专利名称：短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因的原核表达载体和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物基因工程领域，具体涉及一种高效表达短芽孢杆菌甲醛脱氢酶蛋白(FALDH)的原核表达载体及其该原核表达载体在制备FALDH包涵体蛋白中的应用。
背景技术：
甲醛是一种无色，有强烈刺激气味的气体，易溶于水、醇和醚。它反应能力极强， 能与蛋白质，核酸和脂类产生非特异性的反应(Feldman等，Prog Nucleic Acid Res Mol Biol, 1973，13:1-49)，是一种非常活泼的化合物，因此对所有的生物来说都有很高的毒性。 甲醛被广泛用于工业生产中，是制造树脂、胶粘剂、油漆、塑料、人造纤维的原料，是胶粘剂工业应用最广泛的化学原材料。随着经济的发展和人民生活水平的提高，各种原料制成的建筑装饰材料已走入各种室内公共场所和家庭，使甲醛成为室内空气污染公认最具代表性的化学物质。人们入住新居都要进行室内装饰和更新家具，其正是室内空气甲醛污染的主要来源。甲醛污染危害严重的场所是居室、办公室、会议室、宾馆、KTV包房、家具商场、建材商场等。室内空气中游离甲醛浓度在中国规定的允许值是0.08 (mg /立方米)，有调查表明新的宾馆客房室内空气中甲醛浓度最高达0. 36mg/立方米，平均为0. 173mg/立方米， 是室外对照的13倍。而家具商场最高达0. 873mg/立方米，平均为0. 432mg/立方米，是室外对照的33倍。建成一所经过装饰的实验室，空气中甲醛平均浓度高达0. 5mg/立方米，是室外的62.5倍。抽样检测发现单位及住户室内环境污染严重，查了 11家只有1户合格，其中竟有1户甲醛超标25倍。甲醛为较高毒性物质，当室内空气中甲醛含量为0. Img/立方米时，就有异味和不适感；达到0.5 mg/立方米时，可刺激眼睛，引起流泪；达到0.6 mg/立方米时，可引起咽喉不适或疼痛。浓度更高时，可引起恶心呕吐，咳嗽胸闷，气喘甚至肺水肿；达到30 mg/立方米时，会立即致人死亡。长期接触低剂量甲醛可引起慢性呼吸道疾病，引起鼻烟癌、结肠癌、 脑瘤、月经紊乱、细胞核的基因突变，DN A单链内交连和D N A与蛋白质交连及抑制D N A损伤的修复、妊娠综合症、引起新生儿染色体异常、白血病，这就是所谓的装修综合病 (sick_house)0相对于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、游离甲苯二异氰酸酯(TDI)、挥发性有机化合物(VOC)等有害物质来说，甲醛具有潜伏周期长(3-15年)、隐藏深、分布广、易挥发、治理难、危害大等特性。目前清除污染甲醛通常使用的方法有三种一是使用环保材料；二是开窗通风；三是用植物或除污剂清除污染，使用除污剂有二次污染的可能。用室内栽培植物清除甲醛污染，是最自然、最环保的方式，科学研究证明确实有些植物能够吸收分解甲醛，但吸收能力和速度非常有限(Giese 等，1994，Plant Physiol. 104: 1301-1309)。已有研究表明外源甲醛能够作为碳源被整合入光合细胞的代谢产物中。比如，普通的挂兰在1 标记的甲醛上生长时通过一碳代谢产生1V标记的产物，如丝氨酸和卵磷脂。甲醛可以和谷胱苷肽，精氨酸，天冬酰氨和四氢叶酸形成加合物后通过不同的途径进行代谢(GIESE 等，/^wi Physiol, 1994，104(4) 1301-1309)。对几种真核生物的生化和遗传学研究表明谷胱苷肽依赖型甲醛脱氢酶(FALDH)是甲醛代谢的关键酶之一，此酶广泛存在于植物体的所有组织中，它催化的反应以甲醛和谷胱苷肽的加合物硫代羟甲基谷胱苷肽(S-hydroxymethylglutathione)为底物产生硫代甲酰基谷胱苷肽(S-formylglutathione)。在植物中还有硫代甲酰谷胱苷肽水解酶，它能把 -formylglutathione分解为甲酸和谷胱苷肽，这两个酶组成一条甲醛到甲酸的氧化途径。Achkor等人为了检测甲醛脱氢酶在植物中的功能，对源于拟南芥FALDH基因进行遗传操作，得到了不同FALDH水平的拟南芥转基因株系。用组成型启动子CaMV 35S过量表达此酶的拟南芥对外源甲醛的摄取效率提高25%，FALDH水平降低的植物(由于共抑制表型或者反意表达)和野生型拟南芥相比，甲醛脱毒速率显著减慢。这些结果表明植物吸收甲醛的能力与FALDH活力水平相关(Achkor等，Plant Physiol，2003, 132(4) 2248-225 。因此FALDH的过量表达可用于提高观赏植物代谢甲醛能力的分子育种，把 faldh整合到植物基因组后，FALDH蛋白在植物中的表达量是转基因是否起作用的关键， 其中FALDH蛋白特异性抗体是检测转基因植物中FALDH蛋白表达水平的有效工具。有研究用PKK223-3载体和T^c启动子(trp promoter和lac promoter的杂合体)在大肠杆菌JM109中表达FALDH蛋白，获得有生物活性的FALDH蛋白(Dolferus等，Genetics, 1997，146:1131-1141)。Achkor等把/WA亚克隆于酵母表达载体(phs2)，然后在酵母菌中表达FALDH，从转基因酵母中纯化到FALDH蛋白，并用于制备FALDH的抗体(Achkor等， Plant Physiol, 2003, 132(4) 2248-2255)。但是在酵母表达系统中FALDH蛋白表达量不高，所以FALDH蛋白纯化操作过程很复杂，通常用这种方法纯化FALDH蛋白需要大规模培养酵母菌，过几种性质不同的柱子，并用专业的仪器控制洗脱条件，蛋白纯化的成本很高， 因此这种方法不方便重复使用。此外来源于植物的甲醛脱氢酶稳定性差，很多研究结果说明来自耐热性微生物的酶稳定性好，应用范围广，作用效果好。至今还没有研究用耐热甲基营养短芽孢杆菌(BreviBaciIlus brevis)甲醛脱氢酶基因ifaldti)构建其原核表达载体。
发明内容
本发明的目的是提供一种短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因/WA的原核表达载体 m^-faldh及其在制备FALDH包涵体蛋白中的应用，该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点、T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列和/WA基因及一个 ■ faldh基因的起始密码子上游的由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列，载体中的faldh 基因来源于短芽孢杆菌，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，其在GenBank中的登录号为JN098517 ；利用该载体转化大肠杆菌(BL21)，实现FALDH蛋白的高水平表达，表达的 FALDH蛋白80%以上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FALDH蛋白，再从凝胶中回收FALDH蛋白可得到纯度极高的FALDH蛋白，可作为抗原用于FALDH抗体的制备。FALDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FALDH 蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案 1、/WA基因的克隆
faldh基因的扩增策略如图1所示。
(1)从 GenBank 中查找相近物种(包括fecAericAia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damseIae subsp. Piscicida, Pichia pastoris, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脱氢酶基因的氨基酸序列，根据氨基酸保守序列设计序列如下的一对简并引物
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC
以短芽孢杆菌iBreviBacillus brevis )基因组DNA为模板扩增，得到faldh基因的部分片段/A/;
(2)回收并纯化faldh基因的部分片段fld，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD-/7i/，将正确的重组质粒送测序公司测序；
(3)将/WA基因的部分序列/A/在NCBI上进行比对，根据同源性最高的短小芽孢杆 ■ (Mcillus pumilus)的甲醛脱氢酶基因序列设计序列如下的一对特异性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢杆菌基因组DNA为模板扩增，得到faldh基因的全长片段；
(4)回收并纯化/WA全长基因片段，并将其连接到pMD-18T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-T-/WA。、原核表达载体pET3h-faldh的构建
原核表达载体pET3h- faldh的构建策略如图4所示。根据faldh基因序列，设计了扩增全长faldh基因的一对引物FDHNcoI和 FDHXhoI，并在5’ -端引物加AfcoI酶切位点，3，-端引物加损ol酶切位点，序列如下
FDHNcoI :5’ -CCATGGGAGCTGTTACGTACCA-3’ FDHXhoI :5’ -CTCGAGTTATGGCTTTAAAATGACCTT-3’
以短芽孢杆菌基因组DNA为模板，本发明用引物FDHNcoI/FDHXhoI PCR扩增得到faldh 基因的全长片段(1. 2kb),回收并纯化/WA全长基因片段，并将其连接到PMD-18T载体后得到重组质粒PMD18T-/WA ；根据重组质粒pMD18T-/WA中基因序列约750bp处和 PMD18-T载体多克隆位点都有5^1酶切位点，选择限制性内切酶5^1对质粒进行单酶切， 其酶切片段大小和预期结果一致，说明构建载体成功。对检测正确的PMD18T-/WA质粒用限制性内切酶AfcoI和损ol进行双酶切，切割回收目的片段/WA。同样用AfcoI和损ol将原核表达载体PET3M切开，回收pET3h载体片段。将回收的目的基因faldh片段分别和载体片段进行连接，获得重组质粒命名为。对mUaldh进行酶切和PCR 检测。、重组蛋白FALDH原核表达条件的优化
将含有/WA基因的原核表达载体导入五coli BL2KDE3)中，在30°C 温度下对目的蛋白进行不同IPTG浓度、不同时间的诱导表达，最终确定重组蛋白的最优表达条件。和转化空载体菌株相比重组菌在58kDa处有明显的蛋白条带出现，与理论上推定的重组蛋白值基本相符，初步说明FALDH重组蛋白在大肠杆菌中得到表达。在ImM IPTG、 30°C诱导Mi时，目的蛋白FALDH在总蛋白中所占比例最高，确定为该蛋白的最优表达条件。
FALDH重组蛋白按初步摸索的蛋白表达最优条件(ImM IPTG，30°C诱导他)进行表达，并对重组菌进行超声波破碎，SDS-PAGE确定FALDH在重组菌中的表达形式，实验结果显示80%表达的重组蛋白是以包涵体的形式存在于菌体沉淀中。、FALDH重组蛋白的纯化
根据最优蛋白表达条件(30°C，ImM IPTG，6h)，对重组菌进行重组蛋白大量诱导表达， SDS-PAGE后经0. 25M KCl染色进行目的蛋白割胶回收，回收目的蛋白。再次电泳和透析，检测蛋白纯度，同时利用BSA (0. 1%)定量，回收样品浓度达2 μ g/μ 1。本发明现对于现有技术的优点和效果
以上实验结果表明利用faldh基因的原核表达载体mUaldh转化大肠杆菌 (BL21)，可实现FALDH蛋白的高水平表达，表达的FALDH蛋白80%以上形成包涵体，用高浓度的尿素溶解包涵体后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离FALDH蛋白，再从凝胶中回收FALDH 蛋白可得到纯度极高的FALDH蛋白，可作为抗原用于FALDH抗体的制备。FALDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FALDH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
图1是本发明faldh全长基因的扩增策略图。图2是本发明faldh部分基因TA克隆载体pMD_/7i/的电泳检测图。A是β. 知eris基因组电泳图，基因组汲知eris基因组，M: Marker III ； B是PCR扩增/WA基因部分片段/7 /，M: Marker III，1_4 :PCR扩增产物；C是质粒 ρΜ 18- ~faldh电泳检测，stopl 对照质粒-,fldl- fld6 :pMD-/7i/质粒；D是重组质粒 pMD18-T-/7i/的 PCR 检测，M:MarkerIII ； 1-3,6-9 以 pMD18_T-/7i/为模板扩增的 PCR 产物； 4-5 负对照；E是重组质粒pMD18-T-/7i/双酶切检测，M: Marker III ； 1_3为feci和&0RI 双酶切PMD18-T- /7 /产物。图3是本发明faldh全长基因TA克隆载体pMD18_T-/WA的电泳检测图。A是召.brevis基因组电泳图，M: Marker III, B. brevis基因组；B是PCR扩增 /aA/A基因全长片段，1-5 :PCR扩增产物，M: Marker III ；C是质粒pMD18_T-/aA/A电泳检测，1-9 :pMD18-T-/a7i/A质粒，对照对照质粒；D是重组质粒pMD18_T-/WA的单双酶切检测，M: Marker III ；单为&0RI单酶切，双为III和I双酶切；E是重组质粒 pMD18 - -faldh 的 PCR 检测，1-2 扩增产物，Μ: Marker III。图4为本发明faldh基因原核表达载体构建策略图。图5为本发明原核表达载体的电泳检测图。A是pMD18T-/WA质粒单酶切检测，1_2 为正向连接质粒，3_4为反向连接质粒，未切为原始质粒；B是AfcoI/iXoI双酶切质粒pMD18T-/WA和ρΕΤ3^ι ；C是重组质粒 m^a-faldh 电泳检测，1-12 重组质粒(7. lkb)，13 对照质粒(7. 4kb) ；D 是质粒mUaldh的酶切检测，1-4 重组质粒mUaldh酶切产物，5 原始质粒，M: Marker III ；E是重组质粒的PCR检测，1 扩增产物；2 阴性对照；M: Marker III。
图6是本发明克隆的短芽孢杆菌FALDH重组蛋白SDS-PAGE电泳检测分析图。A是FALDH重组蛋白表达条件优化的检测图，1-5 :30°C，ImM IPTG条件下分别诱导 0、2、4、6、8h ;M 蛋白 Marker #SM0431 ； 6-10 :30°C，0. 5 mM IPTG 条件下分别诱导 0、2、4、 6、8h ;11 :pET32a 空载体；
B是SDS-PAGE检测FALDH重组蛋白的表达形式，1 :30°C、ImM IPTG诱导6h上清；2 30°C、lmM IPTG 诱导 6h菌体沉淀；3 :30°C、0. 5mM IPTG诱导 6h上清；4 :30°C、0. 5mM IPTG 诱导6h菌体沉淀；5 :pET32a空载体；M 蛋白Marker#SM0431。图7是检测FALDH重组蛋白纯化的SDS-PAGE电泳1 未纯化的重组蛋白；2-3 纯化的重组蛋白；4 :3μ1 BSA ；5 :5μ1 BSA0
具体实施例方式本实施例中采用的试剂主要为分子生物学实验试剂，各种限制性内切酶、Taq DNA 聚合酶和dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自博大泰克生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1 -.faldh基因的扩增
从 GenBank 中查找相近物种(包镇 Escherichia coli K-12, Paracoccus denitrificans, Photobacterium damseIae subsp. Piscicida, Pichia pastoris, Rhodobacter sphaeroides 2.4. 1)甲醛脱氢酶基因的氨基酸序列，根据氨基酸保守序列设计一对简并引物，序列如下
fid 3: GGNCAYGARCCNATGGGNATNGTNGARGA fid 4: TCCATNCCNACRCARTCNATNACNACRTC
用下述方法提取短芽孢杆菌(^r^ifeciBm力reris)基因组DNA 挑取生长良好的单菌落接种于LB液体培养基中于30°C震荡培养过夜；按1%接种量转接到IOOml新鲜LB液体培养基中，于37°C震荡培养4h(0D6QQ=2. 0)，6000rpm/min离心收集菌体；加入1/10菌液体积的 SI 溶液(0. 3M Sucrose, 25 uM Tris-HCL (ρΗ8· 0) 25mM EDTA)，混勻，37°C放置 1 2h ；加 Λ 9/10 菌液体积的 SII 溶液(0. IM NaCl，0. 1% (ff/V)SDS, 0. IM Tris-HCl )，轻轻混勻； 反复冻融裂解使溶液透明，加入等体积的Tris-饱和酚，抽提2次，取上清液；用等体积的氯仿/异戊醇(24 :1)抽提一次；用1/10体积3M NaAC，2倍体积无水乙醇沉淀DNA ； 12000rpm, 离心5min，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥备用；用适量含有RNaseA的水溶解，37°C放置Ih ；电泳检测，-20°C保存备用；若提取基因组不纯，可进一步纯化。以基因组DNA为模板，用/7^/ 3 和/7^/4为引物进行PCR，扩增得到/WA基因的部分片段(约600bp，简称/7必(图2Β)； 回收并纯化/WA基因的部分片段/7A并将其连接到pMD-18T (大连宝生物公司)载体上 (连接方式见图1)，转化大肠杆菌感受态DH5ci (天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒 DNA (图2C)，经琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。以重组质粒为模板，用引物3和fid 4扩增到0. 6kb的PCR产物(图 2D )。根据阳性重组质粒pMD-/7i/载体两端的多克隆位点，用I和双酶切重组质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒pMD-/7i/酶切产物为2. 7kb 和0. 6kb左右的条带(图2E)，将正确的重组质粒送测序公司测序；将/7 /序列在NCBI上进行比对，根据同源性最高的短小芽孢杆菌OfeciBm的甲醛脱氢酶基因序列设计
序列如下的一对特异性引物
fid 7 :GTGAGAGCTGTTACGTACCA fid 8 :TTATGGCTTTAAAATGACC
以短芽孢杆菌基因组DNA为模板PCR，扩增得到/WA基因的全长片段约1.21Λ(图:3B); 回收并纯化/WA全长基因片段，并将其连接到PMD-18T载体上(大连宝生物公司)，转化大肠杆菌感受态DH5ci (天根生化科技)，采用碱裂解法提取质粒DNA(图3C)，经琼脂糖凝胶电泳，选取大小和理论值相符的重组质粒做进一步的PCR检测和双酶切检测。根据阳性重组质粒PMD18-T-/WA载体两端的多克隆位点，用单酶切和历力(1111和&01 1双酶切重组质粒，经1 %琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，连接成功的重组质粒PMD18-T-/WA 单酶切产物理论上为3. 91Λ，双酶切产物为2. 7kb和1. 2kb左右的条带(图3D)。以重组质粒为模板，用引物fid 7和fid 8扩增到1. 2kb的PCR产物(图3E)。实施例2 原核表达载体pET3h- faldh的构建 原核表达载体pET3h- faldh的构建策略如图4所示。根据faldh基因序列，设计扩增全长faldh基因的一对引物FDHNcoI和FDHXhoI， 并在5’ -端引物加AfcoI酶切位点，3’ -端引物加损01酶切位点，序列如下
FDHNcoI :5’ -CCATGGGAGCTGTTACGTACCA-3’ FDHXhoI :5’ -CTCGAGTTATGGCTTTAAAATGACCTT-3’
以短芽孢杆菌基因组DNA为模板，用引物FDHNcoI/FDHXhoI PCR扩增得到faldh基因的全长片段(1.21Λ)，回收并纯化/WA全长基因片段，并将其连接到pMD-18T载体后得到重组质粒pMD18T-/aA/A ；根据重组质粒pMD18T-/aA/A中基因序列约750bp处和pMD18_T 载体多克隆位点都有feci酶切位点，选择限制性内切酶feci对质粒进行单酶切，酶切结果会产生两条片段。如果是正向连接，酶切片段大小分别约为0. 751Λ和3. 15kb ；如果反向连接，酶切片段大小分别约为0. 45kb和3. 451Λ。结果如图5A，其酶切片段大小和预期结果一致，说明PMD18T-/WA构建成功。用限制性内切酶AfcoI和炀ol双酶切pMD18T-/WA质粒和原核表达载体pET3h， 通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片段，从凝胶中回收目的片段/WA (1.2 1Λ)和pET3h载体片段(图5B)。然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒将回收的目的基因/WA片段和载体片段pET3h进行连接，用连接反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态细胞(DH5 α，天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有氨苄霉素(Amp， 100 μ g/ml)的平板上，于37 0C过夜培养，筛选Amp抗性重组子菌落，从Amp抗性重组子菌落中提取质粒(图5C)，用损al和feci进行双酶切检测，因损<31在载体处有单一识别位点， 而feci在/WA目的片段上有一个识别位点，故双酶切质粒会产生5. 9 kb和1. 2 kb左右的两个片段，琼脂糖凝胶电泳和(图5D)预测结果一致。说明目的片段已经插入pET3h载体，原核表达载体构建成功；选取大小和理论值相符的重组质粒为模板进行 PCR检测，上下游引物分别使用fid!和/7^/8，扩增产物大小约为1. 21Λ，和理论预期相符(图 5Ε)。选出连接成功的质粒载体pET3h-/WA，转化大肠杆菌DH5ci，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒pET3h-/WA。实施例3 重组FALDH蛋白的表达与表达条件的优化
用原核表达载体转化大肠杆菌BL21的感受态细胞(DH5a，天根生化科技)。挑取单菌落加入2mL LB (含有Amp 100mg/L)中，37°C过夜培养(0D_值约为1. 5)。 加1. OmM的IPTG于30°C诱导0_8小时后，离心收集菌体，去掉上清液，加入0. Iml SDS-PAGE 上样缓冲液(Sample loading buffer),于95°C加热10分钟煮沸菌体。冰浴冷却后于4°C离心(12000rpm)10分钟，取上清作SDS-PAGE。根据文献资料和软件分析预测目的蛋白大小为 58kDa左右，采用1 分离胶。SDS-PAGE电泳参看《分子克隆实验指南(第三版)》。SDS-PAGE 电泳结果(图6)表明在ImM IPTG、30°C诱导《ι时，目的蛋白FALDH在总蛋白中所占比例最高，确定为该蛋白的最优表达条件。实施例4 重组FALDH蛋白的纯化
用原核表达载体转化大肠杆菌BL21的感受态细胞，挑取单菌落入500mL LB (含有Amp 100mg/L)中，25°C培养至0D600值约为0. 6时，加1.0 mM IPTG诱导后6小时，离心收集菌体，用wash buffer (10 mM Tris-Cl，pH7. 5)洗2次，加入30ml蛋白抽提缓冲液(磷酸钠缓冲液(PH7. 4)20 mmol/L)，悬浮菌体。于冰浴上超声波破碎细菌细胞(工作 3秒，间歇9秒，功率30W,全程30分钟)。于4°C离心(6000g) 30分钟，得到上清和沉淀，沉淀用8M尿素(IOml)溶解。取适量上清和沉淀蛋白样品加入适量上样缓冲液作SDS-PAGE， 结果说明所表达的FALDH重组蛋白80%出现在包涵体蛋白部分(图6B)。沉淀用8M尿素 (IOml)溶解，加入适量上样缓冲液，用12%的分离胶跑SDS-PAGE，然后用0. 25M KCl于4 °C染色30分钟，割出FALDH蛋白条带，放入透析袋，加入aiil SDS-PAGE buffer，进行水平电泳4-5小时或过夜，将FALDH蛋白从凝胶中洗脱出来，可获得纯度达85%以上的FALDH蛋白样品(图6B)。最后在IXPBS溶液中透析过夜后可用于FALDH抗体的制备。本发明的实验结果表明用ImM IPTG于37°C诱导6小时后可获使FALDH重组蛋白达到很高的表达量，所表达的重组蛋白有80%会形成包涵体，包涵体蛋白含量很高，用高浓度的尿素溶解后进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)极易纯化FALDH重组蛋白，然后割下含有FALDH重组蛋白的凝胶，通过透析从凝胶中回收获得纯度很高的FALDH重组蛋白，可用于FALDH特异性抗体的制备，为FALDH特异性抗体的制备提供了一条新途径。FALDH重组蛋白表达量很高，因此不需要大规模培养细菌，纯化FALDH蛋白的操作相当简单，成本也很低，极易重复使用。
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权利要求
1.短芽孢杆菌甲醛脱氢酶基因/WA的原核表达载体，其特征在于该载体含有T7启动子和终止子、细菌核糖体结合位点、T7启动子的下游有可被IPTG诱导的操作子序列和 faldh基因，紧靠/WA基因的起始密码子上游有一个由6个氨基酸组成的组氨酸标签序列。
2.根据权利要求1所述的原核表达载体，其特征在于载体中的/WA基因来源于短芽孢杆菌，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
3.权利要求1所述的原核表达载体在制备FALDH包涵体蛋白中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种高效表达短芽孢杆菌甲醛脱氢酶蛋白的原核表达载体pET32a-faldh，该载体是含有短芽孢杆菌(BreviBacillusbrevis)甲醛脱氢酶基因(faldh)的原核表达载体，本发明从短芽孢杆菌中扩增出faldh基因，亚克隆与原核表达载体pET32a中获得其原核表达载体pET32a-faldh，用T7启动子控制它在大肠杆菌中的表达，表达的重组蛋白质80%以上形成包涵体，从包涵体中很容易纯化高纯度的重组蛋白质。
文档编号C12N15/53GK102344932SQ20111030649
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者孟庆超, 年洪娟, 程琴, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学