专利名称：一种三段式固态发酵生产α-半乳糖苷酶的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种三段式固态发酵生产α-半乳糖甘酶的方法。
背景技术：
α -半乳糖甘酶是一种以特异性水解非还原性末端α -1,6-半乳糖苷键为特征的糖苷水解酶，因此能够水解包括密二糖、棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖等α -半乳糖甘寡糖以及瓜尔豆胶，刺槐豆树胶等杂多糖。目前已经被广泛应用在食品、饲料以及其他工业中。我国目前大多数家畜及家禽饲料类型大多以玉米-豆粕型为主，而豆粕中含有包括密二糖、棉籽糖、水苏糖及毛蕊花糖等约7 %的α -半乳糖苷类物质等抗营养因子，在消化道后段被厌氧菌所代谢，产生二氧化碳、氢气及少量的甲烷气体，引起动物消化不良，降低动物对饲料中营养物质的消化吸收。由于哺乳动物自身体内几乎不产生α-半乳糖苷酶，故将α -半乳糖苷酶作为饲料添加剂添加于家畜或家禽饲料中，能明显提高饲料利用率，改善饲用动物的消化吸收能力。近年来，我国α-半乳糖苷酶在饲料中的应用还处于初步研究阶段，已开展微生物发酵生产α-半乳糖苷酶酶制剂的研究。固态发酵由于通常采用较经济的农副产物为培养基，对于α-半乳糖苷酶酶制剂生产具有较高性价比。目前我国工厂中主要采用的固态发酵模式仍属于较为粗放的平铺或堆积发酵。这种发酵模式节约成本，操作简便，不需要特殊设备就可进行，在中小型工厂中有广泛应用。但目前α-半乳糖甘酶固态发酵生产过程的发酵条件不稳定，往往影响发酵顺利进行，以至导致产品品质不稳定，活力较低，而对发酵条件的监控则需耗费大量人力物力，影响经济效益。因此，探索一种简便易操作、低成本的、使发酵过程稳定进行从而提高酶活力的α-半乳糖甘酶固态发酵生产方法显得尤为重要。
发明内容
本发明提供了一种三段式固态发酵生产α -半乳糖甘酶的方法，通过三段式控制固态发酵生产α -半乳糖甘酶从而提高其酶活力，操作简便，成本低，发酵过程稳定。一种三段式固态发酵生产α -半乳糖甘酶的方法，包括将黑曲霉(Aspergillus niger)接种到灭菌后的固态发酵培养基中，置于无菌环境下进行分段发酵，第一阶段发酵时间为22- ，环境温度为26-30°C，环境湿度为 60-70% ；第二阶段发酵时间32-40h，环境温度为23-25°C，环境湿度为85-90% ；第三阶段发酵时间为^_62h，环境温度为^_30°C，环境湿度为90-95% ；所述的固态发酵培养基由干基加水搅拌后制成，每IOOg所述干基由80_85g麸皮、 15-20g豆粕、0. 005-0. 02g五水硫酸铜和0. 005-0. 02g硫酸锰组成。所述固态发酵培养基平铺在纱布上，避免直接接触支承物而混入杂菌。所述的纱布铺在带孔隙的基材上，提供支撑，并加速散热。
所述固态发酵培养基平铺的厚度为2. 5-3. Ocm0所述黑曲霉制成种子液后接种到固态发酵培养基中，接种量为8_12ml/100g。将发酵结束后所得的产物于40-45°C气流下干燥至水分重量含量为10%，粉碎后得α-半乳糖甘酶制剂。所述干基与水的重量比为2 3-2 3.5。所述的带空隙的基材为竹编筐、塑料筐或金属筐。本发明将固态发酵生产α-半乳糖甘酶的过程分成条件不同的三个阶段，与采用普通固态发酵法相比，本发明方法生产制得的产物α-半乳糖苷酶活力提高了 40%左右， 发酵时间缩短20h以上，而且操作简便，成本低，发酵过程稳定。
具体实施例方式培养基PDA斜面培养基新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然；PDB液体培养基新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水lOOOmL，pH自然。实施例1三段式固态发酵生产α -半乳糖苷酶(1)孢子悬液制备将黑曲霉接种在PDA斜面培养基上，于^°C，60%恒温恒湿培养箱中培养144h，直到孢子铺满斜面；以生理盐水制成IO6-IO7个/mL的孢子悬液待用；(2)液体种子制备将PDB液体培养基经121°C、20min灭菌，冷却至室温；按体积比5%接种量将孢子悬液接入上述冷却后的PDB液体培养基中，于^°C、转速为150rpm的摇床上培养18h，收获液体种子；(3)固态发酵培养基制备将固态发酵培养基经12rC、20min灭菌后，待用；固态发酵培养基由重量比为2 3的干基和蒸馏水混合搅拌制成，pH自然，每IOOg干基由 80. 945g麸皮、19. 035g豆粕、0. Olg五水硫酸铜和0. Olg硫酸锰组成；(4)固态发酵接种将上述灭菌后的固态发酵培养基平铺在孔隙面积总面积为 2 5并铺有1层灭菌纱布的竹编筐底部，固态发酵培养基平铺厚度为2. 5cm;将上述液体种子以10ml/100g的接种量接入冷却至30°C的固态发酵培养基中，再在培养基上盖上2层灭菌纱布；竹编筐直径50cm、高4. 5cm ；(5) α -半乳糖苷酶的三段式控制固态发酵将接种后的固态发酵培养基放置在相对密封并经过杀菌处理的空间内，按照时间分阶段控制发酵环境条件，第一阶段0-24h， 培养环境温度为^°C，空气湿度为60% ；第二阶段24-60h，培养环境温度为23°C，空气湿度为85% ；第三阶段60-92h (发酵终点)，培养环境温度为^°C，空气湿度为95% ；(6)后处理步骤将发酵产物于40°C的气流下干燥至水分重量含量为10%，粉碎后得α-半乳糖甘酶制剂；经测定，所得α -半乳糖苷酶制剂的酶活力为182. 219U/g。实施例2三段式固态发酵生产α -半乳糖苷酶(1)孢子悬液制备将黑曲霉接种在PDA斜面培养基上，于^°C，60%恒温恒湿培养箱中培养160h，直到孢子铺满斜面；以生理盐水制成IO6-IO7个/mL的孢子悬液待用；(2)液体种子制备将PDB液体培养基经121°C、20min灭菌，冷却至室温；按体积比5%接种量将孢子悬液接入上述冷却后的PDB液体培养基中，于^°C、转速为150rpm的摇床上培养18h，收获液体种子；(3)固态发酵培养基制备将固态发酵培养基经12rC、20min灭菌后，待用；固态发酵培养基由重量比为2 3的干基和蒸馏水混合后，pH自然，每IOOg干基由80. 945g麸皮、19. 035g豆粕、0. Olg五水硫酸铜和0. Olg硫酸锰组成；(4)固态发酵接种将上述灭菌后的固态发酵培养基平铺在孔隙面积总面积为 3 5并铺有1层灭菌纱布的竹编筐底部，固态发酵培养基平铺厚度为3. Ocm;将上述液体种子10ml/100g的接种量接入冷却至30°C的固态发酵培养基中，再在培养基上盖上2层灭菌纱布；竹编筐直径50cm、高4. 5cm ；( α-半乳糖苷酶的三段式控制固态发酵将接种后的固态发酵培养基放置在相对密封并经过杀菌处理的空间内，按照时间分阶段控制发酵环境条件第一阶段 046h，培养环境温度为^°C，空气湿度为70% ；第二阶段26-62h，培养环境温度为25°C， 空气湿度为90% ；第三阶段62-120h (发酵终点)，培养环境温度为，空气湿度为90% ；(6)后处理步骤将发酵产物于45°C的气流下干燥至水分重量含量为10%，粉碎后得α-半乳糖甘酶制剂。经测定，所得α -半乳糖苷酶制剂的酶活力为169. 315U/g。实施例3普通固态发酵生产α -半乳糖苷酶(1)孢子悬液制备将黑曲霉接种在PDA斜面培养基上，于^°C，60%恒温恒湿培养箱中培养144h，直到孢子铺满斜面；以生理盐水制成IO6-IO7个/mL的孢子悬液待用；。(2)液体种子制备将PDB液体培养基经121°C、20min灭菌，冷却至室温；按体积比5%接种量将孢子悬液接入上述冷却后PDB液体培养基中，于^°C、转速为150rpm的摇床上培养18h，收获液体种子；(3)固态发酵培养基制备将固态发酵培养基经12rC、20min灭菌后，待用；固态发酵培养基由重量比为2 3的干基和蒸馏水混合后，pH自然，所述每IOOg干基由80. 945g 麸皮、19. 035g豆粕、0. Olg五水硫酸铜和0. Olg硫酸锰组成；(4)固态发酵接种将上述灭菌后固态发酵培养基平铺在孔隙面积总面积为 3 5并铺有1层灭菌纱布的竹编筐底部，固态发酵培养基厚度为2. 5cm;将上述液体种子以10ml/100g的接种量接入冷却至30°C的固态发酵培养基中，再在培养基上盖上2层灭菌纱布；竹编筐规格为直径50cm、高4. 5cm ；5) α -半乳糖苷酶的普通固态发酵将接种后的固态发酵培养基放置在相对密封并经过杀菌处理的空间内，发酵环境条件不进行特别控制，环境温度控制在20-30°C范围内，空气湿度控制在60-90 %范围内，发酵115h (发酵终点)。6)、后处理步骤将发酵产物于45°C的气流下干燥至水分含量为10%，粉碎后得 α-半乳糖甘酶制剂。经测定，所得α -半乳糖苷酶制剂的酶活力为103. 853U/g。比较实施例1、实施例2及实施例3的结果发现，与采用普通固态发酵方法相比，采用三段式控制固态发酵方法，α-半乳糖苷酶的酶活力提高了 40%左右，发酵时间缩短了 20h以上。酶活检测方法上述实施例中的发酵终点为α -半乳糖甘酶快速积累达到最高水平后进入平稳期的时刻，取上述实施例中发酵终点的发酵产物检测α-半乳糖甘酶的活力，具体测定方法将发酵后所得的α-半乳糖甘酶制剂用搅拌机搅拌均勻，称取Ig左右，加入适量 0. 2M、pH5. 0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，在40°C水浴摇床上120rpm振荡30min，滤纸过滤得粗酶液。用上述磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释至适合倍数以测定酶活。取适当稀释后的粗酶液0. 1ml，加入pH 5. 0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液 0. 05ml, 10mmol/L对硝基苯α -D-半乳吡喃糖苷0. 05ml，于50°C水浴条件下，反应IOmin, 随后加入0. 25mol/L的Na2CO3溶液3ml终止反应，在400nm下测OD值，根据标准曲线计算酶活。所需标准曲线以不同浓度对硝基酚为横坐标，400nm下OD值为纵坐标绘制。标准方程为y= 0. 1399x+0. 393酶活力的计算以样品释放的对硝基酚含量计算，样品中的α-半乳糖苷酶A(U/ mL(g)) A = ([Ax-A0] X K+C0) X Df+ (V (m) X t X 139. 11)Ax——样品酶液的吸光度OD值，A0——对应酶液的空白吸光度OD值，K——对硝基酚标准曲线的斜率，C0——对硝基酚标准曲线的截距，Df——稀释倍数，V (m)——反应所用酶量ml (g)，t-反应时间min，139. 11——对硝基酚的相对分子质量。酶活力单位定义在pH 5.0，温度为50°C的条件下，每min生成Iymol对硝基酚
所需的酶量为一个酶活力单位。
权利要求
1.一种三段式固态发酵生产α-半乳糖甘酶的方法，其特征在于，包括将黑曲霉(Aspergillus niger)接种到灭菌后的固态发酵培养基中，置于无菌环境下进行分段发酵，第一阶段发酵时间为22- ，环境温度为^-30°C，环境湿度为60-70% ； 第二阶段发酵时间为32-40h，环境温度为23-25°C，环境湿度为85-90% ；第三阶段发酵时间为^_62h，环境温度为^_30°C，环境湿度为90-95% ；所述的固态发酵培养基由干基加水搅拌后制成，每IOOg所述干基由80-85g麸皮、 15-20g豆粕、0. 005-0. 02g五水硫酸铜和0. 005-0. 02g硫酸锰组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基平铺在纱布上。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的纱布铺在带孔隙的基材上。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固态发酵培养基平铺的厚度为 2. 5-3. Oem0
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述黑曲霉制成种子液后接种到固态发酵培养基中，接种量为8-12ml/100g。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将发酵结束后所得的产物于40-45°C气流下干燥至水分重量含量为10%，粉碎后得α-半乳糖甘酶制剂。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干基与水的重量比为2 3-2 3.5。
全文摘要
本发明公开了一种三段式固态发酵生产α-半乳糖甘酶的方法，包括将黑曲霉(Aspergillus niger)接种到灭菌后的固态发酵培养基中，置于无菌环境下进行分段发酵，第一阶段发酵时间为22-26h，环境温度为26-30℃，环境湿度为60-70％；第二阶段发酵时间32-40h，环境温度为23-25℃，环境湿度为85-90％；第三阶段发酵时间为28-62h，环境温度为26-30℃，环境湿度为90-95％。本发明将固态发酵生产α-半乳糖甘酶的过程分成条件不同的三个阶段，与采用普通固态发酵法相比，该方法生产制得的产物α-半乳糖苷酶活力提高了40％左右，发酵时间缩短20h以上，而且操作简便，成本低，发酵过程稳定。
文档编号C12N9/40GK102286445SQ201110217500
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月1日 优先权日2011年8月1日
发明者何国庆, 阮晖, 顾丰颖, 高洁 申请人:浙江大学