专利名称：一种不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程杀虫剂及其制备方法
技术领域：
本发明属于苏云金芽孢杆菌基因工程菌安全应用领域，涉及苏云金芽孢杆菌工程菌及其制剂的处理方法，及由该方法所获得的产品。
背景介绍苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌。大部分菌株在芽孢化期间产生一种或多种伴孢晶体，这些晶体由杀虫晶体蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins，简称ICPs)组成，杀虫晶体蛋白为杀虫的主要成分。伴孢晶体被目标害虫吞食后，ICPs在消化道中被降解为具有杀虫活性的小分子多肽，再与中肠上皮细胞BBMV(Brush border membrane vesicles)上的受体结合，造成细胞膜形成孔道、上皮细胞渗透压破坏及细胞溶解，最终导致细胞死亡(龙綮新、庞义，1994)，不同来源的Bt菌株的ICPs其杀虫谱不同，但作用机理基本相同。苏云金杆菌制剂目前世界上应用最广泛，使用面积最大的一类微生物杀虫剂，其应用量占整个生物杀虫剂的90%。但是由于 Bt存在杀虫谱比较窄，只能对一种或几种害虫有效，且目前发现一些害虫对Bt产生了抗药性，限制了 Bt的应用于推广。为了解决Bt使用过程中出现的一些问题，提高ICPs的杀虫毒力同时避免害虫抗药性的产生等问题，构建高效Bt工程菌已经成为Bt的研究热点，2001 年庞义研究小组利用Tn917转座子通过转座作用成功地将来源于以色列亚种Bti的两个杀蚊蛋白基因整合到库斯塔克亚种Btk染色体中，成功构建了既杀鳞翅目昆虫又杀双翅目昆虫的高效稳定的Bt工程菌株TnY和高效专性杀蚊幼虫的工程菌株TnX (Yu et al.，2001)， 并获得中国发明授权专利。其中TnX比现有商品化的以色列亚种4Q2的杀虫毒力高1. 82 倍，因此极具商品化潜力。虽然通过基因工程的方法构建的Bt工程菌，在杀虫毒力、晶体蛋白产量、扩大杀虫谱等方面都有不同程度的提高，但工程菌释放到环境之前必须确保工程菌株对环境是安全的。通常那些通过基因工程手段构建的高毒力Bt工程菌株，构建过程中常含有抗性筛选标记如红霉素抗性基因Em等，使得这些工程菌制剂在生产、注册和应用上受到限制。 抗生素抗性致病细菌的出现引发生物安全问题受到人们的关注，具有抗性的微生物一旦进入环境就很难回收及控制，且可能会与亲缘性相近的微生物之间进行基因间水平转移 (horizontal gene transfer，HGT)，基因水平转移是微生物之间拥有抗生素抗性基因的主要机理，并且已经证明抗生素抗性基因已经发生在非病原菌、病原菌之间，甚至相关的微生物之间，诸如革兰氏阳性菌和阴性菌之间都有可能发生，因此一些致病的微生物具有抗生素抗性基因，进一步增加了风险评估的复杂性。苏云金芽孢杆菌和与人类相关的致病菌炭疽杆菌(Bacillus anthracis)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)同属亲缘较近的芽孢杆菌类(Rasko et al. 2005)，Bt的最大区别在于芽孢分化期能够产生伴孢晶体，而伴孢晶体早已证明是安全的，所以Bt可以作为生物农药用于田间。为了能够保证将Bt工程菌释放到环境中是安全的，国内外学者已经尝试各种各样的方法。
1990年，美国Mycogen公司发明了一种生物囊技术，将携带ICP基因的质粒导入荧光假单胞杆菌，发酵后通过物理和化学的方法致死菌体，形成带有杀虫晶体蛋白的死菌体包囊系统。另外，2005年，Gunjan Pandey提出采用自杀式基因工程菌，但很难找到合适的基因，且有可能造成Bt工程菌的毒力下降。众所周知，苏云金芽孢杆菌中的主要杀虫成分为ICPs，而芽孢是为了抵御不良的环境条件所必须的，只要芽孢失活，Bt就不能存活。为此，通过杀死基因工程菌中的芽孢就可以保证释放到环境中的Bt是安全的。1993年崔云龙、邵宗泽用优氯净(二氯异氰尿酸钠)、紫外线处理苏云金芽孢杆菌试图灭活芽孢，但同时也使得晶体蛋白难溶于昆虫胃液或碱液，毒力显著下降。1996 年，申继忠提出双氧水能够使伴孢晶体蛋白的一级结构受到破坏，但同时毒力片段数量减少。2002年，Becker提出采用Co6tlY-射线处理苏云金芽孢杆菌以色列亚种(Bacillus thuringiensis israelensis)，在20KGY的辐射剂量时，可以全部杀死芽孢，但对伊蚊幼虫杀虫毒力下降20 30% (Becker, 2002)，而我们采用动态Co6° Y -射线辐照的方法来分别处理工程菌株TnY (Yu，Pang et al.，2001)，杀虫毒力并不下降，通过统计学分析，辐射处理前后杀虫毒力无显著性差异。
发明内容
本发明的目的在于针对目前苏云金芽孢杆菌基因工程菌株因含有抗性筛选标记基因或其他外源基因而使生产、注册和应用上受到限制的问题，发明提供一种不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程菌制剂的制备方法，该方法简单易行、且处理前后杀虫效果无显
著变化。本发明通过以下技术方案实现上述目的
发明提供了一种不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程菌及其商品制剂的制备方法，是采用动态CcT Y -射线或Cs137 y -射线辐射处理苏云金芽孢杆菌产品，所采用的辐射剂量为 14 21KGY。所采用的Bt基因工程菌制剂可以是多种类型的，比如可以采用6tlCo或137Cs γ -射线照射基因工程菌的可湿性粉剂、油悬浮剂、漂浮剂、水悬浮剂、胶囊制剂、菌苔或其发酵液等。处理时，将所要处理的各种制剂放入辐照箱(井)内进行辐照处理，Y-射线因其穿透力强，可将纸皮、锡箔等材料包装完好的制剂直接进行辐射灭菌，无需拆包，简单、方便。Co60 Y -射线或Cs137 Y -射线辐射处理各种基因工程菌菌株及其制剂，完全杀死芽孢所需辐射剂量因菌株及其剂型的不同而有所区别，在采用6tlCo Y-射线或137Cs Y-射线辐照处理时需控制辐射剂量，辐照超过制剂的最大耐受辐射剂量，对制剂的杀虫有效成分和包装将产生不良影响，而辐射剂量不足又会造成芽孢不能够彻底失活。以下是所使用的辐射剂量范围
对鳞翅目害虫有效的工程菌14 17KGY ； 对双翅目害虫有效的工程菌19 21KGY。为了确保芽孢灭活的保险系数，可在致使芽孢全部死亡的辐射剂量上增加5 10%左右，可以使制剂能够更加安全的应用于生产，不会在环境和非靶标生物中存在安全係 急^^ ο本发明发现，在苏云金芽孢杆菌工程菌株芽孢失活的同时，其伴孢晶体(含杀虫晶体蛋白)可以保持原有的物理状态。本发明还首次发现，这种状态下的苏云金芽孢杆菌产品，尽管不含具有生命活性的菌体或芽孢，但是这并不影响杀虫晶体蛋白发挥其杀虫作用。通过生物测定显示，Co6° γ -射线辐射处理的无活性芽孢的基因工程菌及其制剂与未经辐射处理的制剂在杀虫毒力上无显著性差异。通过Co6° γ -射线或Cs137 Y -射线辐射处理苏云金芽孢杆菌基因工程菌培养(发酵)成熟产物或者商品制剂，可完全杀死芽孢或抑制其萌发，无活性芽孢的苏云金芽孢杆菌工程菌制剂由于不含具有活性的菌体或芽孢，因此在田间施用时不存在生物安全性方面的顾虑；同时辐射处理的苏云金芽孢杆菌工程菌制剂由于无活性芽孢，不能进行培养繁殖， 因此可以更好地保护苏云金芽孢杆菌高毒力菌株的产权，同时还可以消除高毒力基因工程菌株的抗性筛选标记或其他外源DNA在生产、注册和应用上受限制的缺点。迄今为止，国内外尚未发现一种既能解决Bt工程菌安全释放到环境中又能保持高杀虫毒力的方法。而本发明首次发现，通过Co6° Y -射线或137Cs γ -射线动态辐射处理Bt 产品，可简便获得无活性芽孢的苏云金芽孢杆菌工程菌制剂，并可保持原有杀虫晶体蛋白等杀虫成分的杀虫活性。本发明同时发现，采用Co6° Y -射线辐射处理Bt产品的效果极为优越。Co6° γ -辐照灭菌为冷灭菌，其穿透力强，且无残留，合适的辐射剂量能够有效的杀死苏云金芽孢杆菌工程菌的所有芽孢。Co6° Y-射线辐射灭菌是近年来发展较为迅速的一种灭菌方法。放射性同位素Co6° 衰变时可放射出Y-射线，Y-射线的能量高、穿透力强，可使细胞内各种活性物质发生化学变化，从而导致细菌损伤或死亡。经Co6° Y -射线辐射灭菌的物品温度升高很小，一般仅约5°C，故又称“冷灭菌”。由于Co6°-Y射线具有穿透力强，操作简便(无须打开包装，可直接照射包装物品)，费用低，速度快，可在常温下灭菌的特点，当辐射剂量适当时，不会破坏物质的有效成分，亦不会对人体产生伤害，能在灭菌后控制细菌的再增殖，因此，辐射处理在环保、医药、食品中得到广泛使用。Co60 γ -射线辐照主要是破坏细菌细胞中的DNA和RNA，受损的DNA和RNA分子发生降解，失去合成蛋白质和遗传的功能，使细胞死亡。或者是射线使细菌细胞内的水分子产生有活性的自由基，从而破坏了细胞体，达到灭菌目的。辐射处理是一种行之有效的食品和药品处理技术，CcT Y-射线辐射灭菌由来已久，最早是Mink在1896年提出来的，辐射灭菌用于保藏食品的报告最早见于1930年的美国专利集，在上世纪就已经用于药物和食品中微生物、螨类和虫类的处理，在食品上的使用最为常见，常用于储藏、灭菌、控制发芽、后熟及控制食物源性疾病等。但是采用Co6° Y -射线辐射处理苏云金芽孢杆菌工程菌株而达到安全释放目的目前还未有报道，在国内外尚属首例。由上述的方法所获得的杀虫剂，同样属于本发明的保护范围，它含有不具生命活性的苏云金芽孢杆菌菌体或芽孢或它们的组合，同时含有活性杀虫晶体蛋白，该杀虫剂可以是可湿性粉剂、油悬浮剂、水悬浮剂、胶囊制剂、菌苔或其发酵液。与现有技术相比，本发明具有以下优越效果
1、本发明提供了一种安全的苏云金芽孢杆菌工程菌及其制剂的处理方法，在充分利用其杀虫晶体蛋白的杀虫活性时，不存在活性菌体及其芽孢，不会带来生物安全方面的问题，具有更高的安全性。2、芽孢完全被灭活的苏云金芽孢杆菌制剂，能够有效地保护发明者或拥有者的产权。同时还可以消除高毒力基因工程菌株的抗性筛选标记在生产、注册和应用上受限制的缺点。有效地防止物种之间基因的水平转移。3、本发明制备该苏云金芽孢杆菌基因工程菌杀虫剂的方法，系采用合适辐射剂量 Co60 Y -射线或Cs137 Y -射线处理Bt菌体及其制剂，即可有效的杀死苏云金芽孢杆菌及其所有芽孢，并且不会降低杀虫晶体蛋白的杀虫活性；该方法无需提取晶体蛋白，大大简化了制备过程，降低了生产成本。4、本发明采用辐射处理方法来获取的苏云金芽孢杆菌基因工程菌杀虫剂，操作简单，且可以大批量的处理产品，时间快，无需打开包装，可避免二次污染。
具体实施例方式为了更好地理解本发明的实质，下面用实例详细说明发明的技术内容，但发明的内容并不局限于此。实施例1
TnY(菌种保藏于中国典型培养物保藏中心，武汉大学，保藏号=CCTCC M98017)为庞义研究小组构建的Bt基因工程菌株(Yu et al. 2001)，记载于申请号为98122231. 5的专利文献中，由于该菌株含有红霉素抗性基因，在生产、注册和应用上受到一定限制，为此选用此菌株作为该处理方法的使用菌株，以便能够消除抗性但不丧失杀虫活性。以下是对辐射剂量对Bt工程菌芽孢存活情况及辐射处理后杀虫毒力下降率的同非工程菌株的比较情况 (表1、表2)。表1 辐射处理剂量对芽孢存活情况
权利要求
1.一种不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程杀虫剂的制备方法，其特征在于采用 Co60或Cs137 Y-射线处理具有红霉素抗性基因的苏云金芽孢杆菌工程菌，获得不含活菌的苏云金芽孢杆菌基因工程菌杀虫剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于采用Co6tl或Cs137Y-射线处理工程菌时，辐射剂量为14KGY 25KGY。
3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于采用Co6°Y-射线照射苏云金芽孢杆菌工程菌iTnY。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于采用CcT射线照射苏云金芽孢杆菌工程菌TnY时，辐射剂量为1Γ25 KGY。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的辐射剂量为1411KGY。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的辐射剂量为1Γ17KGY。
7.—种如权利要求1所述的方法获得的杀虫剂，其特征在于该制剂含有不具有生命活性的苏云金芽孢及其菌体，同时含有活性的杀虫晶体蛋白成分。
8.如权利要求7所述的杀虫剂，其特征在于该杀虫剂是发酵液、菌苔、可湿性粉剂、悬浮剂、漂浮剂或胶囊制剂。
全文摘要
本发明属于基因工程菌杀虫剂安全应用领域，公开了一种苏云金杆芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，简称Bt)基因工程菌的处理方法及其用该方法获得的产品。该方法是采用Co60或Cs137γ-射线处理苏云金芽孢杆菌基因工程菌及其制剂，辐射剂量为14~21KGY，由此处理后的Bt基因工程菌及其制剂不含有活性的芽孢，而含有活性杀虫晶体蛋白等杀虫成分。本发明处理后的Bt工程菌制剂，在充分利用其杀虫晶体蛋白杀虫活性的同时，不存在活菌，因而在环境中释放时不会带来生物安全方面的问题。经过适量辐射处理Bt工程菌制剂的方法简单易行，在完全杀死芽孢的同时，辐射处理前后杀虫毒力无显著差异。
文档编号C12N13/00GK102321608SQ201110265289
公开日2012年1月18日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者孙士锋, 孙钒, 庞义, 李广宏, 杨凯, 袁美妗, 钟镇芳 申请人:中山大学, 惠州海纳粮油食品有限公司