专利名称：长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种动物细胞工程领域，特别市一种培养鸡胚胎干细胞的方法及其专
用培养基。
背景技术：
胚胎干细胞是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的一种具有发育全能性的高度未分化细胞，可分化形成动物机体的绝大多数终端细胞以及具有生殖系传递能力，因此在组织器官工程、细胞治疗以及动物遗传修饰与操作等方面具有广阔的应用前景。胚胎干细胞具有自发分化的趋势，培养胚胎干细胞的关键技术是需要筛选合适的培养体系使细胞既能快速无限增殖又能保持未分化状态。常用方法包括(1)采用饲养层， 饲养层细胞通过某种尚不完全清楚的机理抑制胚胎干细胞的分化；(2)条件培养基条件培养基中含有抑制细胞分子的因子；(3)采用抑制细胞分化或促进细胞增殖的细胞因子， 包括白血病抑制因子，干细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子等等。自1981年Evans 等从延迟着床的小鼠早期胚胎成功建立胚胎干细胞系以来，基于上述一种或多种方法的联合运用，目前已在人、猪、牛、绵羊、山羊、水貂、恒河猴、马以及兔等物种实现了胚胎干细胞的长期传代培养并成功建立胚胎干细胞系或类胚胎干细胞系。但迄今为止，尽管有培养鸡胚胎干细胞的报道，但均只能在很短的时间内维持其未分化状态，尚未能实现鸡胚胎干细胞在体外的长期传代培养及建立细胞系。鸡胚胎干细胞不能在体外长期传代培养的一个重要原因是，目前的胚胎干细胞培养体系，包括培养基配方，均是基于鼠或人等哺乳动物而设计，而禽类细胞与哺乳动物细胞存在较大差异，一些适用于哺乳动物胚胎干细胞的培养条件或培养基配方，可能并不能完全满足鸡胚胎干细胞离体培养的需要。因此，这些培养条件或培养基配方，尽管能够在一段时间内使鸡胚胎干细胞维持未分化状态，但长期传代培养时将不能维持这种状态而导致细胞迅速分化。
发明内容
本发明的发明目的在于提供一种适用于鸡胚胎干细胞的培养体系，以实现鸡胚胎干细胞在体外的长期传代培养的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基。本发明的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法是这样实现的，分离
X期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层，用上
述鸡胚胎干细胞在专用培养基及37 38°C环境下培养，3飞天传代一次，专用培养基包括差件培养液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5 — 25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子10 — 50 μ g ；干细胞生长因子5 — 20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL，调pH值为7. 2—7. 5，条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后(通常为3天)，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。这里，滤膜是0. 22um微孔得滤膜，离心分离的转速为lOOOrpm，离心分离时间不少于5min。本发明的专用培养基包括条件培养液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5—25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子 10—50 μ g ；干细胞生长因子5 — 20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL, 调PH值为7. 2—7. 5,条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后(通常为3 天)，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。这里，滤膜是 0. 22um微孔得滤膜，离心分离的转速为lOOOrpm，离心分离时间不少于5min。本发明与已有技术相比，具有可以实现鸡胚胎干细胞的长期传代培养，并具有细胞增殖快、克隆获得率高的优点。
图1 (A)为在本发明所述培养体系中培养的传至第2代的鸡胚胎干细胞； 图1 (B)为在本发明所述培养体系中培养的传至第5代的鸡胚胎干细胞；
图1 (C)为在本发明所述培养体系中培养的传至第10代的鸡胚胎干细胞；
图1 (D)为在本发明所述培养体系中培养的传至第15代的鸡胚胎干细胞；
图1 (E)为在本发明所述培养体系中培养的传至第19代的鸡胚胎干细胞；
图1 (F)为在本发明所述培养体系中培养的传至第25代的鸡胚胎干细胞
图2(A)为碱性磷酸酶染色呈蓝紫色的鸡胚胎干细胞的鉴定；
图2(B)为免疫细胞荧光鉴定SSEA-I呈阳性的鸡胚胎干细胞的鉴定；
图2(C)为分化培养基中悬浮培养形成拟胚体并高度表达中胚层的鸡胚胎干细胞的鉴
定；
图2(D)为内胚层以及外胚层的标志基因CH-T的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图2(E)为内胚层以及外胚层的标志基因TTR的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图2(F)为内胚层以及外胚层的标志基因β-activin的鸡胚胎干细胞的鉴定； 图3为RT-PCR检测拟胚体中三个胚层特异性基因的引物序列。
具体实施例方式
现结合实施例对本发明做进一步详细描述 (一)试验动物及细胞系
受精种鸡蛋购自广东省食品企业集团佛山市南海种禽有限公司；清洁级怀孕12. 5 d 昆明小白鼠购自南方医科大学实验动物中心；STO细胞系购自武汉大学保藏中心(中国典型培养物保藏中心)；大鼠肝细胞系(buffalo rat liver cell，BRL-3A细胞)购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。(二)溶液或试剂配制
1. PBS 的配制称取 NaCl 8. Og^Na2HPO4 3. 63g、KCl 0. 2g KH2PO4 0. 24g 溶于适量超纯水，调PH值至7. 4，定容至IOOOmL ； IOOrnl/瓶分装，15磅高压灭菌30min，4°C保存备用。2. DMEM的配制取DMEM —包(葡萄糖含量13. 5克，Gibco公司)用适量超纯水溶解，称取NaHCO3 3. 7g，溶于超纯水中混勻，加青链霉素I mL (10万IU/mL)，用超纯水定溶至1000 mL，调pH 7. 2左右，0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，100 mL分装，4°C保存备用。3. Hanks液的配制取Hanks —包(Gibco公司)用适量超纯水溶解，称取NaHCO3 0. 35g，溶于超纯水中混勻，加青链霉素1 mL (10万IU/mL)，用超纯水定溶至1000 mL，调pH 7. 2左右，0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，100 mL分装，4°C保存备用。4.胰蛋白酶的配制称取胰蛋白酶0. 25g溶于100 mL PBS，0. 22μπι微孔滤膜过滤除菌，1 mL分装，4°C保存备用。5.干细胞生长因子的分装取一个包装的干细胞生长因子(Invitrogen公司)溶于100 μ L超纯水，加入含10% (体积百分比)胎牛血清的DMEM培养液9. 9 mL,充分混勻， 0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后100 PL分装，-20°c密封保存，使用时胚胎干细胞培养液稀释为所需浓度。6.碱性成纤维细胞生长因子的分装取一个包装的碱性成纤维细胞生长因子 (Invitrogen公司)溶于100 μ L Tris (ΡΗ7. 6)，加入含10% (体积百分比)胎牛血清的DMEM 培养液4. 9 mL,充分混勻，0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌后100 μ L/管分装，_20°C密封保存。使用时用胚胎干细胞培养液稀释为所需浓度。7.白血病抑制因子的分装取一个包装的白血病抑制因子(Millipore公司)， 加入含10% (体积百分比)胎牛血清的PBS 9.5 mL，充分溶解后0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌，200 1117管分装，2、1密封保存。使用时胚胎干细胞培养液稀释为所需浓度。8.丝裂霉素一 C的配制2 mg丝裂霉素一 C溶于20 mL PBS使其完全溶解，配成浓度为100 yg/mL的贮存液，0.22 μ m微孔滤膜过滤除菌后1 mL/管分装，-20°C保存， 使用时DMEM稀释为10 μ g/mL。9. 0. 1%明胶的配制称取0. Ig明胶充分溶解于100 mL三蒸水中，15磅高压灭菌 30min，4°C保存备用。10. EDTA 的配制称取 EDTA 0. 2g、NaCl 0. 8g、KCl 0. 02g, Na2HPO4 · 12H20 0. 289 g、KH2PO4 0. 02g溶于100 mL超纯水，15磅高压灭菌30 min, 4°C保存备用。11. 0. 25%胰蛋白酶-EDTA消化液的配制0. 25%胰蛋白酶与EDTA以1 1配制。12. BRL-3A细胞培养液高糖DMEM培养基中加入如下物质5% (体积百分比)胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、1% (体积百分比)双抗。实施例1鸡胚胎干细胞的培养 1.饲养层的制备
(1)小鼠胚胎成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞以及STO细胞株按常规方法培养于含 10% (体积百分比)胎牛血清、1% (体积百分比)双抗的高糖DMEM培养液；
(2)80%-90%细胞汇合时，弃培养液，PBS洗2—3次；
(3)加入终浓度为10μ g/mL的丝裂霉素-C，37°C孵育2 — 2. 5 h ；
(4)弃丝裂霉素-C，PBS充分洗涤细胞6—7次，确保完全去除丝裂霉素-C；
(5)加适量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化30s左右，加DMEM液终止消化，充分吹打，制备单细胞悬液；
(6)1000rpm离心5— 8 min，用含10% (体积百分比)胎牛血清、1% (体积百分比)双抗的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为5 X IO5个/mL，接种于经0. 1%明胶包被的培养板，置37°C，5%C02，培养箱中培养；
(7) 24 h后观察细胞生长情况，若细胞未能铺满单层则补加丝裂霉素C处理过的细胞，以确保细胞能连成一片而没有间隙；制备好的饲养层在5 d内使用。2.条件培养液的制备
(1)BRL-3A细胞接种于培养瓶，用BRL-3A细胞培养液培养；
(2)待细胞80%-90%汇合时，弃培养液，每55cm2生长面积的细胞加入10mL新鲜BRL-3A 细胞培养液；
(3)3 d后收集BRL-3A细胞培养液，置无菌瓶，-20°C冻存，使用前0.22μπι微孔滤膜过滤除菌，并调整PH值至7.2。3.鸡胚胎干细胞专用培养基的配制
分别取600、800、900 mL上述BRL-3A细胞条件培养液，加入如下成份胎牛血清50或 100或150 mL，鸡血清5或10或20 mL，非必需氨基酸中的一种或几种共计5或10或25 mL，L-谷氨酰胺0. 146或0. 200或0. ^2g，β-巯基乙醇6或8或14 μ L、小鼠白血病抑制因子1\106或1.5\106或2父106 IU、碱性成纤维细胞生长因子10或30或50 μ g、干细胞生长因子5或10或20 μ g，用DMEM高糖培养基定容至1000 mL,配制成鸡胚胎干细胞专用培养基，4°C保存备用。4.鸡胚胎干细胞的分离与培养
(1)取新鲜受精种鸡蛋，新洁尔灭浸洗，再用75%酒精消毒，气室朝上静置5min ；
(2)无菌条件下打开鸡蛋，将鸡蛋置于无菌培养皿中，分开蛋清和蛋黄，并使胚盘朝上， 去除卵黄周薄膜上的蛋清；
(3)将一小片中央穿孔(直径约为5mm)的滤纸放置到蛋黄上，使胚盘显露在孔的中央， 眼科剪沿着滤纸快速的剪开卵黄膜，轻轻提起滤纸即可分离出胚盘；
(4)将附着在滤纸上的胚盘浸入PBS，小心洗去附着的卵黄；
(5)显微镜下用发环去除胚盘的暗区，移液器吸取明区细胞，加入鸡胚胎干细胞培养基，轻轻吹打成离散的单个细胞或细胞团，分别接种于上述小鼠胚胎成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞或STO细胞制备的饲养层，置培养箱37°C、5% CO2条件下培养，每M h半量换液，观察细胞的生长状态；
(6)7-8 d后，在饲养层上观察到到呈集落状生长的鸡胚胎干细胞；
(7)通过鸡胚胎干细胞的生长状态、集落形成的数目及大小、集落的分化状态等条件确定优化的鸡胚胎干细胞培养体系其中效果最好的饲养层细胞为STO细胞，最佳培养基配方为条件培养液800 mL，胎牛血清100 mL，鸡血清10 mL，非必需氨基酸10 mL，L_谷氨酰胺0.146 g，β-巯基乙醇8 μ L、小鼠白血病抑制因子IX IO6 IU、碱性成纤维细胞生长因子 20 μ g、干细胞生长因子10 μ g，用DMEM高糖培养基定容至1000 mL，pH值7. 4。5.鸡胚胎干细胞的传代培养
(1)选择细胞集落生长良好，隆起明显，边缘清晰，形态未表现分化的集落，PBS清洗1 或2次；
(2)加入新的PBS，37°C孵育8或9或10 min，在显微镜下观察到细胞集落与饲养层稍分开时弃PBS，加入鸡胚胎干细胞专用培养基；
(3)用吸管吸出细胞，适度的吹打获得小细胞团，将细胞接种至2个新的已制备饲养层的培养孔，置培养箱37°C、5% CO2条件下培养，每M h半量换液；
(4)待细胞生长成明显集落后重复(1) - (3)的操作进行一下代的细胞传代，在该培养体系中，传至25代仍能保持鸡胚胎干细胞的未分化状态及高度增殖能力。鸡胚胎干细胞的鉴定
将实施例1中得到的传至2—25代的鸡胚胎干细胞采用如下方法进行鉴定 1.形态学鉴定
鸡胚胎干细胞与其它物种胚胎干细胞的形态类似，呈典型的集落状生长，细胞集落与饲养层界限清晰，细胞连接紧密(见图1 (A) —图1 (F))，通过在显微镜下观察其形态可初步鉴定。2.碱性磷酸酶染色鉴定
取生长状态良好的鸡胚胎干细胞，弃培养液，PBS洗涤以去除残余培养基；加入4%多聚甲醛4°C固定15或20或30 min，弃固定液，PBS洗涤3次；加入BCIP/NBT染色液在37°C 孵育1. 5或1. 8或2 h，PBS洗涤3次，倒置显微镜下观察。结果显示鸡胚胎干细胞呈蓝紫色，而饲养层细胞以及已分化细胞不着色(见图2 (A))。3.胚胎干细胞表面特定抗原(SSEA-I)免疫细胞荧光法染色鉴定
取生长状态良好的鸡胚胎干细胞，弃培养液，PBS洗涤，加入预冷的固定液(丙酮无水乙醇3:2)固定30 min以上；PBS漂洗3次，加入封闭液(含10%胎牛血清的PBS)处理2 h； PBS漂洗，加入一抗(SSEA-I)，37°C水浴避光孵育1 h，PBST洗涤5 min X 3次，加入二抗 (IgG-FITC)，37°C水浴避光孵育45 min，PBST洗涤5 min X3次，加60%甘油一滴，荧光显微镜下观察。结果显著鸡胚胎干细胞SSEA-I呈阳性，细胞显黄绿色荧光，而饲养层细胞以及已分化细胞呈阴性(见图2 (B))。4.体外分化试验
(1)鸡胚胎干细胞的悬滴培养用口吸管和剥离针把鸡胚胎干细胞克隆挑出，经 0.05%胰蛋白酶消化液消化为分散的鸡胚胎干细，离心，弃上清；加入10 mL分化培养基， 反复吹打形成细胞悬液，用多孔移液管在100 mm组织培养皿盖下面滴加5排30 μ L/滴 (IO4ceIlsAiL)的细胞悬液，小心翻转盖子，使液滴悬挂于培养皿盖子上，并置于含10 mL PBS的培养皿上，37. 50C，5% CO2培养箱中培养2 d ；
(2)分化胚胎干细胞的悬浮培养胚胎干细胞经2d悬滴培养后，小心翻转培养皿盖子并收集液滴，转移到35 mm培养皿中，培养液中含20% (体积百分比)胎牛血清，不加任何抑制分化因子成分，并每天用吸管吹打，防止形成的拟胚体贴壁，在培养箱中继续悬浮培养5 d，隔天半量换液，可观察到形成拟胚体(见图2 (C))；
(3)ES细胞自然分化将上述所得拟胚体转移到含2 mL分化培养基、经0. 1%明胶处理的M孔培养板中，每孔接种一个拟胚体，让鸡胚胎干细胞贴壁进行自然分化；
(4)RT-PCR法检测拟胚体中三个胚层特异性基因的表达CH-T、TTR及β-activin 分别是中胚层、内胚层及外胚层的标志性基因，常规RT-PCR检测拟胚体中这三个标志基因的表达情况。结果表明拟胚体经自然分化后可高度表达上述三个胚层的标志基因，提示鸡胚胎干细胞经自发分化后可形成三个胚层的细胞(见图2的D、E、F及图3)。
权利要求
1.长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于分离期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层，用上述鸡胚胎干细胞在专用培养基及37 38°C环境下培养，3飞天传代一次，专用培养基包括差件培养液600—900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5—20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5 — 25 mL ；L-谷氨酰胺0. 146—0. 292 g ； β -巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1一2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子10 — 50 μ g ；干细胞生长因子5 — 20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL，调pH值为7. 2—7. 5,条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。
2.根据权利要求1所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于分离X期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层是这样实现的，包括(1)小鼠胚胎成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞以及STO细胞株按常规方法培养于含体积百分比为10%的胎牛血清、体积百分比卫1%的双抗的高糖DMEM培养液；(2)80%-90%细胞汇合时，弃培养液，PBS洗2— 3次；(3)加入终浓度为10μg/mL的丝裂霉素-C，37°C孵育2 — 2. 5 h ；(4)弃丝裂霉素-C，PBS充分洗涤细胞6—7次，确保完全去除丝裂霉素-C；(5)加适量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化30s左右，加DMEM液终止消化，充分吹打，制备单细胞悬液；(6)1000rpm离心5— 8 min，用含体积百分比为10%胎牛血清、体积百分比为1%的双抗的高糖DMEM培养液重悬细胞，调整细胞密度为5 X IO5个/mL，接种于经0. 1%明胶包被的培养板，置37°C，5%C02，培养箱中培养；(7)24 h后观察细胞生长情况，若细胞未能铺满单层则补加丝裂霉素C处理过的细胞，以确保细胞能连成一片而没有间隙。
3.根据权利要求1或2所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于培养 BRL-3A细胞是将BRL-3A细胞接种于培养瓶，用BRL-3A细胞培养液培养。
4.根据权利要求3所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于培养 BRL-3A细胞时待细胞80%-90%汇合时，弃培养液，每55cm2生长面积的细胞加入10 mL新鲜 BRL-3A细胞培养液。
5.根据权利要求4所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法，其特征在于加入新鲜 BRL-3A细胞培养液3天后收集BRL-3A细胞培养液一即上清液，置无菌瓶，_20°C冻存，使用前离心分离并经过0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，然后调整pH值至7. 2。
6.长期传代培养鸡胚胎干细胞的专用培养基，其特征在于包括— 900mL ；胎牛血清50—150 mL ；鸡血清5 — 20 mL 非必需氨基酸中的一种或几种混合物5— 25 mL;L-谷氨酰胺0. 146 — 0.四2 g; β-巯基乙醇6 —14 μ L ；小鼠白血病抑制因子1 一 2 X IO6 IU ；碱性成纤维细胞生长因子10—50 μ g ；干细胞生长因子5—20 μ g，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000 mL，调pH值为7. 2—7. 5,条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。
7.根据权利要求6所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的专用培养基，其特征在于培养BRL-3A细胞时待细胞80%-90%汇合时，弃培养液，每55cm2生长面积的细胞加入10 mL新鲜BRL-3A细胞培养液。
8.根据权利要求7所述的长期传代培养鸡胚胎干细胞的专用培养基，其特征在于加入新鲜BRL-3A细胞培养液3天后收集BRL-3A细胞培养液一即上清液，置无菌瓶，_20°C冻存，使用前离心分离并经过0. 22 μ m微孔滤膜过滤除菌，然后调整pH值至7. 2。
全文摘要
长期传代培养鸡胚胎干细胞的方法及其专用培养基，其特征在于分离期胚盘明区的细胞，经机械吹打分散成单个细胞或小细胞团后，接种于STO饲养层，用上述鸡胚胎干细胞在专用培养基及37~38℃环境下培养，3~5天传代一次，专用培养基包括条件培养液600-900mL；胎牛血清50-150mL；鸡血清5-20mL；非必需氨基酸中的一种或几种混合物5-25mL；L-谷氨酰胺0.146-0.292g；β-巯基乙醇6-14μL；小鼠白血病抑制因子1—2×106IU；碱性成纤维细胞生长因子10-50μg；干细胞生长因子5-20μg，将上述成分用DMEM高糖培养基定容至1000mL，调pH值为7.2-7.5，条件培养液是这样获得的，培养BRL-3A细胞至细胞汇合后，收集培养细胞的上清液，离心分离后再经滤膜过滤所得即为条件培养液。本发明与已有技术相比，具有可以实现鸡胚胎干细胞的长期传代培养，并具有细胞增殖快、克隆获得率高的优点。
文档编号C12N5/0735GK102329771SQ20111030660
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者王丙云, 计慧琴, 陈志胜, 陈胜锋 申请人:佛山科学技术学院