专利名称：一种荧光原位双杂交方法
技术领域：
本发明涉及荧光原位杂交，特别涉及一种荧光原位双杂交方法，属于生物医学领域。
背景技术：
荧光原位杂交(fluorescencein situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。FISH的基本原理是将DNA (或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记，然后将探针直接杂交到染色体或DNA (或RNA)上，并用荧光素分子标记的单克隆抗体与探针分子特异性结合，来检测DNA序列在染色体或DNA (或RNA)上的定性、定位。国内外的荧光原位杂交应用主要在于临床方面，用来检验基因染色体位点变异，如慢性粒细胞白血病bcr/abl易位DNA探针和实体肿瘤检测的HER-2/neu基因探针。然而对组织中目的基因mRNA水平的定位及表达差异变化的研究方面应用甚少，目前缺乏一套稳定的体系来进行检测。在以往的FISH研究中，由于探针自身信号的强弱不同，杂交信号的显示存在不足。尽管采用的荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜对杂交结果进行观察，仍然不能很好地克服杂交信号显示不清楚的问题。在双标荧光原位杂交的方法的应用中，仍局限于临床染色体异常检测方面，如检测人精子染色体数目异常、检测星形细胞瘤染色体17pl3. 1 的丢失等。
发明内容
本发明的目的是提供一种荧光原位双杂交方法，对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片后，该方法通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。本发明的技术方案是设计一种荧光原位双杂交方法，其特征是它包括以下具体步骤是一种荧光原位双杂交方法，其特征是它包括以下具体步骤是
1)用含有H2A终浓度为m的摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室温， 10-15分钟；所述的H2A终浓度为m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氢二钠29. 0 克，磷酸二氢钠2. 9克，用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；
2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温，10-20 分钟；
3)用含有TritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；
4)50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；
5)摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 -15分钟；
6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1-2小时；
7)在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和 FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火
温度来确定；
8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60°C，各20-30分钟；
9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，370C，20-30分钟；
10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，37°C，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；
11)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7. 5，摩尔浓度为0. 15 mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；
14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS:是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成；
15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14) 中处理过的切片，室温，过夜；
16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；所述的 TNT:是由TS7. 5和体积百分比为0. 05% Tween20配制而成；
17)用摩尔浓度为0.1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10-15分
钟；
18)TSA-Biotin反应，放大杂交信号
①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；
②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；
19)用0.1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；
20)在NaN3的终浓度为21的0.1 mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温， 10-15分钟；
21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；
23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
24)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；
25)用TNT洗涤步骤中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；
27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。所述的步骤4)中的50. 0 ml乙酰化液是由加入1 mol/L，pH值为8. 0的三乙醇胺 5.0 ml ；再加入最终体积百分比为0. 25%的纯冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述试剂的配制，能按比例扩大。所述的步骤7)中的杂交液是由以下5种试剂混合配成加入体积百分比为25% 的20 χ SSC ；再加入体积百分比为20%的浓度为10%的Blocking Reagent试剂；再加入体积百分比为50%的浓度为100%的去离子甲酰胺；再加入体积百分比为5%的浓度为1的 yV-Lauroylsarcosine溶液；再加入体积百分比为0. 1%的浓度为10%的SDS溶液；所述的20 X SSC为一种缓冲液；所述的SDS为十二烷基硫酸钠。所述的步骤8)中的洗涤液由以下3种试剂组成分别是终浓度为2 χ SSC，终体积百分比为50%的100%离子甲酰胺和终浓度为0. 1%的Kauroylsarcosine溶液；在配制洗涤液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。所述的步骤9)中的RNA缓冲液由以下3种试剂组成分别是终浓度为10 m mol/ L，pH值为8. 0的Tris-HCl ；终浓度为Im mol/L的EDTA ；终浓度为0. 5摩尔浓度的NaCl组成；在配制RNA缓冲液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。所述的步骤18)中的反应液是由以下试剂混合配成在5 ml的0. 1 mol/L PB溶液中加入牛血清粉末0. 005g，再按1 1000的终浓度加入TSA-Biotin试剂5 μ 1，再按3ug/ml 的终浓度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述试剂的配制，能按比例扩大；其中，所述的TSA-Biotin是一种络氨酸和生物素结合的放大系统，其制备方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride 于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO中；然后将上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室温避光孵育过夜；再加入1 / 10体积的一乙醇胺至上述混合液中，室温放置4-5小时；将以上液体放于-20°C 保存备用；所述的DMSO为二甲基亚砜。本发明的有益效果是本发明对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片，通过生物素标记的探针与组织中的HiRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、 表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。 本发明使用了 TSA-Biotin的放大系统，在结合荧光素标记的抗体之前先将杂交信号进行级联放大，克服了由于探针自身信号强弱不同导致的杂交信号检测不理想的问题。本发明首次引入对两种目标基因的探针的不同荧光标记、相应的杂交及检测方法，为在同一样本上检测两个不同基因的mRNA定位及表达差异提供了可能，极大地提升了荧光原位杂交的在活体组织检测的应用范围。
下面结合实施例和实施例附图对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。图1是本发明实施例1的杂交效果对比图，其中，A为A探针的杂交信号，B为B 探针的杂交信号，荧光原位杂交双标可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异；
图2是本发明实施例2的杂交效果对比图，其中，A荧光原位杂交技术单标，B荧光原位杂交技术双标；A为C探针的杂交信号，B为B探针的杂交信号；荧光原位杂交双标可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异。
具体实施例方式
一种荧光原位双杂交方法，它包括以下具体步骤是
I)用含有H2A终浓度为m的摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室温， 10-15分钟；所述的H2A终浓度为m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氢二钠29. 0 克，磷酸二氢钠2. 9克，用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；
2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温， 10-20分钟；
3)用含有TritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；
4)50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；
5)摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 -15 分钟；
6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1-2小时；
7)在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和 FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火
温度来确定；
8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60°C，各20-30分钟；
9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，370C，20-30分钟；
10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，37°C，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；
II)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩尔浓度为0.15 mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；
14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS:是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成；
15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14) 中处理过的切片，室温，过夜；
16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；所述的 TNT:是由TS7. 5和体积百分比为0. 05% Tween20配制而成;
17)用摩尔浓度为0.1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10-15 分钟；
18)TSA-Biotin反应，放大杂交信号①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；
②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；
19)用0.1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；
20)在NaN3的终浓度为21的0.1 mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温， 10-15分钟；
21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；
23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
24)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；
25)用TNT洗涤步骤中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；
27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。实施例1
1)用含有H2O2终浓度为H的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育模型后的数张大鼠切片1次，室温，10分钟；所述的H2A终浓度为m，所述的0. lmol/L DEPC-PB 是用磷酸氢二钠(Nei2HPO4. 12H20)四· 0克，磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2Η20) 2. 9克，用超纯水定容至IL 后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片也可以是其它的生物组织切片；
2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温，10
分钟；
3)用含有iTritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；
4) 50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10分钟；所述的50. 0 ml乙酰化液是由加入1摩尔浓度的pH值为8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入体积百分比为 0. 25%的纯冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述试剂的配制，能按比例扩大。所述DEPC-Water是用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml 过夜放置后，高压灭菌制成的溶液。5)摩尔浓度为0. 1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 分钟；
6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1小时；此过程在杂交炉中进行；
7)在杂交液中加入DIG标记的探针A，同时再加入FITC标记的探针B，DIG标记的探针和FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，所述A和B探针所需的杂交温度为58°C ；所述的A、B探针购自第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室；所述的杂交液是由以下5种试剂混合配成加入体积百分比为25%的20 χ SSC;再加入体积百分比为20%的浓度为10%的Blocking Reagent试剂；再加入体积百分比为50%的浓度为 100%的去离子甲酰胺；再加入体积百分比为5%的浓度为的N-Lauroylsarcosine溶液； 再加入体积百分比为0. 1%的浓度为10%的SDS溶液。如配制IOml的杂交液需要加入20 χ SSC溶液2. 5 ml，加入10%的Blocking Reagent溶液2 ml，加入100%的去离子甲酰胺 5 ml，加入2%的N-Lauroylsarcosine溶液0. 5 ml最后再加入10%的SDS溶液10 ul共同混合配成杂交液，上述试剂的配制，能按比例扩大。所述溶液20 X SSC为一种缓冲液，购自 invitrogen公司；所述SDS为十二烷基硫酸钠。8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60 °C，各20分钟；所述的洗涤液由以下3种试剂组成分别是终浓度为2X SSC，终体积百分比为50%的100% 离子甲酰胺和终浓度为0. 1%的l-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗涤液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。如配制50 ml的洗涤液；需要加入20x SSC溶液5ml，加入 100%去离子甲酰胺25 ml，加入2%的N-Lauroylsarcosine溶液2. 5 ml最后加入12. 5 ml 的超纯水定容至50ml。9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，37°C，20分钟；所述的RNA缓冲液由以下3种试剂组成分别是终浓度为10 m mol/L的pH值为8. 0的Tris-HCl ；终浓度为Im mol/L的EDTA ；终浓度为0. 5 mol/L的NaCl组成；在配制RNA缓冲液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。如配置50 ml的RNA缓冲液需要加入1 mol/L，pH值为 8. 0 的 iTris-HCl 溶液 0. 5 ml，加入 0.5 mol/L 的 EDTA 溶液 0. 1 ml，加入 1 mol/L 的 NaCl溶液25 ml最后加入24. 4 ml的超纯水定容至50 ml。10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，条件37°C，30分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；
11)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩尔浓度为0. 15 mol /L NaCl溶液组成；如配制100 ml的TS7. 5 需要加入1 mol /L，PH值为7. 5的Tris-HCl溶液10 ml，加入1 mol/L的NaCl溶液15 ml最后加入75 ml的超纯水定容至100ml。14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1_2小时；所述的TBS: 是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent组成；如配制10 ml的TBS 需要加入已配好的 TS7.5 溶液 9 ml 和 10%Blocking Reagent 溶液 1ml。15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤 14)中处理过的切片，室温，过夜；
16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；所述的TNT: 是由TS7. 5和体积百分比为0. 05% Tween20用超纯水配制而成；如配制100 ml的TNT 需要加入100%的Tween20试剂50 μ 1再加入已配好的TS7. 5 99. 95 ml定容至100 ml。17)用摩尔浓度为0. 1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10 分钟；
18) TSA-Biotin反应，放大杂交信号①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10分钟；
②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟； 所述的反应液是由以下试剂混合配成在5 ml的0.1 mol/L PB溶液中加入牛血
清粉末0. 005g,再按1 :1000的终浓度加入TSA-Biotin试剂5 μ 1，再按;3ug/ml的终浓度加入1. Omg/ml的葡萄糖氧化酶15 μ 1 ；上述试剂的配制，能按比例扩大；其中，所述的TSA-Biotin是一种络氨酸和生物素结合的放大系统，其制备方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride ψ 300 ul 白勺 DMSO ψ 角军 3. 5mg Biotin-NHS ψ 36. 5 ul 白勺 DMSO中；然后将上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室温避光孵育过夜；再加入1 / 10体积的一乙醇胺至上述混合液中，室温放置4-5小时；将以上液体放于-20°C 保存备用；所述的DMSO为二甲基亚砜。19)用摩尔浓度为0. 1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10分钟；
20)在NaN3的终浓度为m的0. 1 mol/L PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温，10 分钟。21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；
23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
M)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；
25)用TNT洗涤步骤24)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片4小时；
27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。 上述实施例
抗体 Anti-Digoxigenin-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，货号11207733910 ； 抗体 Anti-Fluorescein-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，货号11426346910 ； 抗体Alexa488-DNP是invitrogen公司，地址美国，货号:A11094 ； 抗体 Mi^ptavidin - Cy3 是 invitrogen 公司，地址美国，货号434315 ； TSA-DNP 是 Ambion 公司，地址美国，货号NEL746A001KT ； 20 χ SSC为一种缓冲液，是invitrogen公司，地址美国，货号15557-044 ； Blocking Reagent 是 Roche 公司，地址瑞士，货号1096176 ； yV-Lauroylsarcosine 是 sigma-aldrich 公司，地址美国，货号61739 ； Tyramine hydrochloride 是 sigma-aldrich 公司，地址美国，货号T2879 ； Biotin-NHS 是 CALBL0CHEM 公司，地址德国，货号203112。结果如图1的杂交效果对比图所示，A为A探针的杂交信号，B为B探针的杂交信号，荧光原位杂交双标可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异； 从图中可以看出，本发明方法的优点是可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异。实施例2
1)用含有H2O2终浓度为洲的摩尔浓度为0.1mol/L的DEPC-PB孵育模型后的数张大鼠切片1次，室温，10分钟；所述的H2A终浓度为1，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H20)29. 0克，磷酸二氢钠(NaH2PO4. 2H20)2. 9克，用超纯水定容至 IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液； 所述的切片也可以是其它的生物组织切片；
2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温，10
分钟；
3)用含有TritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；
4)50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10分钟；所述的50. 0 ml乙酰化液是由加入1摩尔浓度的pH值为8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入体积百分比为 0. 25%的冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述试剂的配制，能按比例扩大。所述DEPC-Water是用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml 过夜放置后，高压灭菌制成的溶液。5)摩尔浓度为0. 1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 分钟；
6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1小时；此过程在杂交炉中进行；
7)在杂交液中加入DIG标记的探针C，同时再加入FITC标记的探针B，DIG标记的探针和FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，所述C和B探针所需的杂交温度为60V;所述的C、B探针购自第四军医大学人体解剖与组织胚胎学教研室；所述的杂交液是由以下5种试剂混合配成加入体积百分比为25%的20 χ SSC;再加入体积百分比为20%的浓度为10%的Blocking Reagent试剂；再加入体积百分比为50%的浓度为100% 的去离子甲酰胺；再加入体积百分比为5%的浓度为1的N-Lauroylsarcosine溶液；再加入体积百分比为0. 1%的浓度为10%的SDS溶液；20 X SSC为一种缓冲液，购自invitrogen 公司；所述SDS为十二烷基硫酸钠。8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60 °C，各20分钟；所述的洗涤液由以下3种试剂组成分别是终浓度为2 χ SSC，终浓度为50%去离子甲酰胺和终浓度为0. 1% N-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗涤液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。配置方法如实施例1。9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，37°C，20分钟；所述的RNA缓冲液由以下3种试剂组成分别是终浓度为10 m mol/L，pH值为8. 0的Tris-HCl ；终浓度为Im mol/L的EDTA ；终浓度为0. 5mol/L的NaCl组成；在配制RNA缓冲液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。配置方法如实施例1。10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，条件37°C，30分钟； 所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；11)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；
13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0. 1 mol /L Tris-HCl, PH 7. 5，摩尔浓度为0. 15 mol /L NaCl溶液组成； 用超纯水配制而成。配置方法如实施例1。14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1_2小时；所述的TBS: 是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent组成。配置方法如实施例1。15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤 14)中处理过的切片，室温，过夜；
16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；所述的TNT: 是由TS7. 5和体积百分比为0. 05%的Tween20用超纯水配制而成，配置方法如实施例1。17)用摩尔浓度为0. 1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10 分钟；
18) TSA-Biotin反应，放大杂交信号
①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10分钟；
②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟； 所述的反应液是由以下试剂混合配成在5 ml的0.1 mol/L PB溶液中加入牛血
清粉末0. 005g，再按1 :1000的终浓度加入TSA-Biotin试剂5 μ 1，再按;3ug/ml的终浓度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述试剂的配制，能按比例扩大；其中，所述的TSA-Biotin是一种络氨酸和生物素结合的放大系统，其制备方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride 于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO中；然后将上述36. 5 ul的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室温避光孵育过夜；再加入1 / 10体积的一乙醇胺至上述混合液中，室温放置4-5小时；将以上液体放于-20°C 保存备用；所述的DMSO为二甲基亚砜。19)用摩尔浓度为0. 1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10分钟；
20)在NaN3的终浓度为m的0. 1 mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温， 10分钟。21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；
23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；
M)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；
25)用TNT洗涤步骤24)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片4小时；
27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10分钟；
28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。
上述实施例中的
抗体 Anti-Digoxigenin-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，货号11207733910 ； 抗体 Anti-Fluorescein-POD 是 Roche 公司，地址瑞士，货号11426346910 ； 抗体Alexa488-DNP是invitrogen公司，地址美国，货号:A11094 ； 抗体 Mi^ptavidin - Cy3 是 invitrogen 公司，地址美国，货号434315 ； TSA-DNP 是 Ambion 公司，地址美国，货号NEL746A001KT ；
20 χ SSC为一种缓冲液，20x SSC是invitrogen公司，地址美国，货号15557-044 ； Blocking Reagent 是 Roche 公司，地址瑞士，货号1096176 ；
yV-Lauroylsarcosine 是 sigma-aldrich 公司，地址美国，货号61739 ； Tyramine hydrochloride 是 sigma-aldrich 公司，地址美国，货号T2879 ； Biotin-NHS 是 CALBL0CHEM 公司，地址德国，货号203112。结果如图2的杂交效果对比图所示，A荧光原位杂交技术单标，B荧光原位杂交技术双标；A为C探针的杂交信号，B为B探针的杂交信号；荧光原位杂交双标可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异。从图中可以看出，本发明方法优点是可以同时显示一个组织上的两个不同基因的mRNA定位及表达差异。
权利要求
1. 一种荧光原位双杂交方法，其特征是它包括以下具体步骤是1)用含有H2A终浓度为m的摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育切片1次，室温， 10-15分钟；所述的H2A终浓度为m，所述的0. lmol/L DEPC-PB是用磷酸氢二钠29. 0 克，磷酸二氢钠2. 9克，用超纯水定容至IL后，再加入体积百分比为0. 1%的DEPC Iml过夜放置后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述的切片为生物组织切片；2)用摩尔浓度为0.1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤1)中处理过的切片1次，室温，10-20 分钟；3)用含有TritonX-100终浓度为0. 3%的摩尔浓度为0. 1 mol/L的DEPC-PB孵育步骤2)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；所述的Triton X-100终浓度为0. 3% ；4)50 ml的乙酰化液孵育步骤3)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；5)摩尔浓度为0.1 mol/L DEPC-PB孵育步骤4)中处理过的切片2次，室温，各10 -15 分钟；6)在杂交液中孵育步骤5)中处理过的切片，此过程称为预杂交，温度为60°C，所需时间1-2小时；7)在杂交液中加入DIG标记的探针，同时再加入FITC标记的探针，DIG标记的探针和 FITC标记的探针的终浓度为lug/ml，杂交过夜16-20小时，杂交温度根据探针引物的退火温度来确定；8)从步骤7)所述的杂交液中取出切片用洗涤液清洗2次，60°C，各20-30分钟；9)用RNA缓冲液孵育步骤8)中处理过的切片1次，370C，20-30分钟；10)用加入RNA酶的RNA缓冲液孵育步骤9)中处理过的切片，37°C，30-40分钟；所述的RNA酶终浓度为20ug/ml ；11)用2X SSC孵育步骤10)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；12)用0.2x SSC孵育步骤11)中处理过的切片2次，37°C，各20-30分钟；13)用TS7.5孵育步骤12)中处理过的切片1次，室温，5-10分钟；所述的TS7. 5是由摩尔浓度为0.1 mol /L Tris-HCl, PH 7.5，摩尔浓度为0.15 mol /L NaCl溶液用超纯水配制而成；14)用TBS封闭将步骤13)中处理过的片子封闭，室温孵育1-2小时；所述的TBS:是由TS7. 5和体积百分比为1%的Blocking Reagent配制而成；15)按1:200的抗体效价，在TBS溶液中加入抗Anti-Digoxigenin-POD孵育步骤14) 中处理过的切片，室温，过夜；16)用TNT于室温洗涤步骤15)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；所述的 TNT:是由TS7. 5和体积百分比为0. 05% Tween20配制而成；17)用摩尔浓度为0.1 mol/L的PB洗涤步骤16)中处理过的切片1次，室温，10-15分钟；18)TSA-Biotin反应，放大杂交信号①将步骤17)中处理过的切片加入反应液中，室温，孵育10-15分钟；②在上述反应液中加入50ul的浓度为200mg/mlβ-D葡萄糖，于室温孵育30分钟；19)用0.1 mol /L的PB洗涤步骤18)中处理过的切片，室温，10-20分钟；20)在NaN3的终浓度为的0.1 mol/L的PB中孵育步骤19)处理过的切片，室温， 10-15分钟；21)用TNT洗涤步骤20)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；22)按1 2000的抗体效价，用TBS稀释Anti-Fluorescein-POD抗体，室温孵育步骤21) 中处理过的切片，过夜；23)用TNT洗涤步骤22)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；24)TSA-DNP反应根据试剂盒的说明书操作，按照1 :50比例将TSA-DNP稀释后孵育步骤23)中处理过的切片；25)用TNT洗涤步骤中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；26)用TNT 按照 2 种荧光抗体Alexa488-DNP 和 Sti^ptavidin - Cy3 的效价 1 :200 同时稀释这两种荧光抗体，室温孵育步骤25)中处理过的切片2-4小时；27)用TNT洗涤步骤沈)中处理过的切片2次，室温，各10-15分钟；28)将步骤27)中处理过的切片表片，封片。
2.根据权利要求1所述的一种荧光原位双杂交方法，其特征是所述的步骤4)中的 50. 0 ml乙酰化液是由加入1 mol/L，pH值为8. 0的三乙醇胺5. 0 ml ；再加入最终体积百分比为0. 25%的纯冰醋酸0. 125 ml用DEPC-Water定容到50. 0 ml即得，上述试剂的配制， 能按比例扩大。
3.根据权利要求1所述的一种荧光原位双杂交方法，其特征是所述的步骤7)中的杂交液是由以下5种试剂混合配成加入体积百分比为25%的20 χ SSC;再加入体积百分比为20%的浓度为10%的Blocking Reagent试剂；再加入体积百分比为50%的浓度为100% 的去离子甲酰胺；再加入体积百分比为5%的浓度为1的Kauroylsarcosine溶液；再加入体积百分比为0.1%的浓度为10%的SDS溶液；所述的20 X SSC为一种缓冲液；所述的 SDS为十二烷基硫酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种荧光原位双杂交方法，其特征是所述的步骤8)中的洗涤液由以下3种试剂组成分别是终浓度为2 χ SSC，终体积百分比为50%的100%离子甲酰胺和终浓度为0. 1%的#-Lauroylsarcosine溶液；在配制洗涤液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。
5.根据权利要求1所述的一种荧光原位双杂交方法，其特征是所述的步骤9)中的 RNA缓冲液由以下3种试剂组成分别是终浓度为10 m mol/L, pH值为8. 0的Tris-HCl ； 终浓度为Im mol/L的EDTA ；终浓度为0. 5摩尔浓度的NaCl组成；在配制RNA缓冲液的过程中使用超纯水将上述试剂稀释到终浓度。
6.根据权利要求1所述的一种荧光原位双杂交方法，其特征是所述的步骤18)中的反应液是由以下试剂混合配成在5 ml的0. 1 mol/L PB溶液中加入牛血清粉末0. 005g, 再按1 :1000的终浓度加入TSA-Biotin试剂5 μ 1，再按;3ug/ml的终浓度加入1. 0mg/ml的葡萄糖氧化酶15μ 1 ；上述试剂的配制，能按比例扩大；其中，所述的TSA-Biotin是一种络氨酸和生物素结合的放大系统，其制备方法是首先溶解15mg Tyramine hydrochloride于 300 ul 的 DMSO 中；再溶解 3. 5mg Biotin-NHS 于 36. 5 ul 的 DMSO 中；然后将上述 36. 5 ul 的Tyramine溶液加入Biotin-NHS中，室温避光孵育过夜；再加入1 / 10体积的一乙醇胺至上述混合液中，室温放置4-5小时；将以上液体放于-20°C保存备用；所述的DMSO为二甲基亚砜。
全文摘要
本发明公开一种荧光原位双杂交方法，它对建立模型后的活体动物进行灌注、取材、切片，通过生物素标记的探针与组织中的mRNA发生特异性的结合，对组织中目标基因mRNA的定位、表达差异变化进行荧光显示，从而方便、准确的观察到组织中目标基因mRNA水平的变化。
文档编号C12Q1/68GK102321766SQ201110306469
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年9月16日
发明者李云庆, 武胜昔, 王文, 陈晶, 魏燕燕, 黄静 申请人:中国人民解放军第四军医大学