专利名称：一种改造的sacB基因及其衍生的整合型载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种改造的基因及依托其构建的整合型载体，特别是一种改造的sacB 基因及其衍生的整合型载体。
背景技术：
随着棒状杆菌生理学，生物化学和遗传学知识的大量累积，基于理性设计的代谢工程育种在氨基酸高产菌株选育中的地位越来越重要。基因敲除和替代技术是棒状杆菌代谢工程育种研究中主要分子生物学技术之一。基因敲除和替代技术是自80年代未以来发展起来的一种分子生物学技术，通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失或被其他替代的。一般是利用微生物体内的同源重组系统，在一定选择压力下使体外改造的DNA片段与受体细胞染色体上的功能基因之间发生同源重组，从而改变细胞的遗传特性。利用基因敲除技术可阻断细胞的代谢旁路，或通过引入突变位点来调节代谢流，优化代谢途径，最终达到微生物育种的目的。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) sacB基因编码的果聚糖蔗糖酶，是枯草芽孢杆菌的一种外分泌酶，它受蔗糖诱导表达，能将蔗糖分解成葡萄糖和果糖，还可进一步将果糖聚合成果聚糖。在培养基中存在蔗糖的条件下，细胞内果聚糖蔗糖酶的表达对革兰氏阴性菌有致死作用(Gay, P.，Le Coq, D, Steinmetz, M.，Berkelman, T.，Kado, C. I.，1985. Positive selection procedure for entrapment of insertion sequence elemems in gram-negative bacteria. J Bacteriol. 164，918-21.)。在培养基中存在蔗糖的条件下， 细胞内表达果聚糖蔗糖酶，对棒杆菌属、分枝杆菌属两种革兰氏阳性菌也具有致死作用 (Pelicic. V.，Reyrat, J. M.，Gicquel, B.,1996. Expression of the Bacillus subtilis sacB gene confers sucrose sensitivity on mycobacteria. J Bacteriol· 178，1197—9 ; Schafer, A.，Tauch, Α.，Jager, W.，Kalinowski，J.，Thierbach，G.，Puhler，Α.，1994. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19 :selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 145，69-73.)。基于这一发现，Schafer 等用 sacB 基因作为一个条件致死型标记，发展了一种携带抗生素抗性与sacB双标记的新型整合型载体。基于双标记的pKlSmobsacB能够对谷氨酸棒状杆菌染色体基因实施进行无痕敲除及替代。该载体使用sacB自身的启动子和SD序列，限制了应用范围；应用该载体进行基因敲除时，由于IS插入片段的插入，不同比例的出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，给实验带来不必要的麻烦。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种改造的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述sacB基因用作筛选标记亦为本专利要求的保护范围。
本发明要解决的另一个技术问题是提供一种依托改造的sacB基因构建的整合型载体，含有优化的组合启动子PlacM及SD序列、改造的sacB基因、多克隆位点MCS及抗生素筛选标记，以消除蔗糖抗性、抗生素抗性的问题，大大减少应用中不必要的麻烦。其中，sacB 自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，处于优化的组合外源PlacM和SD序列下，表达更加良好。多克隆位点MCS，含有多个限制性内切酶切位点，位于外源启动子PlacM及SD序列上游。所述的整合型载体pDXW-3，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。本发明中，sacB处于强启动子PlacM和优化的SD下，表达更加良好。另外，sacB 自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，应用时几乎不会出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，大大减少应用中不必要的麻烦。因此本发明即获得了一个能在棒状杆菌广泛，高效的整合型载体。
图1整合型载体pDXW-3的物理图谱
具体实施例方式实施例1改造的sacB基因一种改造的sacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2整合型载体pDXW-3的构建以 B.subtilis subsp. 168 (购自 ATCC 23857)基因组为模板，PlacM-sacB-F 和 PlacM-sacB-R为引物，通过PCR扩增1605bp的sacB基因，在扩增产物的5 ’和3 ’末端引入限制酶NheI和NcoI酶切位点，PCR产物用NheI和NcoI酶切。pDWX_l (构建方法参考Xu，D.， Tan,Y. ,Li,Y. ,ffang,X. ,2011. Construction of a hovel promoter-probe vector and its application for screening strong promoter for Brevibacterium flavum metabolic engineering. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 27,961-968.)同样用 NheI和NcoI酶切；两者连接，由此产生的质粒大小为5067bp，命名为pDXW_3。以上所述的PCR扩增所需引物序列PlacM-sacB-F :aaatt_gctagctgagetgtttacaattaatcatcgtgtggtaccatgtgtggaatt ggaaaggacttgaacgatgaacatcaaaaagtt ^ lzIzl Τ*^1lJ^"rP^ NheI ^ ^0PlacM-sacB-R :agta￡￡^ggaaaaggttaggaatacggttagcca 其中下划线部分 NcoI 位点OPCR反应条件PCR反应退火温度57°C，延伸时间120s。整合型载体pDXW-3核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示。实施例3载体pDXW-3在谷氨酸棒状杆菌中的应用评价为了证明pDXW-3的可用性，我们在谷氨酸棒状杆菌敲除aceE基因。以谷氨酸棒状杆菌基因组为模板，aceE-L-F/aceE-L-R和aceE-R-F/aceE-R-R分别为引物，通过PCR扩增到aceE基因的上游同源臂Larm和下游同源臂Rarm。aceE-L-F CACAGATCTGATTGTTAAGGCTTCTTGTTTCCACGCT，其中下划线部分为 BglII 位点
aceE-L-R TCTATGACAGTGAGTACTCGAACGACAGCAAGCTTGATCGGCCATTTCCACACCTCC,其中下划线部分与引物aceE-R-F下划线部分互为反向互补序列aceE-R-F :TTGCTGTCGTTCGAGTACTCACTGTCATAGAGACTTCTCCACTGATCTGCCAAACCaceE-R-R :AAACTCGAGTTCTTCCCCGGCACTGTGAATGAGC 其中下划线部分为 XhoI 位点。Larm和Rarm两片段经纯化后，按1 1的摩尔比进行第二轮PCR，扩增得到 Larm-Rarm片段。产物用BglII和XhoI双切，并连接到用BamHI和XhoI双切后的pDXW_3， 产生的重组质粒pDXW-3-LRaceE。质粒pDXW-3-LRaceE电转谷氨酸棒状杆菌，涂布含有6μ g/mL卡那霉素的 LBHIS(van der Rest, Μ. Ε., Lange, C. , Molenaar, D. , 1999. A heat shock following electroporation induces highly efficient transformation of Corynebacterium glutamicum with xenogeneic plasmid DNA. Appl Microbiol Biotechnol. 52,541-545.) 固体平板，培养36时。将单菌落接种于含有0. 5%的KAc的5ml液体LBG(LB添加0. 5%葡萄糖)培养基。过夜培养，稀释10-2后涂布于含有0.5% KAc、卡那霉素及10%蔗糖的LBG平板，稀释10-4涂布于含有0. 5% KAc、卡那霉素的LBG平板。经过24小时培养，10_4稀释度的不含蔗糖的平板上菌落数明显多于10-2稀释度的含有蔗糖的平板上的菌落数。pDXW-3 载体上的sacB基因能在棒状杆菌中良好的表达，可以作为棒状杆菌条件致死的筛选标记。同时，前述液体过夜培养物稀释(10-1-10-4)涂布于含有0. 5% KAc和10%蔗糖的固体LBG平板。培养24小时，将单菌落影印到CGXII(Keilhauer，C.，Eggeling，L. , Sahm, H.，1993.Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum :molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175,5595-5603.)基本培养基。培养 24 小时，CGXII平板上不能生长的就是aceE敲除成功的谷氨酸棒状杆菌。对得到的菌株再通过 PCR进行验证，引物为aceE-F :ttcgtgcacttcggcgtgtcacaataceE-R :ccttcgcgtgccagggagttcPCR反应条件PCR反应退火温度55°C，延伸时间180s扩增得到约300bp的片段，证明获得缺失aceE基因的谷氨酸棒状杆菌突变株。将生长于含有0. 5% KAc和10%蔗糖的固体LBG平板的菌落影印到含有0. 5% KAc 和6μ g/mL卡那霉素的固体LBG平板。结果在含有卡那霉素时，没有菌落生长。这证明， sacB基因不会因IS片段插入等因素失活。所以，在实际应用中，从含蔗糖平板上挑取的菌落可以直接进行PCR或是营养缺陷鉴定，不需要再进行抗性鉴定，大大减少应用中不必要的麻烦。aceE基因的敲除可以证明pDXW_3可以实现棒状杆菌染色体基因的敲除。如果 aceE-L-R/aceE-R-F引物中互补序列是外源基因序列，那么重复上述步骤即可实现外源基因敲入棒状杆菌染色体。如果上游同源臂Larm和下游同源臂Rarm在棒状杆菌染色体上是紧紧相邻的，aceE-L-R/aceE-R-F互补序列中含有与染色体序列不同碱基，重复上述步骤即可实现棒状杆菌染色体核酸序列的突变。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
权利要求
1.一种改造的SacB基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.权利要求1所述sacB基因用作筛选标记。
3.一种包含权利要求1所述sacB基因的整合型载体pDXW-3，其特征在于含有优化的组合启动子PlacM及SD序列、改造的sacB基因、多克隆位点MCS及抗生素筛选标记；其中PlacM核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，SD序列核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，紧密连接于PlacM下游； 改造的sacB基因，处于启动子PlacM及SD序列下游；多克隆位点MCS，含有多个限制性内切酶切位点，位于外源启动子PlacM及SD序列上游，核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
4.权利要求3所述的整合型载体pDXW-3，其核苷酸序列如SEQID NO. 5所示。
5.权利要求3或4所述的载体应用于棒状杆菌的染色体基因的敲除。
6.权利要求3或4所述的载体应用于外源基因敲入棒状杆菌染色体。
7.权利要求3或4所述的载体应用于棒状杆菌染色体核酸序列的突变。
全文摘要
本发明公开了改造的sacB基因及其衍生的整合型载体，属于基因工程技术领域。本发明提供的整合型载体含有一个人工合成的强启动子PlacM启动的能在棒状杆菌中良好转录表达并具有条件致死功能的基因sacB；一个用于棒状杆菌转化子选择的抗性标记卡那霉素标记抗性基因；还含有一个多克隆位点MCS。SacB处于强启动子PlacM和优化的SD下，表达更加良好；此外，由于sacB自身的启动子、sacR和SD序列均被去除，应用时几乎不会出现蔗糖抗性、抗生素抗性的菌落，大大减少应用中不必要的麻烦。该载体能在大肠杆菌中复制并稳定存在而不能在棒状杆菌中复制，适用于棒状杆菌染色体基因敲除和替代。
文档编号C12N15/54GK102329808SQ201110302090
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者徐大庆, 李烨, 王小元, 谭延振 申请人:江南大学