转基因动物及其制备方法

专利名称：转基因动物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域。具体地涉及转基因动物及其制备方法。更具体地涉及一组适于转化细胞的载体、一种适于转化细胞的载体、一种制备转基因细胞的方法、一种非人转基因动物细胞、一种制备非人转基因动物的方法、一种非人转基因动物或其后代。
背景技术：
转基因动物的安全性问题是当前最为重要的社会问题，安全的转基因技术是转基因生物品种安全的重要保障。转基因动植物中的外源基因主要有两大类，即目的基因和标记基因。标记基因是帮助对转基因生物工程体进行筛选和鉴定的一类外源基因，它包括选择标记基因和报告基因。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡， 而转化细胞由于有抗性，可以继续存活，因而有利于从大量的非转化细胞和组织中选择出转化克隆。在制备转基因动物时，引入标记基因主要是方便转基因阳性材料的筛选。转基因一旦成功后，选择标记基因便不再发挥作用，反而变成了潜在的危险。选择性标记基因引起的最大的争议就是转基因逃逸问题，即导入的标记基因与其野生近缘种等非目标生物间的基因流动，从而有可能破坏整个生态系统；另外一个担忧是选择性标记基因编码产物的毒性，可能影响机体的健康；最后，抗性标记基因以及原核序列还会影响目的基因的表达， 有可能导致表达的沉默。然而，目前的制备转基因动物的方法仍有待改进。

发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。根据本发明的第一方面，本发明提出了一组适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，所述的一组适于转化细胞的载体包括第一载体，所述第一载体包含附着子序列； 以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列。由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本发明的实施例，上述一组适于转化细胞的载体还可以具有下列附加技术特征根据本发明的一个实施例，所述附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。根据本发明的一个实施例，所述第一载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本发明的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本发明的一个实施例，所述第一载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列。 由此，可以有效地筛选转入第一载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的一些示例，所述筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。根据本发明的具体示例，优选所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种。根据本发明的具体示例，优选所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的一个实施例，所述第二载体进一步包含启动子，所述启动子与所述目的核酸序列可操作地连接。根据本发明的一些示例，优选所述启动子为真核细胞启动子。 根据本发明的具体示例，更优选所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本发明的一个具体示例，最优选所述真核细胞启动子为CAG启动子。由此，可以提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。根据本发明的一个实施例，所述真核细胞启动子为组织特异性启动子。由此，可以根据宿主细胞的类型，选择适当的启动子，从而获得能够实现目的核酸序列的组织特异性表达。根据本发明的一个实施例，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述目的核酸序列可操作地连接。根据本发明的一些示例，优选所述增强子为CHS4增强子。由此，可以进一步提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。根据本发明的一个实施例，所述目的核酸序列的两端分别具有适于同源重组的核酸序列。由此，可以提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率。根据本发明的一些示例，优选所述适于同源重组的核酸序列为细胞基因组中的非功能片段。由此，在提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率的同时，目的核酸序列的引入并不影响宿主细胞正常基因的表达和功能。根据本发明第二方面，本发明提出了一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包含附着子序列。利用该载体，可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本发明的实施例，上述适于转化细胞的载体还可以具有下列附加技术特征根据本发明的一个实施例，所述附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。根据本发明的一个实施例，所述载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本发明的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本发明的一个实施例，所述载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列。由此， 可以有效地筛选转入载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的一些示例，所述筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。根据本发明的具体示例，优选所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种。根据本发明的具体示例，优选
5所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的第三方面，本发明提出了一种制备转基因细胞的方法。根据本发明的实施例，该制备转基因细胞的方法包括以下步骤使用前面所述的一组适于转化细胞的载体转化宿主细胞，以便获得转基因细胞；以及分离转基因细胞，其中所述转基因细胞的染色体中含有所述目的核酸序列。如前所述，由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中， 而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本发明的实施例，上述制备转基因细胞的方法还可以具有下列附加技术特征根据本发明的一个实施例，所述宿主细胞为真核细胞。根据本发明的一些示例，优选所述真核细胞为动物细胞，所述动物细胞为来自于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞。本申请的发明人惊奇地发现，根据本发明的实施例的制备转基因细胞的方法，特别适合于制备真核转基因细胞，尤其是动物细胞。当应用于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞时，所得到的转基因细胞，可以通过手工克隆的方法应用于制备转基因动物。根据本发明的一个实施例，利用所述第一载体和所述第二载体共转化所述宿主细胞。根据本发明的一些示例，优选通过脂质体法进行所述共转化。由此，可以提高将第一载体和第二载体引入宿主细胞中的效率。根据本发明的一个实施例，进一步包括通过PCR方法验证所述转基因细胞的基因组中含有所述目的核酸序列的步骤。由此，可以方便地筛选目的核酸序列与宿主细胞的染色体成功地发生整合的转基因细胞，由此，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的第四方面，本发明提出了一种非人转基因动物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，所述非人转基因动物细胞是根据上面所述的制备转基因细胞的方法获得的。由此，该非人转基因动物细胞或其培养物的基因组中并不包含标记基因，由此，不会对转基因细胞的正常运转造成不利影响。根据本发明的第五方面，本发明提出了一种制备非人转基因动物的方法。根据本发明的实施例，该制备非人转基因动物的方法包括以下步骤提取前面所述非人转基因动物细胞或其培养物的细胞核；将所述细胞核引入所述动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；将所述融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得所述非人转基因动物。由此，可以有效地获得非人转基因动物，同时，所获得的非人转基因动物的染色体中不含标记基因，从而不会影响动物个体自身的正常运转。根据本发明的实施例，上述制备非人转基因动物的方法还可以具有下列附加技术特征根据本发明的一个实施例，所述无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。由此，可以提高获得无核卵母细胞的效率，并且能够提高接受外源细胞核的效率。根据本发明的第五方面，本发明提出了一种非人转基因动物或其后代。根据本发
6明的实施例，所述非人转基因动物是根据前面所述的制备非人转基因动物的方法获得的。 由此，根据本发明实施例的非人转基因动物的染色体中不含标记基因，从而不会影响动物个体自身的正常运转。本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。


本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中图1显示了根据本发明实施例的一种构建转基因动物的流程示意图；图2显示了根据本发明实施例的附着子载体的示意图；图3显示了根据本发明实施例的表达载体的示意图；图4显示了根据本发明实施3，细胞开始筛选后第2天、5天、8天的图片。图5显示了根据本发明实施例3，PK15细胞单克隆图片(阳性细胞带有绿色荧光)。图6显示了根据本发明实施例3，成纤维细胞单克隆图片(阳性细胞带有绿色荧光)。图7显示了根据本发明实施例3，阳性细胞附着子质粒鉴定图片(附着子未丢失)。图8显示了根据本发明实施例3的阳性细胞附着子质粒鉴定图片(附着子已丢失)。图9显示了根据本发明实施例7的囊胚发育情况。
具体实施例方式下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。如果没有特别说明，在本文中所使用的术语均是本领域技术人员通常所理解的含义。在本发明中所使用的术语“第一”、“第二”仅仅是为了方便区分不同的成分，而不能以任何方式理解为重要性或其他方面的区别。一组适于转化细胞的载体根据本发明的第一方面，本发明提出了一组适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，这一组适于转化细胞的载体包括第一载体和第二载体。根据本发明的实施例，第一载体包含附着子序列，第一载体有时也可以被称为附着子载体。第二载体包含目的核酸序列，第二载体有时也可以称为表达载体。在本文中所使用的术语“附着子序列”是指能够促进目的核酸序列在宿主细胞的细胞核中定位，从而促进目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合。附着子序列本身并不与宿主细胞染色体发生整合，并且会随着细胞的增殖而逐渐丢失。因而，由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列， 由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。这里所使用的术语“目的核酸序列”应作广义理解，既可以是具有基因功能的核酸片段，也可以是为调节宿主细胞其他功能所需要的核酸片段例如启动子、增强子、沉默子等。这里所使用的术语“载体”应作广义理解，其可以是任何能够将核酸序列引入宿主细胞内的媒介，包括但不限于质粒、粘粒、病毒、人工染色体寸寸。根据本发明的一些实施例，附着子序列的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，所采用的附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以通过附着子与染色体骨架结合，或者与核基质结合，从而有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。更优选包含编码EBNAl和/或核基质附着区的核酸序列，可选地所述染色体骨架结合区是EBNA1。本申请的发明人惊奇地发现，当采用EBNAl作为附着子时，能够极大地提高构建无标记转基因细胞/动物的效率。为了便于利用这些载体转化宿主细胞，第一载体和第二载体还可以分别具有其他的元件，以赋予其附加的功能和效果。根据本发明的一个实施例，第一载体可以进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本发明的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。本申请的发明人发现，当附着子序列与oriP相连时，所构建的载体在宿主细胞内能够十分有效地自主复制，可以显著提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本发明的一个实施例，第一载体可以进一步包括编码筛选标记的核酸序列。 由此，可以有效地筛选转入第一载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的示例，筛选标记的类型并不受特别限制。根据本发明的一些示例，筛选标记可以为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。由此，可以非常容易地筛选已经引入第一载体的宿主细胞，例如通过检测发光强度和在培养基中添加相应的药物。根据本发明的具体示例，发光蛋白可以为选自GFP和EGFP的至少一种。由此，可以通过检测所发出的绿色荧光，来筛选和验证第一载体已经成功地被引入到宿主细胞中。根据本发明的具体示例，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以通过在培养基中添加相应的抗生素，在培养后存活下来的细胞即为含有第一载体的宿主细胞。 由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的一个实施例，第二载体可以进一步包含启动子，启动子可以与所述目的核酸序列可操作地连接。这里所使用的术语“连接”应作广义理解，可以为直接相连，也可以为通过媒介间接相连。“可操作的连接”的意思是指，启动子能够发挥其正常生物学功能，从而影响目的核酸序列的表达。根据本发明的实施例，可以采用的启动子的类型不受特别限制。根据本发明的一些示例，所述启动子可以为真核细胞启动子。由此，可以将第一载体和第二载体应用于转化真核细胞。根据本发明的具体示例，更优选所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本发明的一个具体示例，最优选所述真核细胞启动子为CAG启动子。由此，可以提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。发明人惊奇地发现，当采用CAG启动子时，能够显著地提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达。 根据本发明的其他实施例，所述真核细胞启动子为组织特异性启动子。由此，可以根据宿主细胞的类型，选择适当的启动子，从而获得能够实现目的核酸序列的组织特异性表达。根据本发明的一个实施例，第二载体可以进一步包含增强子序列，其中，增强子序列与目的核酸序列可操作地连接。由此，可以进一步提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。根据本发明的实施例，增强子的类型不受特别限制。根据本发明的一些示例，增强子为CHS4增强子。发明人惊奇地发现，当采用CHS4增强子时，能够显著地提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达。根据本发明的一个实施例，目的核酸序列的两端分别具有适于同源重组的核酸序列。由此，可以提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率。根据本发明的实施例，适于同源重组的核酸序列的类型不受特别限制。根据本发明的一些示例，优选所述适于同源重组的核酸序列为细胞基因组中的非功能片段。由此，在提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率的同时，目的核酸序列的引入并不影响宿主细胞正常基因的表达和功能。附着子载体根据本发明第二方面，本发明提出了一种适于转化细胞的载体。根据本发明的实施例，该载体包含附着子序列。因而，在本发明中，该载体也可以称为附着子载体。利用附着子载体，可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。这里所使用的术语“载体”应作广义理解，其可以是任何能够将核酸序列引入宿主细胞内的媒介，包括但不限于质粒、粘粒、病毒、人工染色体等等。根据本发明的一些实施例，附着子序列的类型并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，所采用的附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以通过附着子与染色体骨架结合，或者与核基质结合，从而有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。更优选包含编码EBNAl和/或核基质附着区的核酸序列，可选地所述染色体骨架结合区是EBNA1。本申请的发明人惊奇地发现，当采用EBNAl作为附着子时，能够极大地提高构建无标记转基因细胞/动物的效率。为了便于利用这些载体转化宿主细胞，附着子载体还可以具有其他的元件，以赋予其附加的功能和效果。根据本发明的一个实施例，附着子载体可以进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本发明的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。本申请的发明人发现，当附着子序列与oriP相连时，所构建的载体在宿主细胞内能够十分有效地自主复制，可以显著提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本发明的一个实施例，附着子载体体可以进一步包括编码筛选标记的核酸序列。由此，可以有效地筛选转入附着子载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本发明的示例，筛选标记的类型并不受特别限制。根据本发明的一些示例，筛选标记可以为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。由此，可以非常容易地筛选已经引入附着子载体的宿主细胞，例如通过检测发光强度和在培养基中添加相应的药物。根据本发明的具体示例，发光蛋白可以为选自GFP和EGFP的至少一种。由此，可以通过检测所发出的绿色荧光，来筛选和验证附着子载体已经成功地被引入到宿主细胞中。根据本发明的具体示例，所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以通过在培养基中添加相应的抗生素，在培养后存活下来的细胞即为含有附着子载体的宿主细胞。由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。转基因细胞/动物及其制备方法根据本发明的第三方面，本发明提出了一种利用上面所述的载体制备转基因细胞的方法。该制备转基因细胞的方法包括以下步骤首先，使用前面所述的一组适于转化细胞的载体转化宿主细胞，以便获得转基因细胞。即可以采用第一载体(附着子载体)和第二载体(表达载体)转化宿主细胞，由此可以将附着子载体和表达载体引入到细胞中。根据本发明的实施例，附着子载体和表达载体被引入到细胞中的顺序不受特别限制，可以是同时被引入到细胞中，也可以是依次引入到细胞中，既可以先引入表达载体，也可以先引入附着子载体。根据本发明的实施例，宿主细胞的类型不受特别限制。根据本发明的一个实施例，所采用的宿主细胞为真核细胞。根据本发明的一些示例，优选真核细胞为动物细胞。更优选来自于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞。本申请的发明人惊奇地发现，根据本发明的实施例的制备转基因细胞的方法，特别适合于制备真核转基因细胞，尤其是动物细胞。当应用于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞时，所得到的转基因细胞，可以通过手工克隆的方法应用于制备转基因动物。根据本发明的一些具体示例，利用所述第一载体和所述第二载体共转化所述宿主细胞，即可以将附着子载体和表达载体同时引入到宿主细胞中。实现共转化的方法也不受特别限制，根据本发明的一些示例，可以通过脂质体法进行所述共转化。由此，可以提高将第一载体和第二载体同时引入宿主细胞中的效率。由此，可以方便地筛选目的核酸序列与宿主细胞的染色体成功地发生整合的转基因细胞，由此，进一步提高制备转基因细胞的效率。 需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列弓I入宿主细胞中的操作。接下来，分离转基因细胞，即染色体中含有所述目的核酸序列的转基因细胞。如前所述，由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。在分离转基因细胞后，可以通过PCR方法验证所述转基因细胞的基因组中含有目的核酸序列。当然也可以通过分析目的核酸序列表达蛋白的酶活性来验证。但从效率角度来考虑，优选通过PCR方法验证，因而，根据本发明的实施例，还进一步包括了通过PCR方法验证所述转基因细胞的基因组中含有所述目的核酸序列的步骤。该方法不仅在时间上、效率上、工作量上都较其他方法有很大的改进，可用于各类型无标记转基因细胞株制备、制备无标记转基因克隆动物等。
根据本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因动物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，转基因动物细胞是根据上面所述的制备转基因细胞的方法获得的。优选，所述动物为非人动物。正如上面所述的，该转基因动物细胞或其培养物的基因组中并不包含标记基因，由此，不会对转基因细胞的正常运转造成不利影响，也不存在额外的关于生物安全性的考虑。根据本发明的第五方面，本发明提出了一种制备非人转基因动物的方法。根据本发明的实施例，该制备非人转基因动物的方法包括以下步骤首先，提取非人转基因动物细胞或其培养物的细胞核。本领域技术人员可以理解， 能够采用任何已知的方法提取单细胞的细胞核，例如通过显微操作人工提取。根据本发明的实施例，所采用的细胞是基于前述方法所得到的无标记的细胞(在本发明中，筛选标记有时也简单地称为标记)。接着，将所提取的细胞核引入所述动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞。根据本发明的实施例，无核卵母细胞的来源并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，所述无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。由此，可以提高获得无核卵母细胞的效率，并且能够提高接受外源细胞核的效率。最后，将融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得所述非人转基因动物。 本领域技术人员可以理解，能够采用常规的方法，从卵母细胞获得动物个体，例如首先将卵母细胞培养获得囊胚，进一步将囊胚植入母体中进行发育，获得动物个体。因而，这里所使用的术语“培养”应作广义理解，其涵盖了从卵母细胞获得动物个体过程中所经历的各种为细胞/细胞集合体提供能量的操作。由此，可以有效地获得非人转基因动物，同时，所获得的非人转基因动物的染色体中不含标记基因，从而不会影响动物个体自身的正常运转，也不存在额外的关于生物安全性的考虑。根据本发明的第五方面，本发明提出了一种非人转基因动物或其后代。根据本发明的实施例，所述非人转基因动物是根据前面所述的制备非人转基因动物的方法获得的。 由此，根据本发明实施例的非人转基因动物的染色体中不含标记基因，从而不会影响动物个体自身的正常运转，也不存在额外的关于生物安全性的考虑。综上，根据本发明的实施例，本发明提供了一种可以通过将筛选标记构建在附着子质粒上，从而进行筛选细胞克隆方法，能够避免外源基因例如原核序列整合到宿主细胞例如真核细胞染色体中。并且，在附着子载体随着宿主细胞的分裂丢失后，筛选标记等具有附属功能的元件也都会丢失，从而避免了筛选标记基因整合入真核基因组而带来的潜在的危险，使外源目的核酸序列(在本发明中有时也称为“目的基因”)的整合更加安全。这将为转基因技术提供新的筛选途径和实验新思路。下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。一般方法
图1显示了实施例的一般方法。即1、构建附着子载体，从不同的质粒构建含有附着子序列和筛选基因的附着子载体。2、构建表达载体，从不同的质粒构建含有启动子、增强子、目的基因片段的表达载体。3、载体共转，将附着子载体和表达载体共转染细胞。4、获得阳性细胞克隆，利用附着子载体上面的筛选标记来筛选抗性细胞克隆。利用PCR技术鉴定阳性细胞克隆中附着子丢失情况。5、手工克隆方法生产转基因克隆利用手工克隆方法，制备转基因克隆胚胎，并移植，大规模生产转基因克隆动物。6、克隆动物鉴定利用克隆动物的DNA和RNA检测来鉴定克隆动物是否为带有目的基因的转基因猪。实施例1构建附着子载体合成引物，引物分别为Neo-F(SEQ ID NO 1) :ATGAGGATCGTTTCGCATGNeo-R(SEQ ID NO :2) TCAGAAGAACTCGTCAAGAAG 利用上述引物，从商业化载体pEGFP-Nl上扩增出NEO (即新霉素磷酸转移酶，其可以抵抗G418的杀伤作用)表达盒。其中，PCR条件为95"C 5min,(95°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin) X 30 个循环，72 °C 5min。PCR扩增产物大小为811bp。PCR扩增产物的两端分别具有KpnI和HindIII酶切位点。利用相应的限制性内切酶对PCR产物进行消化之后，使用相同的限制性内切酶消化携带EBNAl的商业化载体pCEP4载体，将经过消化的PCR产物与经过消化的pCEP4载体通过连接酶按照下面的连接条件进行连接连接体系为如下10 X T4连接酶缓冲液 1 μ 1，酶切pCEP4 载体2 μ 1，酶切PCR 产物5μ1，H2O2 μ 1。在16°C进行连接反应4小时。最后，构建获得了携带EBNAl的附着子载体 pEBNA-NEO，所构建的附着子载体的结构示意图如图2所示。实施例2表达载体构建合成引物，引物序列为EGFP-Fl(SEQ ID NO 3) :ATGGTGAGCAAGGGCGAGEGFP-Rl(SEQ ID NO :4) :CAACTAGAATGCAGTGAAAAAAAT。利用上述引物，从商业化载体pEGFP-Nl上扩增出pEGFP_Nl载体上扩增EGFP基因 (增强型绿色荧光蛋白)。
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PCR产物的两端分别具有EcoRI和BioI酶切位点。利用相应的限制性内切酶对 PCR产物进行消化之后，使用相同的限制性内切酶消化商业化载体pcDNA3. 1载体。将经过消化后的PCR产物与经过消化的pcDNA3. 1载体通过连接酶按照下面的连接条件进行连接构建得到PEGFP载体连接体系如下10XT4连接酶缓冲液1μ 1，酶切pcDNA3. 1 载体 2 μ 1，酶切PCR 产物5μ1，H2O 2 μ 1。在16°C进行连接反应4小时。合成引物，引物序列为CHS-Fl(SEQ ID NO 5) :GGAGCTCACGGGGACAGCCHS-Rl(SEQ ID NO :6) ' TCTCACTGACTCCGTCCTGG。利用上述引物，从鸡DNA中扩增CHS4片段。PCR产物的两端分别具有MfeI和MluI酶切位点。利用相应的限制性内切酶对PCR 产物进行消化之后，使用相同的限制性内切酶消化前面制备的构建体PEGFP载体。将经过消化后的PCR产物与经过消化的pEGFP载体通过连接酶按照下面的连接条件进行连接构建得到表达载体CHS-EGFP-CHS 连接如下10XT4连接酶缓冲液1μ 1，酶切pEGFP 载体 2μ1，酶切PCR 产物7μ1。在16°C进行连接反应4小时。设计引物重新扩增CHS4片段，引物两端添加酶切位点，通过利用相应的限制性内切酶消化和jM连接酶，将CHS4片段-连接入pCHS-EGFP载体中，构建得到pCHS-EGFP-CHS 载体。酶切pCHS-EGFP-CHS载体，获得CHS-EGFP-CHS表达盒。实施例3重组表达载体在细胞中的表达将前面所构建的附着子载体pEBNA-NEO和表达载体元件CHS-EGFP-CHS用脂质体法按照下列条件分别转染入HQ5猪肾细胞和猪成纤维细胞中将2 μ g附着子载体ρ^ΝΑ-ΝΕΟ和表达载体元件CHS-EGFP-CHS，加入 100 μ Iopti-MEM培养基中，然后加入脂质体混合，室温静置20min，滴加入培养细胞的6cm
培养皿中。在转染48小时后，在含有15% FBS的DMEM培养基中加入终浓度500 μ g/ml的 G418进行筛选，并观察EGFP表达情况。直到在荧光显微镜下能够观察到EGFP能够持续稳
定表达。实施例4验证附着子载体在阳性细胞克隆中的丢失在利用G418筛选之后大约6天，开始出现细胞克隆(如图4所示)。挑取荧光克隆改换用更换为不含G418的新鲜培养基继续培养(如图5和图6所示)。培养2天后，提取细胞克隆的DNA进行PCR鉴定，之后，每次传代均提取细胞DNA，分别鉴定EBNAl和Hygro
13片段。另外，根据下列实验验证附着子在阳性细胞克隆中缺失根据载体提供的EBNAl和Hygro序列，设计鉴定用PCR引物，对每次传代的细胞 DNA做PCR分析。PCR扩增条件是95"C 5min,(95°C 30s, 60°C 30s,72°C lmin)X30 个循环，72 °C 5min。结果示于图7和8中。如图7所示，附着子载体仍然存在于阳性细胞中。但图8 所示，确定附着子载体在经历细胞增殖一段时间之后已经丢失。实施例5重组表达载体在猪成纤维细胞中的表达根据与实施例3相同的方法，利用附着子载体pEBNA-NEO和表达载体 CHS-EGFP-CHS转染猪成纤维细胞，并且验证EGFP的稳定表达。实施例6转基因阳性细胞的筛选与鉴定按照与实施例4相同的方法，对实施例5中所得到猪成纤维细胞提取DNA和RNA， 鉴定是否有目的基因存在和表达。同时，鉴定EBNAl和Hygro片段丢失情况。结果显示，EGFP在猪成纤维细胞有显著表达，并且EBNAl和Hygro片段已经丢失。 由此，证明本发明的方法可以适用于多种动物体细胞。实施例7体细胞克隆制备无标记转基因动物根据常规的手工克隆的方法，利用前面实施例中构建的转基因成纤维细胞制备克隆猪，简言之，手工克隆的步骤包括卵母细胞的采集和体外成熟，去除卵丘细胞，透明带消化，去核，胞质与体细胞融合，电激活，体外培养至囊胚，移植胚胎。提供附着子载体丢失的细胞克隆做手工克隆，制备囊胚，待胚胎成熟后，移植至代孕母体内，待手工克隆猪出生。接下来，按照下列条件，通过直接观察与PCR的方法，鉴定克隆猪为带有目的基因即EGFP的转基因猪首先在紫外灯下观察是否有荧光；其次，取克隆猪的组织样品，提取 DNA和RNA做PCR鉴定。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
权利要求
1.一组适于转化细胞的载体，其特征在于，包括 第一载体，所述第一载体包含附着子序列；以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列， 其中，所述附着子序列优选包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列， 更优选包含编码EBNAl和/或核基质附着区的核酸序列，可选地所述染色体骨架结合区是 EBNAl ；任选地，所述第一载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列，所述复制起始点优选为 oriP ；任选地，所述第一载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列，所述筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自GFP和EGFP 的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种；任选地，所述第二载体进一步包含启动子，所述启动子与所述目的核酸序列可操作地连接，所述启动子优选为真核细胞启动子，所述真核细胞启动子优选为选自CAG启动子和 PGK启动子的至少一种，可选地所述真核细胞启动子为组织特异性启动子；任选地，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述目的核酸序列可操作地连接，所述增强子优选为CHS4增强子。
2.根据权利要求1所述的一组适于转化细胞的载体，其特征在于，所述目的核酸序列的两端分别具有适于同源重组的核酸序列，所述适于同源重组的核酸序列优选为细胞基因组中的非功能片段。
3.—种适于转化细胞的载体，其特征在于，所述载体包含附着子序列， 其中，所述附着子序列优选包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列， 更优选包含编码EBNAl和/或核基质附着区的核酸序列，可选地所述染色体骨架结合区是 EBNAl ；任选地，所述载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列，所述复制起始点优选为oriPo
4.根据权利要求3所述的适于转化细胞的载体，其特征在于，所述载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列，所述筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自GFP和EGFP的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。
5.一种制备转基因细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤使用权利要求1或2所述的一组适于转化细胞的载体转化宿主细胞，以便获得转基因细胞，优选利用所述第一载体和所述第二载体共转化所述宿主细胞，任选地通过脂质体法进行所述共转化；以及分离转基因细胞，其中，所述转基因细胞的染色体中含有所述目的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的制备转基因细胞的方法，其特征在于，进一步包括 通过PCR方法验证所述转基因细胞的基因组中含有所述目的核酸序列的步骤。
7.—种转基因动物细胞或其培养物，其中所述非人转基因动物细胞或其培养物是根据权利要求5或6所述的方法获得的，优选所述动物为非人动物。
8.一种制备非人转基因动物的方法，其特征在于，包括以下步骤 提取权利要求7所述非人转基因动物细胞或其培养物的细胞核； 将所述细胞核引入所述动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；将所述融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得所述非人转基因动物。
9.根据权利要求8所述的制备非人转基因动物的方法，其特征在于， 所述无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。
10.一种非人转基因动物或其后代，其中所述非人转基因动物是根据权利要求8或9所述的方法获得的。
全文摘要
本发明提供了一组适于转化细胞的载体、适于转化细胞的载体、制备转基因细胞的方法、非人转基因动物细胞、制备非人转基因动物的方法、非人转基因动物或其后代。根据本发明的实施例，所述的一组适于转化细胞的载体包括第一载体，所述第一载体包含附着子序列；以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列。利用这一组适于转化细胞的载体，可以有效地构建无标记的转基因细胞。
文档编号C12N15/877GK102367454SQ20111030670
公开日2012年3月7日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者刘欢, 战丽萍, 李勇, 杜玉涛, 杨焕明, 汪建, 王俊 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司