒液，使MOI等于5 ;置于27°C培养箱培养，分别在24小时、48小时、72小时和96小时后取样进行步骤2。2、收集细胞，采用膜/疏水蛋白与亲水蛋白双相分离系统试剂盒(普利莱基因技术有限公司)提取细胞膜总蛋白。3、将步骤2提取的细胞膜总蛋白进行SDS-PAGE电泳(12 %分离胶，5 %浓缩胶；60V恒压跑浓缩胶，90V恒压跑分离胶)。4、将步骤3得到的电泳胶进行Western Blot, —抗为抗Gil α蛋白多克隆抗体G a i-1/2/3 (N-20)(工作浓度为I : 500稀释)，二抗为辣根酶标记的兔抗山羊二抗(工作浓度为I : 2000稀释)，在暗室内以Super ECL Plus超敏发光液进行化学发光，检测融合蛋白的表达。结果见图9。72小时时，融合蛋白表达量最高。
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b) (a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列I衍生的蛋白质。
2.编码权利要求I所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表中序列2自5’末端I至2061位核苷酸所示的DNA分子； 2)序列表中序列2所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有G蛋白抗原活性的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组表达载体、表达盒、重组细胞或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将权利要求2或3所述基因插入pFASTBacl质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述重组表达载体为将权利要求5所述重组质粒导入大肠杆菌DHlOBac菌株，通过菌内重组得到的含有权利要求2或3所述基因的杆状病毒质粒。
7.一种制备权利要求I所述蛋白的方法，包括如下步骤 (1)将权利要求6所述杆状病毒质粒转染昆虫细胞，培养后收集上清，即为Pl代病毒液； (2)将所述Pl代病毒液感染昆虫细胞，培养后得到权利要求I所述蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述昆虫细胞为sf9细胞；所述步骤(I)中，所述培养的培养时间为72小时；所述步骤(2)中，所述感染的感染剂量为MOI = 5，所述培养的培养时间为72h。
9.一种表达权利要求I所述蛋白的试剂盒，包括大肠杆菌DHlOBac菌株、昆虫细胞和权利要求4或5所述的重组表达载体。
10.权利要求I所述蛋白在药物筛选中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种融合蛋白GPR174-Gilα及其编码基因和应用。本发明提供的融合蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将(a)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有G蛋白抗原活性的由序列1衍生的蛋白质。单独的GPR174或Gilα蛋白脱离了生命状态(活细胞环境)是无法结合在一起的，需要借助细胞内环境，才能结合成为被Gilα蛋白特异性抗体识别的蛋白复合物。而本发明提供的融合蛋白，脱离了生命状态(活细胞环境)即具有Gilα蛋白的抗原活性，可以作为体外筛选系统，对候选的作为药物的化合物或小分子进行筛选(考察其能否与融合蛋白结合)。
文档编号C12N5/10GK102863534SQ20111018508
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者刘永学, 彭明丽, 吴芳明, 陈曦, 韩春光, 白月霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所