专利名称：高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物的制作方法
技术领域：
本发明属于环境生物工程，具体涉及高效降解环境中残留的有机磷农药的混合菌剂。
背景技术：
我国是一个农业大国，农药的生产量和使用量均呈逐年递加之势。农药在农业生产上的大量应用，对于防治农作物病虫害方面起到了极其重要的作用，为粮食丰收提供了可靠的保证。但是，长期大量地使用农药使得环境中的农药污染日益严重，危及人们身体健康、食品安全及其他环境问题。有机磷类农药得到长期、广泛、大量的应用，其中毒死蜱是世界上使用量最大的农药之一。在我国，毒死蜱是甲胺磷和甲基对硫磷等高毒农药的新型高效、低毒替代品种，生产量和使用量很大。虽然毒死蜱是低毒的农药，但是使用量之大、使用范围之广，已对我国大部分地区的土壤、水体造成了严重的污染。存储在土壤、水体中的毒死蜱不仅对动植物、微生物等生命体产生毒害作用，而且，毒死蜱还直接和间接地影响了人类的健康，所以，需要研发高效清除毒死蜱等有机磷残留污染的生态修复技术，为农业安全生产和环境安全提供技术支持和参考。国内外一般采用的技术，是从长期受有机磷农药污染的环境中筛选出降解残留农药的高效菌株，制成微生物制剂或酶制剂，将该类菌剂应用到受农药污染的土壤和水体中， 降解残留的有机磷农药，实现生物修复。该类技术和菌剂是一种可靠低成本的措施。在有机磷农药残留的生物修复领域中存在以下主要问题。①、不同环境中有机磷农药残留的浓度存在差异，不同实验室筛选获得的菌株的降解能力也存在差异，有的菌株对10mg/L 50 mg/L低浓度的有机磷残留降解较快，有的菌株对50mg/L 100 mg/L的较高浓度的有机磷残留降解较快，使用这类单一菌株的制剂，不易快速清除环境中的有机磷农药残留。②、现有的技术中缺乏快速降解高于100 mg/L有机磷农药残留的高效降解菌株。 ③、一般采用的菌株降解速度较慢，需要7天 30天以上的处理时间才能发挥充分降解效^ ο
发明内容
为了实现快速降解环境中的有机磷农药残留，本发明提供一种高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物，发挥不同微生物菌株活性，高效降解环境有机磷农药残留，实现污染的生物修复。具体操作方法如下
高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物包括下列A菌株、B菌株和C菌株 (1 )、A菌株为玫瑰红红球菌(Modococcus rhodochrous)R_D3菌株，可在24小时 48 小时内降解10mg/L 20mg/L的有机磷农药残留；
(2)、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌(汾e^oiroMoffloaas acidaminiphila) Gl菌株，可在 24小时 48小时内降解50mg/L 100mg/L的有机磷农药残留；(3)、C菌株为台湾嗜铜菌(JJupriavidus taiwanensis) Xl菌株，可在24小时 48小时内降解100mg/L 300mg/L的有机磷农药残留；
分别将三种菌株接种到LB液体培养基中，30°C 37°C、120转/分钟震荡培养M 小时 48小时，制得细胞浓度5. OX 108/mL 1. OXlO1VmL的A菌液、5. 0 X 108/mL 1. OXlO1VmL 的 B 菌液、5. OX 108/mL 1. OX 10lcl/mL 的 C 菌液；
A菌液、B菌液、C菌液按体积配比A :B :C为1 2 :1 2 :1 2混合均勻，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。本发明的多菌株组合物所能降解的有机磷农药包括毒死蜱、或甲基对硫磷、或马拉硫磷、或杀螟硫磷。将多菌株组合物释放到受有机磷农药污染的环境中，发挥多菌株组合物降解有机磷农药残留的生理功能，在2 4天的时间内，将残留的农药降解90%以上。本发明的多菌株组合物可应用的环境包括农田、或池塘、或果园、或草场、或河流、或人造水体。本发明的多菌株组合物可以制成悬浮细胞多菌株组合物，具体操作方法如下分别取IOOmL的A菌液、B菌液、C菌液，采取离心法获取菌液中的细胞，离心机转速为4000转 /分钟 6000转/分钟，离心15分钟 30分钟；弃上清液，用0. 85%的氯化钠溶液IOOmL 将离心沉淀的细胞悬浮，分别制得A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞；将A 菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞按照体积配比为A :B :C为1 2 :1 2 1 2混合均勻，制得悬浮细胞多菌株组合物。悬浮细胞多菌株组合物主要适用于对水体质量要求较高的城乡水体，包括池塘、 公园水面、河流。本发明的多菌株组合物可以制成固态多菌株组合物，具体操作方法如下 取所述A菌液100mL、B菌液100mL、C菌液IOOmL,混合，加入固态吸附剂150g、50g，混
勻，即得固态多菌株组合物；所述的固态吸附剂包括泥炭、草木灰、粉碎的作物秸秆。固态多菌株组合物的剂型主要适用于农田土壤，包括旱地、或水田、或果园、或草场。本发明使用的菌种已按专利法实施细则第二十五条第三款的规定在国家知识产权局专利局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国.武汉.武汉大学；玫瑰红红球菌(/Soi/ococc^s rhodochrous) R-D3菌株的保藏日期2010年9月15日， 保藏号CCTCC M 2010232，并附具存活性报告书；微嗜酸寡养单胞菌(SimoiroMoMWas
菌株的保藏日期2010年9月15日，保藏号CCTCC M 2010231，并附具存活性报告书；台湾嗜铜菌Wupriavidus taiwanensis) Xl菌株的保藏日期2010年9 月15日，保藏号=CCTCC M 2010233，并附具存活性报告书。本发明具有以下方面优越性
1、充分发挥具有不同降解特性的降解有机磷农药降解菌株的降解能力，可适应不同污染程度环境治理的需要；
2、制备的多菌株组合物可在1 7天内快速降解不同程度的有机磷农药残留，降解率达到95%以上，有效清除有机磷农药污染。
具体实施例方式下面对本发明作进一步地说明。实施例1 多菌株组合物对水样中100mg/L高浓度农药毒死蜱的降解 1.菌液制备
分别制备A菌液、B菌液和C菌液
(1)、A菌株为玫瑰红红球菌(Tfeoi/ococciAs rhodochrous) R-D3 菌株，
(2)、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌(汾eeoiroMoffloaasacidaminiphila ) Gl菌株，
(3)、C菌株为台湾嗜铜菌(Ci/priaridks taiwanensis) Xl 菌株，
制备LB液体培养基，分别从A菌株的斜面上、B菌株的斜面上和C菌株的斜面上无菌操作取一环菌种接种到LB液体培养基中；将接种后的培养基置于恒温震荡培养箱中培养， 培养条件为30°C、120转/分钟、培养M小时；分别制得细胞浓度5. OX IO9AiL的A菌液、 细胞浓度8. 0 X IOVmL的B菌液和细胞浓度6. 0 X 109/mL的C菌液，温度4°C备用。2.多菌株组合物制备
将A菌液、B菌液和C菌液按体积比1:1:2混合，即制得多菌株组合物，置4°C备用。3.多菌株组合物对农药毒死蜱的降解
取5支比色管，分别吸取lmg/mL的毒死蜱石油醚溶液500 μ L加入到比色管底，用洗耳球吹干；加入4. 5mL无菌基础培养基，即制得模拟农药毒死蜱水样；基础培养基的配方为 硫酸镁0. 4 g，磷酸氢二钾0. 2 g，硫酸铵0. 2 g，磷酸钙0. 08 g，磷酸亚铁0. 002 g，蒸馏水 1L, pH 7. 2，121°C灭菌 20 分钟。在第1支模拟农药毒死蜱水样中接入0. 5mL多菌株组合物，制得多菌株组合物降解农药毒死蜱水样；在第2支模拟农药毒死蜱水样只加入0. 5mL基础培养基为对照组；在另外3支模拟农药毒死蜱水样，分别接进A菌液、B菌液、C菌液0. 5mL，为单一菌株降解农药毒死蜱水样；以上所有处理体积为5mL，农药毒死蜱含量为lOOmg/mL ；将所有比色管置于 35°C、120转/分钟的摇床中避光培养M小时；
4.从水样中提取降解后的农药毒死蜱残留量
用石油醚萃取残留的农药毒死蜱。向所有水样中分别加入石油醚5mL，涡旋振荡2分钟，静置5分钟；待水样和石油醚分层，用胶头滴管吸取上层石油醚，经无水硫酸钠过滤至 IOmL容量瓶中，用石油醚将滤液定容至10 mL ；分别制得多菌株组合物降解后农药毒死蜱残留样品、单一菌株降解后农药毒死蜱残留样品和对照组残留样品；
5.测定农药毒死蜱残留量
采用气相色谱法测定多菌株组合物降解后农药毒死蜱残留样品中农药毒死蜱的残留量和对照组残留样品中的残留量；
气相色谱工作条件用氮气作载气，流速27 mL ^irT1,柱流量4. 00 mL ^mirT1 ；进样口 SPL，分流比1 :5，进样体积1 μ L ；色谱柱=Agilent DB-5毛细色谱柱，内径0. 23 mm、长度 30 m、膜厚0.25 μ m;使用E⑶检测器；进样口、色谱柱、检测器的温度分别为MO 210 "C >280 "C ；
计算多菌株组合物降解农药毒死蜱的降解率W
权利要求
1.高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物，其特征在于包括A菌株、B菌株和C 菌株(1)、A菌株为玫瑰红红球菌(Tfeoi/ococciAs rhodochrous) R-D3 菌株，(2)、B菌株为微嗜酸寡养单胞菌(汾eeoiroMoffloaasacidaminiphila ) Gl菌株，(3)、C菌株为台湾嗜铜菌(Ci/priaridks taiwanensis) Xl 菌株，分别将A菌株、B菌株和C菌株接种到LB液体培养基中，30°C 37°C、120转/分钟震荡培养24小时 48小时，制得细胞浓度5. OXlOVmL 1.0X IO1VmL的A菌液、5. OX IO8/ mL 1. OX IOicVmL 的 B 菌液、5. OX 108/mL 1. OX 10lcl/mL 的 C 菌液；A菌液、B菌液、C菌液按体积配比1 2 :1 2 :1 2混合均勻，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。
2.将权利要求1所述的多菌株组合物制成悬浮细胞多菌株组合物的方法，其特征在于具体操作方法如下分别取IOOmL的A菌液、IOOmL的B菌液、IOOmL的C菌液，分别离心获取菌液中的细胞， 离心机转速为4000转/分钟 6000转/分钟，离心时间15分钟 30分钟；弃上清液，用 0. 85%的氯化钠溶液IOOmL将离心沉淀的细胞悬浮，分别制得A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞；将A菌株悬浮细胞、B菌株悬浮细胞、C菌株悬浮细胞按照体积配比为A :B :C为1 2 :1 2 :1 2混合均勻，制得悬浮细胞多菌株组合物。
3.将权利要求1所述的多菌株组合物制成固态多菌株组合物的方法，其特征在于具体操作方法如下取所述A菌液100mL、B菌液100mL、C菌液IOOmL混合均勻，加入固态吸附剂150g、50g， 混勻，即得固态多菌株组合物；所述的固态吸附剂为泥炭或草木灰或粉碎的作物秸秆。
全文摘要
本发明涉及高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。该组合物由A菌株、B菌株和C菌株组成A菌株为玫瑰红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)R-D3菌株，B菌株为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)G1菌株，C菌株为台湾嗜铜菌(Cupriavidus taiwanensis)X1菌株；分别将A菌株、B菌株和C菌株接种到LB液体培养基中培养制得A菌液、B菌液、C菌液；将三种菌液按体积配比1～21～21～2混合均匀，得到高效降解环境有机磷农药残留的多菌株组合物。本发明的多菌株组合物可在1～7天内快速降解不同程度的有机磷农药残留，降解率达到95％以上，有效清除有机磷农药污染。
文档编号C12N1/20GK102296043SQ201110264880
公开日2011年12月28日 申请日期2011年9月8日 优先权日2010年9月17日
发明者吴祥为, 唐欣昀, 朱贝贝, 王道胜, 花日茂, 高婷婷 申请人:安徽农业大学