专利名称：水稻brd3基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及功能基因组学和植物基因工程领域。具体涉及一种激活标签法克隆的 BRD3基因以及利用转基因实验验证该基因；还涉及利用该基因或其同源类似物调控植物株型性状，提高作物产量。
背景技术：
水稻是我国播种面积最大、总产量最高的粮食作物，其播种面积和产量均占粮食作物的1/3以上，全国有近2/3的人口以水稻为主食，可以说，稳定了水稻的生产，在很大程度上就稳定了我国的粮食供给。近年来，随着我国经济的发展和城市化进程的加快，水稻种植面积大幅度下降，直接导致我国水稻总产量和稻米库存持续下降。目前我国粮食的供求已处于“紧平衡”状态，随着我国人口的持续增长，对粮食的需求还将进一步增加，因此，发展水稻生产，确保我国的粮食安全已成为当务之急.
稳定粮食生产，一方面要保证粮食种植面积，而另一方面则需要通过科学技术进一步提高单位面积的产量。在水稻育种的发展史上，水稻单产曾经历两次飞跃，第一次是上世纪50年代的矮化育种，它把高杆水稻改变为矮杆水稻。第二次是上世纪70年代的杂交育种，通过亚种间杂交实现了杂种优势的利用。两次飞跃之后，水稻单产长时间停滞不前， 始终未取得质的突破。近年来，中国、国际水稻研究所 和日本正在积极寻求水稻单产的第3 次飞跃，并明确提出了新株型育种在这次飞跃中的重要作用。不管是中国的超级杂交水稻育种计划，还是国际水稻研究所提出的新株型育种策略都是紧紧围绕水稻株型展开的。因此克隆水稻株型相关基因并揭示水稻株型形成的分子调控机理可以促进水稻新时期育种的进程。
油菜素内酯(Brassinosteriods，BRs)是决定水稻生长发育和株型建成的重要因素，体外喷施BR和体内BR含量的变化均能导致水稻株型的变化。研究证明，通过分子操作调控BR在水稻体内的含量、分布和响应可以改善水稻的个体或群体结构，从而显著提高水稻的生物量和产量(Morinaka et al 2006 ；Sakamoto et al. 2006 ；ffu et al. 2008 ；Divi & Krishna 2009)，因此深入研究BR的合成、降解和信号传导途径以及生理功能具有十分重要的意义。
油菜素内酯可以促进生长，改变株型，增加生物量，提高植物的抗逆性，实践证明喷施BR可以提高多种作物的产量，但是BR使用易受天气，使用时机和方法的影响，效果不稳定(Divi & Krishna 2009)。而利用分子操作改变BR合成或信号转导中关键基因的表达模式，不仅可以精细调控BR在体内的分布和响应水平，从而达到甚至超过体外喷施的效果，而且还能大大提高劳动效率，节约生产成本。不仅如此，通过分子手段还可以在特定部位降低BR的含量和响应水平，从而最大限度的发挥BR在产量上的贡献。
Morinaka等通过转基因技术在水稻特定部位抑制OsBRIl基因的表达，获得了叶片直立，粒重未受影响的转基因水稻，这些转基因水稻预计在密植条件下相同面积能增产 30% (Morinaka et al 2006)。Wu等利用特异性启动子使拟南芥、玉米和水稻(0sDWARF4)的C-22羟化酶基因在水稻根、茎、叶中超表达，获得的转基因水稻穗大粒重，无论在温室还是田间种植情况下，就单株水平比较，转基因植株可以增产15%-40% (Wuet al 2008)。水稻0sdwarf4突变体除了叶直立，比野生型植株稍矮以外，其它表型均正常，Sakamoto等比较了 OsdwarW突变体和野生型植株在密植条件下的地上部分生物量和产量，结果发现突变体在不同施肥条件下生物量和产量均有明显增加(Sakamoto et al 2006)。
GA代谢相关基因的应用引发了农业生产上的第一次绿色革命。鉴于BR在促进生长，调控株型，增加产量，提高抗逆性中的重要作用，随着对BR代谢途径和作用方式的深入研究，并在此基础上实现对BR代谢的精细调控完全有可能带来一场新的绿色革命。
BRD3基因是一个新克隆的参与BR代谢途径的重要功能基因，与0sDWARF4基因和 OsBRIl基因不同，BRD3基因参与BR代谢的降解途径，因此更易于实现BR在不同部位的微调。通过转基因技术精细调控BRD3基因在不同部位的表达水平，可以塑造理想的植物株型，增加作物产量。
参考文献
Divi UK, Krishna P. 2009. Brassinosteroid a biotechnological target for enhancing crop yield and stress tolerance. N Biotechnol26 :131-6
Morinaka Y, Sakamoto T, Inukai Y, Agetsuma M, Kitano H, et al.2006. Morphological alteration caused by brassinosteroid insensitivity increases the biomass and grain production of rice.Plant Physiol 141 :924-931
Sakamoto T,Morinaka Y,Ohnishi T,Sunohara H,Fujioka S,et al. 2006. Erect leaves caused by brassinosteroid deficiency increase biomass production and grain yield in rice. Nat Biotechnol 24:105-109
Wu CY, Trieu A, Radhakrishnan P, Kwok SF, Harris S, et al. 2008. Brassinosteroids regulate grain filling in rice. Plant Cell 20:2130-2145发明内容
本发明提供一种水稻产量相关基因BRD3及其应用。
一种水稻产量相关基因BRD3，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。
所述的水稻产量相关基因BRD3编码的蛋白质，具有序列表中SEQ ID NO. 3所述的氨基酸序列。
本发明在水稻T-DNA插入突变体库中发现一个矮杆、叶片直立、穗颈长等典型BR 缺陷型的突变体，遗传分析显示该突变体受一对显性核基因控制，共分离实验证明该基因与T-DNA插入共分离，通过TAIL-PCR技术获得了 T-DNA插入位置的旁邻序列，表达分析显示T-DNA的插入导致BRD3基因的表达量显著上升。构建了 BRD3基因的过表达载体，通过转基因技术证实了该基因的功能。
基因的克隆
以野生型粳稻品种(Oryza sativa L. subsp. japonica)中花11为受体材料，植物表达载体PSMR-J18R为转化载体，利用农杆菌介导法构建了水稻T-DNA插入的突变体库。对 TO代植株单株收种，Tl代种子播种于中国水稻研究所的试验田，观察突变体库中每个Tl代株系的表型，在其中的一个株系中发现一些矮杆、叶片直立的突变体。通过统计遗传分析证明了该突变是由一对显性基因控制的。
根据转化载体T-DNA区域内的潮霉素磷酸转移酶基因序列设计了 I对引物HPT用于转基因阳性检测，用HPT检测引物分别扩增Tl代突变体和野生型DNA。结果显示，所有突变体均为转基因阳性植株，而所有野生型植株均为转基因阴性植株。之后我们利用潮霉素抗性检测法对PCR结果进行了验证，取处于分蘖期的水稻植株叶片，剪成2-3cm片段置于盛有潮霉素溶液的培养皿中，并使叶片和溶液充分接触，在12h光照/12h黑暗、26°C条件下培养，定期观察叶片变色情况，以判断其抗性水平。检测溶液为含O. 5mg/L6-苄氨基嘌 呤 (6-BA)和50mg/L潮霉素B的水溶液。结果发现Tl代中所有突变体的叶片对潮霉素均有抗性，而所有野生型植株对潮霉素都是敏感的。这一结果和PCR结果一致，说明了该突变性状可能是由T-DNA插入引起的。
利用TAIL-PCR扩增T-DNA旁邻序列。第三轮PCR产物经切胶回收后，连接到 Takara公司的pMDlS-T载体中，酶切鉴定后送到杭州华大基因研发中心测序。测序结果在 NCBI网站上进行BLAST分析。
序列分析显示外源T-DNA插入到第6染色体BRD3基因上游大约4kb的位置。BRD3 基因编码一个细胞色素P450单加氧酶，BRD3是BR deficient〗的英文缩写。该基因的 ORF (开放阅读框)为1617bp，mRNA长度为2151bp。基因编码产物大小538个氨基酸。
基因的功能验证
以水稻cDNA克隆002-114-A02为模板，设计引物利用PCR技术扩增到BRD3基因的编码序列，然后将BRD3基因装入PMD18-T载体中，测序正确后，用BamHI和XbaI酶切，回收基因片段，然后连入130035S1-X载体中构建35S启动子驱动的BRD3基因过表达载体，鉴定后转入EH105农杆菌，通过农杆菌介导法转化野生型水稻品种中花11，TO代植株单株收种，对Tl代植株进行分子鉴定同时观察各单株的表型。结果显示，Tl代BRD3基因过表达植株呈现植株矮化，叶片直立等表型，验证了 BRD3基因在调控水稻株型中的作用。
本发明有益效果
通过转基因技术改变水稻产量相关基因BRD3在不同部位的表达模式，可以改变水稻不同部位的BR含量，改良水稻的株型，提高水稻的产量。一方面，在水稻特定部位过表达BRD3基因，可以获得叶片直立，单株产量不受影响或影响较小的转基因水稻，这些转基因水稻预计在密植条件下能显著增加单位面积的产量；另一方面，通过转基因技术抑制 BRD3基因在特定部位的表达，可以获得穗大粒重，单株产量显著提高的转基因水稻。若将水稻产量相关基因BRD3转化小麦、玉米等作物中，同样也能改良受体植物的株型，提高作物的产量，增加农民收入。
具体实施方式
基因的克隆
以野生型粳稻品种(Oryza sativa L. subsp. japonica)中花11为受体材料,植物表达载体PSMR-J18R为转化载体，利用农杆菌介导法构建了水稻T-DNA插入的突变体库。对 TO代植株单株收种，Tl代种子播种于中国水稻研究所的试验田，观察突变体库中每个Tl代株系的表型，在其中的一个株系中发现一些矮杆、叶片直立的突变体。
统计该突变株系Tl代野生型植株和突变体植株的株数，发现有24株突变体，12株野生型植株，突变体和野生型植株的分离比符合3 I的分离假设(X 2 = 0.93 < X 20. 05 =3. 84)。对Tl代突变体和野生型植株分别收种，播种后观察T2代的表型，结果发现所有野生型的后代全是野生型，而大部分突变体的后代出现分离，而且突变体和野生型的分离比也符合3 1，因此该突变可能是单基因控制的显性突变。为了进一步验证这个假设，将 I株纯合突变体和中花11做杂交，结果显示Fl代植株全为突变型，而随机统计100株F2 代植株发现72株突变体和28株野生型植株，这一结果仍然符合3 I的分离假设(X 2 = O. 33 < X 20. 05 = 3. 84)。从而证明了该突变是由一对显性基因控制的。
根据转化载体T-DNA区域内的潮霉素磷酸转移酶基因序列设计了 I对引物用于转基因阳性检测，引物序列如下
HPTl 5/ -GGA, GCA, TAT, ACG, CCC, GGA, GT-3'
HPT2 5/ -GTT，TAT，CGG，CAC，TTT，GCA，TCG-3'
PCR反应体系为
权利要求
1.一种水稻产量相关基因BRD3，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。
2.如权利要求1所述的水稻产量相关基因BRD3编码的蛋白质，具有序列表中SEQID NO. 3所述的氨基酸序列，或其的功能类似蛋白，其氨基酸序列与SEQ ID NO. 3所述序列具有 70%以上的同源性。
3.一种编码权利要求2所述的蛋白质或其功能类似物的基因。
4.一种含有权利要求3所述基因的质粒。
5.一种含有权利要求3所述基因的部分序列的质粒。
6.一种含有权利要求4或5所述质粒的植物表达载体。
7.一种含有权利要求6所述基因序列的转化子。
全文摘要
本发明提供公开了一种水稻产量相关基因BRD3，具有序列表中SEQ ID NO.1所述的碱基序列。通过转基因技术改变水稻产量相关基因BRD3在不同部位的表达模式，可以改变水稻不同部位的BR含量，改良水稻的株型，提高水稻的产量。一方面，在水稻特定部位过表达BRD3基因，可以获得叶片直立，单株产量不受影响或影响较小的转基因水稻，这些转基因水稻预计在密植条件下能显著增加单位面积的产量；另一方面，通过转基因技术抑制BRD3基因在特定部位的表达，可以获得穗大粒重，单株产量显著提高的转基因水稻。若将水稻产量相关基因BRD3转化小麦、玉米等作物中，同样也能改良受体植物的株型，提高作物的产量，增加农民收入。
文档编号C12N15/63GK103014025SQ201110289700
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者刘文真, 付亚萍, 胡国成, 斯华敏, 孙宗修 申请人:中国水稻研究所