专利名称：从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法
技术领域：
本发明属于受溢油污染海水的生物降解处理技术领域，特别涉及一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。
背景技术：
近年来，随着世界各国对石油及其制品日渐增长的需求，在海上开采、装卸、运输以及利用石油过程中溢油事故时有发生，不但造成大量的原油流失，还对环境造成严重污染，日趋严重地威胁着海洋及陆域的生态环境，对海洋环境、自然资源和养殖资源等都有长期的危害，因此，海洋溢油污染已经成为人们必须面对的重大环境问题。在海洋溢油处理技术中，生物修复技术具有高效、经济、安全、无二次污染等特点，已成为现场去除海洋溢油污染的重要选择途径，特别是对机械装置无法清除的薄油层，同时又限制使用化学药剂时，运用生物修复可显出其更大的优越性。若在海洋溢油处理修复工程中使用内源微生物进行降解，由于内源微生物生长速度慢及活性低而修复的效率不高，因此，需要接种一些降解石油烃污染物的高效菌，即通过向海洋溢油环境中加入大量的可存活的并能表现降解活性的石油烃降解菌，以提高海洋中石油污染物的降解速率和程度。然而由于缺少高效的可应用于海洋溢油处理的石油烃降解菌，制约了海洋溢油生物修复技术的进一步发展和应用。因此，需要从海洋环境中分离与纯化出降解速率较快的纯菌株，然后再把它们应用于实际海洋溢油污染环境的生物治理，这对于治理和修复海洋溢油污染有重要的意义。但是常规分离与纯化降解菌株的技术无法适用于对海水中存在的石油烃降解纯菌株的分离与纯化。而且分离与纯化的环境条件及过程参数选定等都对分离与纯化出降解菌的降解效能有密切的关系，这些都需要经过一系列的试验研究后才能确定出最佳范围。
发明内容
本发明的目的提供一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。其具体步骤如下(1)选取海水样品4000mL，放置于4°C冰箱中保存备用；(2)向体积为2500mL的玻璃瓶中加入IOg原油，加入40mL正己烷溶解后均勻平铺于玻璃瓶瓶底，为除去正己烷将玻璃瓶开口放置3天；(3)向步骤⑵中的玻璃瓶中入500mL基础培养基、IOmL微量金属液和2mL维生素 c 溶液；其中基础培养基的组成为=NH4NO3 :2. Og · L-1，NaCl :10. 5g/L，KH2PO4 :2. 5g · L-1， FeCl3 :0. IOg · ΙΛ MgSO4 :3. 5g · Λ CaCl2 · 2Η20 :0. 15g · L—1 ；微量金属液的组成为: CoCl2 · 6H20 :45mg ·厂1，CuCl2 :0. 25mg ·厂1，H3BO3 :6. 5mg ·厂1，MnCl2 · 4H20 :35mg ·厂1， Na2MoO4 · 2H20 :3. 5mg · Λ NiCl2 · 2H20 :2. 5mg · Λ ZnCl2 :3. 5mg · L-1 ；(4)向步骤(3)中的玻璃瓶内接入步骤(1)中海水样品IOOOmL,然后置于温度为 10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养10 12个月，为维持玻璃瓶内液体总量不变，每隔一周补充步骤(1)中海水样品；(5)向体积为250mL的锥形瓶中加入1. Og原油，加入4. OmL正己烷溶解后均勻平铺于锥形瓶瓶底，为除去正己烷将锥形瓶开口放置2天；(6)向步骤(5)中锥形瓶中加入50mL基础培养基、1. OmL微量金属液和0. 2mL维生素c溶液；(7)向步骤(6)中锥形瓶中接入经步骤(4)处理后玻璃瓶内的溶液5mL，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天；(8)按接种体积比为50 1的比例将步骤(7)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤 (5)至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天，(9)按接种体积比为50 1的比例将步骤⑶中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤 (5)至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天；(10)重复步骤⑶和(9)三次，每次在进行步骤⑶时，以步骤(9)中锥形瓶内的溶液代替步骤(7)中锥形瓶内的溶液；(11)向体积为IOOOmL的玻璃瓶内加入800mL基础培养基、20. OmL微量金属液、
4. OmL维生素c溶液，摇勻后作为液体培养基备用；(12)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(11)配制的液体培养基和 0. 60g琼脂，然后在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65 70°C时，在超净工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中放置2天；(13)在超净工作台中向步骤(12)中的培养皿中加入1. 5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，来回倾斜转动培养皿使溶有原油的正己烷溶液均勻分布，为除去培养基表面的正己烷将该培养皿在超净工作台中放置2天；(14)向体积为25mL的锥形瓶内加入IOmL按步骤(11)配制的液体培养基和0. 25g 琼脂，在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38 40°C ；(15)在超净工作台中向步骤(14)的锥形瓶中加入ImL步骤(10)中锥形瓶内的溶液，摇勻后吸取ImL慢慢加入步骤(13)中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使培养基溶液均勻分布；将培养皿放入温度为15°C的培养箱中培养观察，9 13天后便可发现有明显的菌落出现；(16)在超净工作台中向体积为25mL的锥形瓶中加入1. 5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；(17)向步骤(16)中的锥形瓶内加入IOmL按步骤(11)配制的液体培养基；(18)在超净工作台中挑取步骤(1 培养皿中的菌落，将其接种至步骤(17)中的锥形瓶中，在温度为10 15°C、转速为lOOr/min的振荡器中培养4 6天；(19)将步骤(1 至步骤(18)作为一个分离纯化周期；重复步骤(1 至步骤 (18)，但每次用前一个分离纯化周期中步骤(18)的菌液代替步骤(15)中用到的ImL步骤 (10)中锥形瓶内的溶液；分离纯化6个周期以上即可得到能够高效去除溢油污染海水中石油烃的降解纯菌株。
本发明的有益效果是所述的方法能够分离与纯化到高效去除溢油污染海水中石油烃的降解纯菌株。
具体实施例方式本发明提供一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。首先向加入原油、基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的玻璃瓶内接入海水样品，在温度为10 15°C、转速为lOOr/min的振荡器中培养培养10 12个月后，进行循环转接，在循环次数大于6次后得到富集石油烃降解菌群的溶液。在超净工作台中制作以石油烃为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有石油烃降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，然后在培养箱中培养9 13天。在超净工作台中向加入石油烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为10 15°C、转速为 100r/min的振荡器中培养4 6天。然后进行循环转接，在循环次数大于6次后即可得到石油烃降解纯菌株。下面是以运用分离与纯化得到的石油烃降解纯菌株进行了溢油污染海水中石油烃的降解试验，进一步说明本发明。实施例运用本发明方法分离与纯化得到的石油烃降解纯菌株进行了溢油污染海水中石油烃的降解试验，结果表明得到的石油烃降解纯菌株能够对石油烃进行有效的降解当石油烃的初始浓度为7. 3g/L时，6天后能降解到3. 3g/L，对石油烃的降解率可达到54. 79%。
权利要求
1. 一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下(1)选取海水样品4000mL，放置于4°C冰箱中保存备用；(2)向体积为2500mL的玻璃瓶中加入IOg原油，加入40mL正己烷溶解后均勻平铺于玻璃瓶瓶底，为除去正己烷将玻璃瓶开口放置3天；(3)向步骤⑵中的玻璃瓶中入500mL基础培养基、IOmL微量金属液和2mL维生素c溶液；其中基础培养基的组成为=NH4NO3 · 2. Og · ΙΛ NaCl :10. 5g/L，KH2PO4 :2. 5g ·厂1，FeCl3 0. IOg · ΙΛ MgSO4 :3. 5g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 :0. 15g · Γ1 ；微量金属液的组成为=CoCl2 · 6Η20 45mg · ΙΛ CuCl2 :0. 25mg ·厂1，H3BO3 :6. 5mg · Λ MnCl2 · 4Η20 :35mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 3. 5mg · ΙΛ NiCl2 · 2Η20 :2· 5mg · Λ ZnCl2 :3· 5mg · Γ1 ；(4)向步骤(3)中的玻璃瓶内接入步骤(1)中海水样品IOOOmL,然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养10 12个月，为维持玻璃瓶内液体总量不变，每隔一周补充步骤(1)中海水样品；(5)向体积为250mL的锥形瓶中加入1.Og原油，加入4. OmL正己烷溶解后均勻平铺于锥形瓶瓶底，为除去正己烷将锥形瓶开口放置2天；(6)向步骤(5)中锥形瓶中加入50mL基础培养基、1.OmL微量金属液和0. 2mL维生素 c溶液；(7)向步骤(6)中锥形瓶中接入经步骤(4)处理后玻璃瓶内的溶液5mL，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天；(8)按接种体积比为50 1的比例将步骤(7)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤(5) 至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天，(9)按接种体积比为50 1的比例将步骤(8)中锥形瓶内的溶液转入另一按步骤(5) 至(6)处理后的锥形瓶内，然后置于温度为10 15°C转速为lOOr/min的振荡器中培养6 8天；(10)重复步骤⑶和(9)三次，每次在进行步骤⑶时，以步骤(9)中锥形瓶内的溶液代替步骤(7)中锥形瓶内的溶液；(11)向体积为IOOOmL的玻璃瓶内加入800mL基础培养基、20.OmL微量金属液、4. OmL 维生素c溶液，摇勻后作为液体培养基备用；(12)向体积为150mL的锥形瓶内加入50mL按步骤(11)配制的液体培养基和0.60g琼脂，然后在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在室温下冷却至65 70°C时，在超净工作台中将其倒入体积为160mL的培养皿中，为除去培养基表面多余的水分将该培养皿在超净工作台中放置2天；(13)在超净工作台中向步骤(12)中的培养皿中加入1.5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，来回倾斜转动培养皿使溶有原油的正己烷溶液均勻分布，为除去培养基表面的正己烷将该培养皿在超净工作台中放置2天；(14)向体积为25mL的锥形瓶内加入IOmL按步骤(11)配制的液体培养基和0.25g琼脂，在温度为121°C的高压锅中灭菌20分钟，在超净工作台中冷却至38 40°C ；(15)在超净工作台中向步骤(14)的锥形瓶中加入ImL步骤(10)中锥形瓶内的溶液，摇勻后吸取ImL慢慢加入步骤(1 中的培养皿中，来回倾斜转动培养皿使培养基溶液均勻分布；将培养皿放入温度为15°C的培养箱中培养观察，9 13天后便可发现有明显的菌落出现；(16)在超净工作台中向体积为25mL的锥形瓶中加入1.5mL原油浓度为15g/L的正己烷溶液，为除去丙酮将锥形瓶开口放置2天；(17)向步骤(16)中的锥形瓶内加入IOmL按步骤(11)配制的液体培养基；(18)在超净工作台中挑取步骤(1 培养皿中的菌落，将其接种至步骤(17)中的锥形瓶中，在温度为10 15°C、转速为lOOr/min的振荡器中培养4 6天；(19)将步骤(1 至步骤(18)作为一个分离纯化周期；重复步骤(1 至步骤(18)，但每次用前一个分离纯化周期中步骤(18)的菌液代替步骤(15)中用到的ImL步骤(10)中锥形瓶内的溶液；分离纯化6个周期以上即可得到能够高效去除溢油污染海水中石油烃的降解纯菌株。
全文摘要
本发明公开了属于受溢油污染海水的生物降解处理技术领域的一种从海水中分离与纯化石油烃降解纯菌株的方法。首先向加入原油、基础培养基、微量金属液和维生素c溶液的锥形瓶内接入海水样品，进行石油烃降解菌群的富集。在超净工作台中制作以石油烃为唯一碳源和能源的琼脂固体培养基底层平板，在底层平板上制作含有石油烃降解菌群的琼脂固体培养基顶层平板，然后在培养箱中培养9～13天。在超净工作台中向加入石油烃、基础培养基、微量金属液、维生素c溶液的锥形瓶内接入培养基平板中的菌落，在温度为10～15℃条件下培养4～6天。然后进行循环转接，在循环次数大于6次后即可得到石油烃降解纯菌株。
文档编号C12N1/00GK102329730SQ20111028206
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者丁爱中, 李帅冉, 王鸿婷, 程莉蓉, 范福强, 豆俊峰, 郑蕾 申请人:北京师范大学