专利名称：植物的一个锌指蛋白转录因子及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明公开了ー个大豆(67ァL)C2H2型锌指蛋白基因及其所编码的蛋白质，具体地讲涉及植物中编码正常和渗透胁迫条件下提高大豆对胁迫的耐性，以及其在培育抗逆性提高的转基因植物中的应用。属于分子生物学和生物技术领域
背景技术：
干旱、低温和高盐等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子，也是影响作物产量的主要非生物胁迫因素。植物在适应这些胁迫过程中产生了一系列从细胞到生理水平的应答反应，这些反应往往是通过基因表达的变化实现的，通过分离和鉴定非生物胁迫诱导的基因，并对这些基因功能的深入研究逐渐建立了ー个比较详细的胁迫信号转导网络体系(Xiong et al, 2002; Nakashima et al, 2006),在这个体系中，研究的比较清楚的是DREB类转录因子在这些信号转导途径中发挥的核心作用(Haake et al, 2002)，另ー些转录因子，如bZIP转录因子、MYB转录因子、MYC/b HLH转录因子、锌指蛋白在非生物胁迫中的作用也逐步被阐明(Zhang et al, 2004)。锌指蛋白(ZFP, Zinc Finger Protein)是ー类具有“手指状”结构域的转录因子，广泛參与到基因的转录、翻译、mRNA的运输、细胞骨架构建、细胞支持、蛋白折叠、染色质修饰等过程中，其特征是通过结合Zn2+来稳定ー种很短的可自我折叠成“手指”的蛋白结构(Benjamin et al, 2000)，根据半胱氨酸(C)和组氨酸(H)残基的数目和位置可将锌指蛋白分为C2H2，C2HC, C2C2等亚型，其中大部分锌指蛋白属于C2H2型。本研究克隆的锌指蛋白基因也属于C2H2型，是ー个单C2H2型的锌指蛋白，具有典型的植物特异“QALGGH”基序。最近几十年，科学家们对锌指蛋白研究的报道比较多，主要集中在单个基因的功能鉴定上，对其功能的分子机理报道偏少，如=Sun等(2010)研究发现过表达水稻Z/P779基因的转基因水稻植株盐胁迫耐性提高，并且对ABA高度敏感，表明该基因在植物的盐胁迫响应过程中发挥了重要的作用；Sultan等报道了具有EAR基序的锌指蛋白Zat7在拟南芥的盐胁迫应答过程中起了关键作用；Davletova等(2006)发现拟南芥Zatl2在活性氧和非生物胁迫信号传导过程中起着核心的作用；Mittler等(2006)发现拟南芥ZatlO在非生物胁迫过程中同时起着正调节和负调控的双重作用，过表达和抑制表达都能大大地提高植物对外界逆境的耐性；Sakamoto等发现转拟南芥AZF2和STZ的过表达植株尽管增强了干旱的耐性，但植株显示了发育延迟现象，表明他们在发育过程中起着转录抑制子的作用(Sakamoto etal) ；Huai等报道了转玉米み ZR基因的拟南芥植株幼苗增强了对盐和干旱胁迫的耐受能力(Huai et al, 2009) ; Tian分离了ー个新的马铃薯泣基因，转该基因的拟南芥植株提高了对盐和干旱胁迫的耐性，并且是通过依赖ABA的途径来作用的(Tian et al, 2010);Pan等首次从核桃中分离出第一个锌指蛋白基因AhZFPl，表达分析表明该基因受盐胁迫诱导的(Pan et al, 2010) ；ffang等分离了松树基因，转该基因的烟草增强了对盐胁迫的耐性(Wang et al, 2002) ;Liu等通过RACE技术分离了故·Ζ/Ρ基因，过表达该基因的烟草提高了盐胁迫的耐性，但生长受到了抑制(Liu et al, 2010);近几年以来，科学家们在分子机理研究方面也取得了长足的进展，如=Huang等(2009)鉴定出一个水稻锌指蛋白，它通过直接调控双氧水代谢相关基因进而调节叶片气孔的密度和关闭来改善水稻的抗旱和耐盐性，该蛋白可以直接结合到活性氧合成(ROS)相关基因启动子“TGCTANNATTG”基序，使植物体内达到氧化-还原的稳态平衡来发挥功能；在大豆上,Kim等(2001)从大豆cDNA文库中分离到了一个冷诱导的锌指蛋白基因5T6F-7，SC0F-1不能直接与冷调节基因启动子区的顺式作用元件以及ABA应答元件ABRE结合，但SC0F-1可与一个bZIP转录因子SGBF-I互作，以增强SGBF-I与ABRE元件的结合能力，从而促进基因的表达，转基因实验已经证实SCOF-I的过量表达可以增强拟南芥和烟草的耐冷性。
发明内容
本发明的目的在于公开一个大豆 ^r.L)C2H2型锌指蛋白基因及其所编码的蛋白质，该基因来自大豆，可作为目的基因导入植物，提高植物耐干旱性，进行植物品种改良。本发明公开了一个普通栽培大豆{Glycine max. L) C2H2型锌指蛋白基因GmZFP{line Finger protein)及其所编码的蛋白质,是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质
a)序列表中的SEQID N2 1 ；
b)将序列表中SEQID N2 :1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的氨基酸残基序列。其中，根据http://prosite. expasy. org/提供的软件预测表明，序列表中的SEQID N2=I由257个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)第97位至第124位氨基酸残基为保守的C2H2-type锌指状结构域。所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。在栽培大 的Iv锋指蛋白转录因子中所述蛋白质具有序列表中SEQ ID N2 I的氨基酸残基序列。一种上述植物的一个锌指蛋白转录因子的编码基因，其特征在于
a)序列表中SEQID N2 2的DNA序列；
b)编码序列表中SEQID N2=I蛋白质序列的多核苷酸序列；
c)在高严谨条件下可与序列表中SEQID N2 :2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。所述高严谨条件为在O. IXSSPE (或O. 1XSSC)，0. 1% SDS的溶液中，在65°C条 件下杂交并洗膜。列表中的SEQ ID Ne 2由774个脱氧核苷酸组成，其编码序列为自5’端第I位至774位脱氧核苷酸，编码具有序列表中SEQ ID Ne :I的氨基酸残基序列的蛋白质。含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。本发明的另一目的是提供一种将本发明中的锌指蛋白类转录因子GmZFP在调控植物抗逆性的应用。
本发明所提供的调控植物抗逆性的应用，是将所述编码栽培大豆锌指蛋白类转录因子的基因GmZFP导入植物组织或细胞，植物抗逆性获得调控。所述编码栽培大豆锌指蛋白类转录因子基因可通过含有GmZFP的植物表达载体导入外植体；用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种双兀农杆菌载体或可用于植物所用的表达载体可使用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体等。转化方法可用经农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法或其它方法转化植物。如PBI121、PEarlyGatel03和pHeIIsGate12或其他衍生植物表达载体；使用本发明的GmZFP构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何ー种组成型、组织特异型、诱导型或增强型启动子；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入具有抗性的抗生素标记(卡那霉素、潮霉素等)或抗化学试剂标记基因(如抗除草剂bar基因等)及可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或蛋白等(GUS基因、GFP基因等)。上述通过转基因调控植物抗逆性的方法对所有植物均适用，既可适用于单子叶植物(小麦、水稻、玉米等)，也可以适用双子叶植物(烟草、棉花、大豆等)。
本发明提供的基因来自栽培大豆，实时定量PCR检测结果表明在大豆植株的叶、茎和根中均有表达，其中在叶中的表大量最高；在干旱胁迫下，该基因的表达呈现先下调后上升的趋势，表明其受干旱的的诱导，与抗旱性有关。转基因组合植株实验证明该基因的抑制表达提高了大豆植株抗旱性。因此，ァ可作为目的基因导入植物(包括单子叶和双子叶植物)，提高植物耐旱性，具有较高的实际应用价值。
图I为GmZFP与其他植物锌指蛋白结构域氨基酸序列的多重比对结果；
图2为GmZFPmRNA在不同组织器官中表达丰度的实时半定量PCR检测结果；
图3为干旱胁迫对GmZFPmRNA表达影响的实时定量PCR检测结果；
图4为GmZFP植物过表达和抑制表达载体物理图谱；
图5为GmZFP转基因大豆组合植株的耐旱实验结果；
图6为GmZFP转基因的电泳图。
具体实施例方式 下述实施例中的方法如无特别说明，均为常规方法。实施例I
扫描大豆全基因组中可信度高、贡献率大(对产量指标)的抗或耐旱QTLs，并且结合全基因组芯片結果，对候选QTL区间所包含基因进行功能预测，即BLASTX分析，利用生物信息学软件构建这些基因理论上的相互作用或调控网络，然后对这些基因在干旱胁迫条件下的RT-PCR进行初筛，所有在胁迫下具有相应的基因作为候选抗或耐旱基因。结果发现ー个编码锌指蛋白的基因，其mRNA表达分析表明该基因是组成型表达的，在各个大豆器官中都有表达(如图2所示)；在干旱胁迫下，该基因的表达呈现先下调后上升的趋势(如图3所示)，然后通过生物信息学结合RT-PCR的方法获得其全长cDNA，测序验证，BLASTP结果表明其是ー个编码C2H2型锌指蛋白的基因，表明成功地克隆了该基因。.材料与方法
I.I材料、菌株、试剂大豆材料为苏豆3号、大肠杆菌菌株DH5a和DB3. I为本实验室保存。pGEM_T EasyVector T 克隆试剂盒、Taq 酶、DNA marker、Real-time-PCR 试剂盒购自 TaKaRa 公司，Trizol reagent, T4 DNA连接酶来自Fermentas公司，反转录试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司，引物由上海英俊生物技术有限责任公司合成，DNA纯化回收试剂盒购于Promega公司，其它生物学试剂购自上海暗嘉科技发展有限公司。. 2材料处理
待大豆材料苏豆3号幼苗长至3-4片真叶时将根部浸入质量体积分数为20%PEG-6000溶液中浸泡Oh，2h, 4h, 12h和48h，用水(Mock)处理作为对照，将处理后的根和叶片组织冻于液氮中，保存在-70 0C冰箱。于2010年夏天取大田中种植的大豆植株的幼嫩根、茎、叶、花和豆荚组织，保存备用。. 3总RNA提取和c DNA合成
样品在液氮中研磨后用Trizol (Invitrogen)提取,经DNasel消化去除DNA,并经
I.2%的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的浓度和完整性。cDNA合成采用上海捷瑞生物工程有限公司反转录试剂盒。. 4基因克隆
正向引物SEQ ID Ne :3
5’- ATGGATCTTCAAAGGCAAGAGTCA _3’
反向引物SEQ ID N2 :4 5，-TTAGAGCTTAAGGGACAAGTCAAG-3，
利用RT-PCR方法从经PEG处理12h后的根部组织mRNA中扩增全长cDNA，同时利用基因组为模板扩增基因全长DNA序列，所用引物为SEQ ID N2 :3和SEQ ID N2 :4，扩增体系为。0應稀释样，适量；10\卩0 Buffer, 2. 5ul ；dNTP (10 mM), O. 5 ul ；MgCl2(25 mM), I. 5u
I；Primer F (10 mM),Iul ；Primer R (10 mM),Iu I ；Taq polymerase(5 Uml-1),0. 2 ul ；ddh2o补足至25ul。反应程序为94°C预变性3min ;94°C变性45秒，55°C复性45秒，72°C延伸lmin，35个循环；72°C延伸IOmin0 PCR产物连入pGEM_T Easy Vector T克隆试剂盒载体中，送给南京金思瑞生物科技有限公司测序，重复3次，获得基因序列。. 5序列分析
采用BLAST X和BLAST P搜索NCBI的核苷酸和蛋白质数据库，进行序列相似性分析及氨基酸保守性预测；用Clustal X进行氨基酸序列比对及功能结构域查找与相似序列分析；结果表明，该蛋白氨基酸序列与蓖麻OzPicizw1S comnunis)、葡萄(Vitis vin if era)
申对 iPopulus trichocarpa)、苹果 iMalus x domes tics )、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和玉山篌子芥lyrata subsp. Zjraia)等的锌指蛋白基因均有较高的相似性，都在氨基酸110-150之间具有一个保守的锌指结构域(如图I所示)。. 6基因表达分析 上游引物SEQ ID Ne: 5
5，- ATCAACACTCAAACAAAGACGAA -3，
下游引物SEQ ID Ne :6
5’- GAGTATGTGTGTCCAAAATCTGC -3’
Tubulin-F SEQ ID N275’- AACCTCCTCCTCATCGTACT -3’
Tubulin-R SEQ ID N2 85’- GACAGCATCAGCCATGTTCA -3’
PEPC-F SEQ ID N29
5’- TTCCTTTATCAGAAATAACGAGTTTAGCT -3’
PEPC-R SEQ ID N210
5’- TGTCTCATTTTGCGGCAGC -3’
采用半定量RT-PCR分析法，根据cDNA序列设计引物，所用引物序列为，SEQ ID N2: 5 ；SEQ ID N0 6,所用内參引物 Tubulin-F SEQ ID N0 7 ； Tubulin-R SEQ ID N0 8 ；Real-time-PCR在荧光定量PCR仪(罗氏公司)上进行，所用大豆内參基因PEPC-F: SEQID N2 9 ；PEPC-R: SEQ ID N2 :10作为平行反应。采用Real-time-PCR试剂盒中提供的Mix，反应组分加在专用的定量PCR毛细管中。各组分的体积和浓度如下(25ul):稀释后的 cDNAlul ;PrimerF (10 mM) Iul ；PrimerR(10 mM) Iul ;加 Mix 至 20ul。PCR 反应程序为95°C预变性3min ;然后按94°C变性10s，56°C退火20s，72°C延伸40s，80°C Is收集荧光，读板(Plate read)的程序进行40个循环，之后72°C延伸10 min。最后从65°C开始，以每步
0.5°C的速度升高至95°C，每个温度保持ls，来绘制熔点曲线。计算公式如下目的基因相对表达量=2_AGt (ACT= Ct目的基因Ct PEPC)，实验重复三次，最后取平均值进行显著性和方差分析。显著性测验采用方差分析软件分析完成。. 7载体构建
正向引物SEQ ID Ne=Il
5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGCCTTCTGAAAATTTGA _3’
反向引物SEQ ID Ne: 12
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGCTTAAGGGACAAGTCAAG-3，
參照 Invitrogen 公司 Gateway BP ClonaseTM II Enzyme Mix 和 Gateway LRClonaseTM II Enzyme Mix试剂盒说明，将GmZFP全长ORF片段克隆到中间载体pD0NR221，进而置换入植物表达载体PEARLYGATE103 (含有GFP)。构建的质粒pEARLYGATE: :GmZFP通过冻融法转入根癌农杆菌菌株tumefaciens EHA105,正向引物SEQ ID N2:11;反向引物SEQ ID N2 :12，构建好的载体以备后续基因功能验证(如图4所示)。实施例2
运用Hairy Root实验体系，包括离体和在体两类，ー类是豆瓣体外菌液注射发根验证；另ー类是在体注射菌液发根然后再生苗，获得转基因组合植株后，对它们进行抗或耐旱鉴定；通过Gateway技术分别构建以pEarlyGatel03和pHellsGatel2为基础的植物过表达载体和抑制表达载体，通过冻融法转入发根农杆菌K599，通过注射的方法获得转基因组合植株(根为转基因，其它为非转基因)，结果发现与空对照和过表达该基因的植株相比，该基因的抑制表达植株对PEG(20% m/v)溶液的胁迫具有较强的耐受性(如图5实物所示)，表明该基因在植物的抗旱胁迫过程中起着负调节作用。功能初步鉴定
2.I植物材料
植物材料为大豆幼苗，将大豆种子点播于蛭石沙子(3:1)的基质中，浇水并在光照培养箱(宁波海曙赛福实验仪器厂)中培养，培养条件为25-28°C，每日光照12小时，光照强度为20001uX，待苗长至4-5厘米时以备后续注射所用。菌液培养与注射
从平板上挑取单菌落K599 (含大豆锌指蛋白基因表达载体)置于加有Iml液体LB (附加Kan50mg/L)的15ml管中，28°C摇床上200rpm摇l_2d，然后吸取2ml离心，沉淀用IOm M硫酸镁溶液重旋，再离心一次，然后用硫酸镁稀释至0D600约O. 8-1. O ;用O. 025ml量程微型注射器吸取菌液，在 大豆子叶节部位注射，注射大约3-4个孔，然后放置在加有水的小烧杯内，用塑料膜封口，在光照培养箱中(12h光照/12h黑暗)28°C培养。组合苗生长管理
大致培养5-7天时，注射的孔部长出根之后，随后揭掉塑料膜，剪掉原有的根系，在Hoagland营养液中培养至根部足够健壮时为后续研究所用。组合苗阳性植株鉴定 35S 正向引物 SEQIDNe:13 5，-ACTCGCCGTAAAGACTGG -3，
基因反向引物SEQIDNe:14
5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTGAGCTTAAGGGACAAGTCAAG _3’
DNA采用CTAB法提取，O. 8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。PCR反应总体积为20μ ，模板 DNA(20ng/^L) μ ，正反向引物(ΙΟμΜ)各 O. 4μ1，IOxPCR Buffer 2μ1, MgCl2(25mM)I. 6μ1, dNTP (IOmM) I. 6μ1, rTaq(5U/^L) O. 2μ1, ddH20 12·8μ1。反应程序 94°C预变性4min，35个循环94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸50s，72终延伸IOmin0所用引物为35S正向引物SEQ ID Ne:13和基因反向引物SEQ ID N2 :14组合扩增来进行验证。结果表明上述植株与对应转基因载体互相对应，即转基因植株可以成功扩增出目的条带，而阴性对照则没有(如图5中电泳图所示)。实施例3
对该基因通过农杆菌介导的方法转入栽培大豆，然后对抗旱的生理生化指标进行测定和研究其耐旱的分子机理，同时创造新的抗或耐旱种质资源，为育种提供桥梁亲本。该部分结果正在进行之中。综上所述，本发明人提供的基因是首次大豆中分离的新基因，其功能参了大豆的抗、耐旱等逆境胁迫的应答。本发明的GmZFP基因来自大豆，具有适合于双子叶植物表达的优化密码子，其基因工程受体植物除了单子叶植物水稻、玉米、小麦外，更加适合于双子叶植物，如大豆、棉花、烟草等。
权利要求
1.植物的一个锌指蛋白转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质 a)序列表中的SEQID N2 1 ； b)将序列表中SEQID N2 :1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的氨基酸残基序列。
2.根据权利要求I所述的植物的一个锌指蛋白转录因子，其特征在于所述蛋白质具有序列表中SEQ ID Ne: I的氨基酸残基序列。
3.—种如权利要求I或2所述植物的一个锌指蛋白转录因子的编码基因，其特征在于 a)序列表中SEQID N2 2的DNA序列； b)编码序列表中SEQID N2=I蛋白质序列的多核苷酸序列；c)在高严谨条件下可与序列表中SEQID N2 :2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述编码基因的表达载体。
5.含有权利要求3所述编码基因的细胞系。
6.含有权利要求3所述编码基因的宿主菌。
7.—种如权利要求I或2所述的栽培大豆的一个锌指蛋白转录因子的应用，其特征在于将锌指蛋白转录因子的编码基因导入植物组织或细胞，提高植物的抗逆性。
8.根据权利要求7所述的栽培大豆的一个锌指蛋白转录因子的应用，其特征在于所述的植物为单子叶植物或双子叶植物；所述的抗逆性为耐旱或耐盐性。
全文摘要
本发明涉及植物的一个锌指蛋白转录因子，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质a)序列表中的SEQIDNO1；b)将序列表中SEQIDNO1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有转录激活功能的调控植物抗逆性的氨基酸残基序列。本发明的蛋白质及其编码基因能够增强植物对逆境的耐性，尤其是增强对干旱胁迫的抗性。
文档编号C12N15/63GK102659934SQ20111023378
公开日2012年9月12日 申请日期2011年8月16日 优先权日2011年8月16日
发明者何晓兰, 张大勇, 徐照龙, 易金鑫, 许玲, 阿里, 黄益红 申请人:江苏省农业科学院