专利名称：一种检测核酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体的说是涉及一种检测核酸的方法。
背景技术：
核酸是遗传信息的载体，是生命体的重要组成部分。医学研究表明，人类有超过 2000种疾病与脱氧核糖核酸(DNA)有关。如人类镰刀形红血细胞贫血症是由于患者的血红蛋白分子中一个氨基酸的遗传密码发生了改变，白化病则是患者DNA分子上缺乏产生促黑色素生成的酪氨酸酶的基因所致。肿瘤的发生、病毒的感染、射线对机体的作用等都与核酸有关。因此，对特定核酸序列的检测，在临床医学诊断和疾病预警等方面具有重要的意义。DNA碱基互补配对原则的发现为核酸序列的快速检测提供了可能。近年来，基于 DNA碱基互补配对原则开发的基因芯片技术，具有高通量，快速检测核酸序列的能力，在药物筛选、基因测序方面扮演着重要的角色。但是，对于特定疾病的诊断，仅需要对特征核酸序列进行检测，而不必对整个核酸分子进行检测，因此高通量的基因芯片在特定疾病的诊断方面并不适用。目前广泛使用的聚合酶链式反应(PCR)技术，虽然能够在分子水平上实现对特定核酸序列的测试，但是PCR过程耗时长，并且扩增产物需要经过凝胶电泳分离，极易造成扩增产物的污染，影响检测结果。随着生活水平的提高，人们对健康的关注日益提高，对疾病的早期诊断和预警提出了更高的要求，因此急需一种快速、准确、免PCR过程、灵敏度高、选择性强、低成本的核酸检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明目的是针对现有的核酸检测方法的缺陷，提供一种操作简单，灵敏度高、选择性强的检测核酸的方法。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案一种检测核酸的方法，提供带报告荧光基团的可以与靶核酸特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I) _4，4’ -联吡啶、铜(II) _4，4’ -联吡啶、氯钼酸-3，3’，5，5’ -四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸-4，4’ -联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6(1。本发明检测核酸的方法利用π-π相互作用，将与靶核酸分子特异性结合的探针分子吸附在富含η电子的纳米材料表面，淬灭探针分子的荧光，然后探针分子与待测样品混合，根据碱基互补配对原则，探针分子与靶核酸分子通过配对碱基对之间的氢键结合形成稳定的双链区，使探针分子从纳米材料表面脱离，荧光淬灭作用消失，通过检测荧光信号实现对待测样品的检测。而且根据荧光强度变化，还可确定待测样品中靶核酸分子的含量。本发明所述检测核酸的方法成本低廉，所述富含η电子的纳米材料制备方法简单，原材料价格低廉，且能大规模制备；操作简单，检测过程中只需要将富含η电子的纳米材料、探针分子和待测样品混合，使用简单的荧光检测仪器检测荧光，不需要使用价格昂贵的大型分析仪器；检测性能优异，检测时间短、灵敏度高，可以广泛应用于常规血清样本检测，并且对待测样品靶核苷酸具有单碱基错配区分能力，可在多靶混合体系中进行核酸检测，是一种简便、快速、成本低、应用范围广的检测核酸的方法。
图1示核酸检测方法的原理示意图，其中，球形只代表富含π电子的纳米材料，并不表明材料本身为球形；图2示聚间苯二胺纳米棒检测DNA的荧光淬灭及恢复结果图。a为探针DNA (50ηΜ) 的荧光发射谱；b为探针DNA (50nM) +靶DNA (300nM)的荧光发射谱；c为探针DNA (50nM) +聚间苯二胺纳米棒的荧光发射谱；d为探针DNA(50nM) +聚间苯二胺纳米棒+靶DNA(300nM) 的荧光发射谱；e为聚间苯二胺纳米棒自身的荧光发射谱；插图表示不同靶DNA浓度(5 300nM)时荧光强度恢复的情况；图3是聚间苯二胺纳米棒在DNA检测过程中对碱基错配区分的结果图。图a为室温时完全互补的靶DNA(T1)、一个碱基错配的DNA(T2)、两个碱基错配的DNA(T3)、三个碱基错配的DNA(T4)和完全不互补的DNA(T5)所引起的荧光恢复情况；图b是25°C和50°C时完全互补的靶DNA(T1)和一个碱基错配的DNA(T2)所引起的荧光恢复情况；图4是聚间苯二胺纳米棒在人血清样本中检测DNA的结果图。图中给出了不同的血清加入量时，单碱基错配的DNA(T2)和完全互补的DNA(T1)所引起的荧光恢复的比值；图5是聚间苯二胺纳米棒对多靶DNA混合体系的检测结果图当向三种探针DNA 混合物中分别加入一种靶DNA(T1)、两种靶DNACT1和T6)以及三种靶DNA (1\、T6和T7)时的荧光强度的柱状图。
具体实施例方式本发明实施例公开了一种检测核酸的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容， 适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案提供带报告荧光基团的可以与靶核酸特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I) _4，4’-联吡啶、铜(II) 4，4’-联吡啶、氯钼酸-3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸-4，4’-联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6(1。
本发明所述检测核酸的方法将与靶核酸分子特异性结合的探针分子与富含π电子的纳米材料混合，由于η-η相互作用，探针分子吸附在材料表面，之后探针分子上报告荧光基团同富含η电子的纳米材料间发生能量转移可将荧光基团发射的荧光淬灭。加入待测样品后，待测样品中的靶核酸分子与探针分子利用碱基互补配对原则，通过配对碱基对之间的氢键结合形成稳定的双链区，使探针分子从纳米材料表面脱离，荧光淬灭作用消失，探针分子恢复荧光。通过检测荧光信号实现对待测样品DNA的检测。而且根据荧光强度变化，还可确定待测样品DNA中靶核酸分子的含量。本发明所述探针分子带有报告荧光基团，可以在探针分子3’端或5’端标记报告荧光基团，也可以在3’端和5’端同时标记报告荧光基团，以提高荧光强度，提高检测的灵敏度。探针标记的报告荧光基团包括但不限于以下荧光物质FAM、TET、J0E、VIC、HEX、R0X、 TAMRA, CY3、CY3. 5、CY5、CY5. 5、Oregon Green、CAL Red、Red640 和 iTexas Red。本发明所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4_乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物。其中，所述共轭聚合物的制备方法为将单体和氧化剂的溶液按照摩尔比1 0.1 20混合，放置Imin Mh，制得。所述单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯，所述氧化剂优选为过硫酸铵或三氯化铁。本发明所述配位聚合物为银(1)-4，4’_联吡啶、铜(11)-4，4’_联吡啶、氯钼酸-3， 3’，5，5’-四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸_4，4’-联吡啶配位聚合物，由含η电子的4，4’_联吡啶和四甲基联苯二胺分子作为单体，过渡金属离子银、铜、钼或金作为引发剂，聚合而成。所述配位聚合物的制备方法为将过渡金属离子和含η电子的有机分子的溶液按照摩尔比1 0. 1 20混合，放置Imin Mh，制得。有机分子簇集体是在水或水与有机溶剂的混合体系中，有机分子在疏水亲脂作用驱动下，相互靠近形成的简单分子集合体。本发明所述卟啉簇集体是由含η电子的卟啉分子在水与有机溶剂的混合溶液中相互靠近簇集而成。其中，所述卟啉簇集体的制备方法为含η电子的卟啉分子溶解在有机溶剂中获得浓度为lmmol/L 0. 5mol/L的溶液，然后按照体积比为0. 001 1 1与水混合，放置Imin Mh，制得。其中，所述有机溶剂优选为甲醇、乙醇、丙醇、乙二醇、二甲基亚砜、四氢呋喃或N-甲基吡咯烷酮。本发明所述介孔碳和纳米C6tl均属于碳材料，其中，所述介孔碳的制备方法为通过浸渍法将碳源前驱物引人介孔氧化硅的孔道中，在酸催化下使前驱物热分解并沉积在模板介孔材料的孔道内，煅烧碳化制得碳硅复合物，然后移除硅模板，制得介孔碳。其中，所述碳源前驱物优选为葡萄糖、蔗糖乙炔、中间相浙青、呋喃甲醇、苯酚/甲醛树脂。本发明所述纳米C6tl的制备方法为将C6tl粉末溶解在丙酮中，然后与乙腈混合，收集土黄色沉淀，然后均勻分散在水中制得。在具体实施方案中，本发明在检测靶核苷序列同时加入与探针序列有1个、2个、3 个碱基错配的DNA或完全不互补的DNA，结果显示本发明所述检测方法对待测样品靶核苷酸具有单碱基错配区分能力，可在多靶混合体系中进行核酸检测。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中，本发明在实施例中以人类免疫缺陷病毒(HIV)相关核酸序列(T1)作为靶 DNA, (Phiv)作为荧光检测的探针序列。本发明在实施例中加入的与探针序列有1个、2个、3 个碱基错配的DNA和完全不互补的DNA序列，详见表1。
表1相关核苷酸序列
权利要求
1. 一种检测核酸的方法，其特征在于， 提供带报告荧光基团的可以与靶核酸特异性结合的探针分子； 将所述探针分子与富含η电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光； 其中，所述富含η电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I) _4，4’ -联吡啶、铜(11)_4，4’ -联吡啶、氯钼酸_3，3’，5，5’ -四甲基联苯二胺、氯钼酸-对苯二胺或四氯合金酸-4，4’-联吡啶配位聚合物、吓啉簇集体、介孔碳和纳米C6tl。
全文摘要
本发明涉及生物技术领域，公开了一种检测核酸的方法，为提供带报告荧光基团的可以与靶核酸特异性结合的探针分子；将所述探针分子与富含π电子的纳米材料溶液混合，然后加入待测样品，检测荧光；其中，所述富含π电子的纳米材料选自单体为苯二胺、3，4-乙烯二氧噻吩或苯乙烯的共轭聚合物，银(I)-4，4’-联吡啶、铜(II)-4，4’-联吡啶、氯铂酸-3，3’，5，5’-四甲基联苯二胺、氯铂酸-对苯二胺或四氯合金酸-4，4’-联吡啶配位聚合物、卟啉簇集体、介孔碳和纳米C60。本发明所述检测方法成本低廉，操作简单，检测时间短、灵敏度高，对靶核苷酸具有单碱基错配区分能力，可对多种靶核酸混合体系进行检测。
文档编号C12Q1/68GK102337339SQ20111030663
公开日2012年2月1日 申请日期2011年10月11日 优先权日2011年10月11日
发明者孙旭平, 张瑛洧, 王磊 申请人:中国科学院长春应用化学研究所