专利名称：扩展青霉菌脂肪酶在制备生物柴油中的应用的制作方法
技术领域：
本发明申请涉及扩展青霉菌脂肪酶在制备生物柴油中的应用，属于生物工程技术领域。
背景技术：
近年来脂肪酶(Lipase EC)在エ业应用方面取得了很大进展，碱性脂肪酶具有对底物水解效率高、反应温和、无毒、能在一定条件下水解脂肪作用等优点，已经在洗涤剂、造纸、制革、食品、纺织及轻エ业等领域得到广泛的应用，并已经成为全世界酶制剂市场上重要的品种。通过对大量的微生物菌种进行选育，现在已经获得了一种产碱性脂肪酶能力较强 的扩展青霉(P. expansium)菌株,并经过多年的诱变育种和发酵エ艺改进,其产脂肪酶的能力已经得到大幅度的提高。但是，传统的菌株育种方法主要依靠随机的理化诱变，目标不明确，费时费カ而且收效不明显，目前通过采用这些方法来提高该菌株产脂肪酶的能力已经非常有限，潜力小。生物柴油(Biodiesel)是指以油料作物、野生油料植物和工程微藻等水生植物油脂以及动物油脂、餐饮垃圾油等为原料油，通过酯交换エ艺制成的可代替石化柴油的再生性柴油燃料。生物柴油是生物质能的ー种，它是生物质利用热裂解等技术得到的一种长链脂肪酸的单烷基酷。生物柴油是含氧量极高的复杂有机成分的混合物，这些混合物主要是ー些分子量大的有机物，几乎包括所有种类的含氧有机物，如醚、酷、醛、酮、酚、有机酸、醇
坐寸o生物柴油作为全球能源紧缺状况下的一种优良的可替代能源，具有广阔的市场应用价值，是目前研究的热点。
发明内容
本发明申请即是针对现有技术中的不足之处，提供ー种能够高效合成脂肪酶的青霉基因工程菌的方法。具体来说，本发明申请所述的一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步骤I、获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；2、分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒；3、将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体；4、将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌。
其中所述的青霉菌为扩展青霉。所述的目标质粒为下列之一pCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。本发明申请还涉及将所述的青霉基因工程菌应用于制备脂肪酶。所述的应用是将所述的青霉基因工程均以5-20%接重量，接种到发酵培养基，在25-35°C、200-300rpm条件下，发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。通常，是将所述的青霉基因工程菌以菌丝体或孢子悬液接入种子培养基在25-35 °C、200-300rpm条件下培养24小时后，以5% -20 %接种量转入发酵培养基，在25-35°CU50-300rpm条件下发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。本发明中所用到的培养基如下PDA培养基(g/L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；PH自然；MM 培养基IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) 10mL，M-N(MgS04 7H20 30g/L，NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2 2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 I OmL, Sporeelement (ZnSO4 7H20 lOOmg/L,CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L,MnSO4 H2O lOOmg/L,Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，无菌水 941. 5mL ；IM 培养基1.25M K-buf f er (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl15g/L)20mL, I % CaCl2 2H20 lmL，20 % 葡萄糖 10mL，0.01 % FeSO4 I OmL, Sporeelement (ZnSO4 7H20 lOOmg/L,CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L,MnSO4 H2O lOOmg/L,Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，50% 甘油 IOmL, IM MES (PH5. 5)40mL, IOOmMAS (こ酰丁香酮)2mL,无菌水898. 7mL ；CM培养基加一半頂培养基的葡萄糖量，外加I. 5%琼脂，其它成份同頂培养基；种子培养基(%):黄豆饼粉 4，玉米淀粉 0. 8，Na NO3 0. 3，Na2HPO4 0. 2，K2SO4
0.25，MgSO4 0. 03，FeSO4 0. 003 ；发酵培养基(%):黄豆饼粉 6，玉米淀粉 1，NaNO3 0. 4，Na2HPO4 0. 2，K2SO4O. 3，MgSO4 0. 035，FeSO4 0. 02，CaCO3 0. 5，Na2CO3 0. 02。本发明所述的青霉基因工程菌及其制备与应用的有益效果主要体现在I、运用基因工程技术对青霉菌进行改良，育种目标明确，效率高；2、所得工程菌产脂肪酶能力強，比工程菌的出发青霉菌菌株提高了 70%以上。本发明申请还涉及利用所述的改型脂肪酶制作生物柴油的方法用生物酶法合成生物柴油，即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及こ酷。酶法合成生物柴油具有条件温和、醇用量小、无污染排放的优点。由于利用物酶法合成生物柴油具有反应条件温和、醇用量小、无污染物排放等优点，具有环境友好性，因而日益受到人们的重视。具体来说，所述的方法包括如下步骤I、原料的预处理将生物油脂过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为 5000-10000rpm，搅拌时间为 5_15min ；2、酯交换反应步骤将摩尔比为I : 1-3的油脂和甲醇或こ醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和有机溶剂，在20-50°C的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇或こ醇，毎次加入甲醇或こ醇与油脂的摩尔比为1-3:1;3、生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收有机溶剂，得到成品生物柴油。其中，在步骤2中，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与原料油的摩尔比为I : 12-20，有机溶剂与原料油的摩尔比为I : 0. 5-1.5。所述的有机溶剂包括但不限于石油醚、异辛烷、正己烷、正庚烷、环己烷和三氯甲烧。所述的原料油包括但不限于菜籽油、大豆油、棉籽油、花生油、玉米油、猪油、鱼油和微生物油脂。本发明申请所得到的生物柴油，具有以下的优点I.具有优良的环保特性主要表现在由于生物柴油中硫含量低，使得ニ氧化硫和硫化物的排放低，可减少约30% (有催化剂时为70%)；2.生物柴油中不含对环境会造成污染的芳香族烷烃，因而废气对人体损害低于柴油，检测表明，与普通柴油相比，使用生物柴油可降低90%的空气毒性，降低94%的患癌率；由于生物柴油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相比减少约10%(有催化剂时为95% )，生物柴油的生物降解性高；3.具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达_20°C ;4.具有较好的润滑性能使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，使用寿命长；5.具有较好的安全性能，由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因此，在运输、储存、使用方面的安全性又是显而易见的；6.具有良好的燃料性能十六烷值高，使其燃烧性好于柴油，燃烧残留物呈微酸性，使催化剂和发动机机油的使用寿命加长；7.具有可再生性能作为可再生能源，与石油储量不同，其通过农业和生物科学家的努力，可供应量不会枯竭；8.无须改动柴油机，可直接添加使用，同时无需另添设加油设备、储存设备及人员的特殊技术训练；9.生物柴油以一定比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动カ性，并降低尾气污染。
附图为超表达载体pCHAMBIA2302: : PgpdA-PEL-TtrpC的构建路线图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明申请所述的本发明申请所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法以及利用该脂肪酶生产生物柴油的方法进行进一步描述，目的是为了公众更好的理解本发明的技术内容，而不是对所述技术内容的限制，事实上，在本发明精神实质内，对本发明申请所述方法的改进，目标质粒和限制性内切酶的替换都是本领域一般技术人员无需创造性的劳动即可获得的，因此都在本发明申请所要求保护的技术方案之内。
实施例一、超表达载体的构建采用如下的步骤(I)利用限制性内切酶Sac I，Kpn I将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到PCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒PCHAMBIA2302 ;潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建PEL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300タト，还可用能在丝状真菌中表达的质粒如 pCAMBIA1300、pCAMBIA3300 等 pCAMBIA 系列载体和 pHB 载体；(2)根据扩展青霉菌P. expansium的脂肪酶基因PEL (AF330635)的序列设计引物(正向引物TGACTAGT ATGTTGirCAACTACCAATCTTT下划线的序列为限制性酶Spe I切点；反向引物:TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC下划线的序列为限制件酶Not I切点)，利用PCR技术扩增全基因序列，PCR反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，35个循环；72°C IOmin ； (3)根据质粒 pPAN7_l (Punt et al. 1987 Gene 56:117-124)的序列设计引物(正向引物GCTATCTGAGCTGATAAGCGGCCGCGGATCCACTTAACGTTA,下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC,下划线的序列为限制性酶PmeI切点)，利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC，PCR反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 60s, 35 个循环；72で IOmin ；(4)取(2)和(3)的反应液各 I U L 作为模板，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，进行PCR扩增，PCR 的反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s, 72°C 150s，35 个循环；72°C IOmin0反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到PMD-18-T :载体，获得中间载体PMD-18-T::PEL-TtrpC ；(5)根据质粒 pPAN7_l (Punt et al. 1987 Gene 56 :117-124 的序列设计引物(正向引物GAGTCGAC GAATTCCCTTGTATCTCTACACAC下划线的序列为限制性酶Not I切点；反向引物GAACTAGTCTGCTCAAGCGGGGTAGCTGTTAGT下划线的序列为限制性酶Pme I切点)利用PCR技术扩增强启动子PgpdA。PCR反应条件为95°C 5min ；95°C 30s, 56°C 30s，72°C 150s，35个循环；72V IOmin0利用限制性内切酶Sal I和Spe I将PgpdA克隆到载体 PMD-18-T: :PEL-TtrpC 的相应位点，获得中间载体 PMD-18-T: :PgpdA-PEL-TtrpC ；(6)利用限制内切酶 Sal I 和 Pme I 对载体 PMD-18-T: :PgpdA-PEL-TtrpC 进行消化，回收表达盒PgpdA-PEL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体PCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL_TtrpC，整个的构建过程如附图所示；(7)对含有最终载体pCHAMBIA2302: : PgpdA-PEL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105，随机挑选6株转化子，以(TGACTAGTATGTTGITCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(TGGATCCGCGGCCGCTTATCAGCTCAGATAGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T: =PEL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对这6株菌进行PCR鉴定，结果显示这6株菌均为阳性。实施例ニ、青霉基因工程菌的获得所述青霉基因工程菌的获得包括如下的步骤(I)挑取分离纯化后的野生型青霉接种于PDA平板上，于28°C培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；(2)将实例一中含终载体 pCHAMBIA2302: :PgpdA-PEL-TtrpC 的工程农杆菌 EHA105接种于含有链霉素、卡那霉素(均为IOOii g/ml)的LB液体培养基中28°C，200rpm过夜培养，用含有链霉素和卡那霉素(均为100 u g/ml)的MM培养基重新活化，280C，220rpm培养48小吋。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至0D600 = 0. 15，然后在28°C，220rpm的条件下培养6-8小时，至0D600 =
0.5-0. 6 ；(3)将第(I)步得到的新鲜孢子配制成I X IO7个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤(2)中的工程农杆菌等体积混合，取200 UL均匀涂布到铺有玻璃纸的頂固体培养基(含AS 200 u g/mL)之上，28°C共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素(100 ii g/mL转化选择抗生素)、头孢菌素(500 ii g/mL,抑制农杆菌生长抗生素)的PDA培养基上28°C培养2天，揭下玻璃纸，在28°C条件下培养1-3天，将抗潮霉素的转化子挑出接 种到ニ筛培养基上，如稳定传代，即是所述的青霉基因工程菌，如此获得了 30株青霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以(TGACTAGTATGTTGTTCAACTACCAATCTTT)作为正向引物；以(GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGCGC)作为反向引物，以载体PMD-18-T: :PEL-TtrpC为阳性对照，野生型青霉基因组DNA为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性。MM培养基的成分如下所述IM K2HPO4-KH2PO4 (PH7. 0) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL, I %CaCl2 *2H20 lmL，20%葡萄糖 10mL，0.01% FeSO4 IOmL, Spore element (ZnSO4 *7H20 IOOmg/L, CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 H2O lOOmg/L, Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20% NH4NO3 2. 5mL，无菌水 941. 5mL。IM培养基的成分如下所述IM K-buf fer (PH4. 9) IOmL, M-N (MgSO4 7H20 30g/L, NaCl 15g/L)20mL, I %CaCl2 *2H20 lmL，20%葡萄糖 10mL，0.01% FeSO4 IOmL, Spore element (ZnSO4 *7H20 IOOmg/L, CuSO4 5H20 lOOmg/L, H3BO3 lOOmg/L, MnSO4 H2O lOOmg/L, Na2MoO4 2H20 lOOmg/L) 5mL,20 % NH4NO3 2. 5mL, 50 % 甘油 IOmL, IM MES (PH5. 5) 40mL, IOOmM AS (こ酰丁香酮)2mL,无菌水 898. 7mLCM培养基加一半頂培养基的葡萄糖量，外加I. 5%琼脂，其它成份同頂培养基。PDA培养基(g/L):马铃薯，200 ;蔗糖，20 ;琼脂，15 ；PH自然。实施例三本发明申请是在有机溶剂油——水界面上完成的酯交换反应，酷交換合成酯化率可达到85-95%。本发明中使用的脂肪酶是采用本发明得到的改型扩展青霉菌脂肪酶，然后采用固定化处理的方法，其中，所述的固定化方法包括如下步骤在缓冲液中加入酶粉，搅拌使其充分溶解，然后将一定量的硅藻土加入酶液中，恒温振荡一定时间后，离心收集固体，将固定化载体用丙酮清洗3-5次，使载体颗粒分散，再用蒸馏水清洗3-5次，将丙酮洗掉，冷冻干燥后即得到固定化的脂肪酶。实施例四
具体来说，所述的方法包括如下步骤I.原料的预处理将菜籽油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为5000rpm,搅拌时间为15min ；2.酯交换反应步骤将摩尔比为I : 3的菜籽油和甲醇加入反应容器中，然后加入上述得到的固定化的改型扩展青霉菌脂肪酶和正己烷，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与菜籽油的摩尔比为I : 12，正己烷与菜籽油的摩尔比为I : 0.5-1. 5，在20°C的反应条件下，密闭混合反应24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇，毎次加入甲醇与菜籽油的摩尔比为1-3:1;3.生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反 应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收正己烷，得到成品生物柴油。实施例五所述的方法包括如下步骤I.原料的预处理将花生油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为IOOOOrpm,搅拌时间为5min ；2.酯交换反应步骤将摩尔比为I : I的花生油和こ醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和环己烷，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与花生油的摩尔比为I : 12-20，环己烷与花生油的摩尔比为I : 0. 5-1. 5，在50°C的反应条件下，密闭混合反应6小时，在反应的过程中，再次加入こ醇，毎次加入こ醇与花生油的摩尔比为1-3 I ；3.生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收环己烷，得到成品生物柴油。实施例六具体来说，所述的方法包括如下步骤I.原料的预处理将猪油过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为7000rpm,揽拌时间为IOmin ；2.酯交换反应步骤将摩尔比为I : 2的猪油和甲醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和石油醚，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与猪油的摩尔比为I : 12-20，石油醚与猪油的摩尔比为I : 0. 5-1. 5，在20-50°C的反应条件下，密闭混合反应6-24小吋，在反应的过程中，再次加入甲醇，毎次加入甲醇与猪油的摩尔比为1-3 I ；3.生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收石油醚，得到成品生物柴油。依据本发明申请获得的改型扩展青霉菌脂肪酶加工制造生物柴油，有效的缓解了能源紧缺的问题，并且所述方法反应时间短、エ艺简化、生物柴油的转化率高，并且该方法还具有能耗低、产品易于回收和无污染物排放等特点。
权利要求
1.一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的方法包括如下的步骤 1)获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒； 2)分别扩增青霉的脂肪酶基因(PEL)、构巢曲霉的强启动子3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子(PgpdA)和构巢曲霉色氨酸合成酶终止子(TtrpC)，得到有强启动子驱动的PEL基因表达盒; 3)将该PEL基因表达盒插入到潮霉素抗性的重组质粒中，获得了含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体； 4)将含潮霉素筛选标记的PEL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将PEL基因表达盒转化到青霉菌株中，获得高表达脂肪酶的青霉基因工程菌。
2.根据权利要求I所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法，其特征在于其中所述的青霉囷为扩展青霉。
3.根据权利要求I所述的获得高效表达脂肪酶菌株的方法，其特征在于所述的目标质粒为下列之一PCAMBIA1300、pCAMBIA2300、pCAMBIA3300 或 pHB。
4.利用权利要求I所得到的青霉基因工程菌生产脂肪酶的方法，其特征在于所述的方法是将所述的青霉基因工程均以5-20%接重量，接种到发酵培养基，在25-35°C、200-300rpm条件下，发酵2天后，经分离纯化得到所述的脂肪酶。
5.利用权利要求4所得到的脂肪酶生产生物柴油的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤 1)原料的预处理将生物油脂过滤去除杂质，然后进行搅拌得到乳化，其中搅拌速度为 5000-10000rpm，搅拌时间为 5_15min ； 2)酯交换反应步骤将摩尔比为I: 1-3的油脂和甲醇或こ醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和有机溶剂，在20-50°C的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇或こ醇，毎次加入甲醇或こ醇与油脂的摩尔比为1-3 I ； 3)生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收有机溶剂，得到成品生物柴油。
6.根据权利要求5所述的生产生物柴油的方法，其特征在干其中，在步骤2)中，所述的改型扩展青霉菌脂肪酶与原料油的摩尔比为I : 12-20，有机溶剂与原料油的摩尔比为I 0. 5-1. 5。
7.根据权利要求5所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的有机溶剂包括石油醚、异辛烷、正己烷、正庚烷、环己烷或三氯甲烷。
8.根据权利要求5所述的生产生物柴油的方法，其特征在于所述的原料油包括菜籽油、大豆油、棉籽油、花生油、玉米油、猪油、鱼油或微生物油脂。
全文摘要
本发明申请提供一种获得高效表达脂肪酶菌株的方法以及利用该方法得到高表达的脂肪酶在生产生物柴油中的应用，包括原料的预处理将生物油脂过滤去除杂质，进行搅拌得到乳化；酯交换反应步骤将摩尔比为1∶1-3的油脂和甲醇或乙醇加入反应容器中，然后加入上述得到的改型扩展青霉菌脂肪酶和有机溶剂，在20-50℃的反应条件下，密闭混合反应6-24小时，在反应的过程中，再次加入甲醇或乙醇，每次加入甲醇或乙醇与油脂的摩尔比为1-3∶1；生物柴油的获得反应结束后，将所述的脂肪酶从反应物中分离出来，再将反应产物进行离心分层，静置后分离处下层的粗甘油，上层液体进行蒸馏，回收有机溶剂，得到成品生物柴油。
文档编号C12R1/83GK102864164SQ20111018552
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者王剑英, 陈健, 王宏, 兰瑛 申请人:深圳市绿微康生物工程有限公司