专利名称：柴胡皂苷α处理神经干细胞为神经元样细胞及其试剂盒的研制、用于神经系统疾病的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种柴胡皂苷α处理人神经干细胞得到神经元样细胞(neuron-like cells, NLC)及其增殖的分化培养基，及其试剂盒研制的方法，以及包括前述方法获得的神经元样细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。更具体地，本发明涉及一种柴胡皂苷 α分化人神经干细胞得到神经元样细胞的分化培养基，使用该培养基选择性的获得神经元样细胞的方法，以及包括前述方法获得的神经元样细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。
背景技术：
干细胞具有的自我复制和多分化潜能的特性，使之成为非常理想的细胞资源。但单纯神经干细胞移植存在很多问题困扰临床治疗，多种错综复杂的因素影响干细胞移植效果，其中干细胞在体内存活率低下，真正到达病灶位的干细胞分化成终端功能的细胞很少， 难以形成有效的治疗效果。在干细胞移植前先将干细胞进行诱导成功能性的成神经样细胞，后移植到体内进行治疗，可能达到比单独干细胞移植更好的疗效。神经系统有大量神经元。神经元是脑的主要成分，神经元群通过各个神经元的信息交换，实现脑的分析功能，进而实现样本的交换产出；产出的样本通过联结路径点亮丘觉产生意识。神经元细胞的病变、变性或损伤等必能引起各种神经系统疾病，如脑卒中、脑性瘫痪、脑损伤、脑出血、骨髓侧索硬化症和帕金森病等。例如，CN 1923195Α公开的由香豆素类化合物诱导神经干细胞定向分化，可分化为少突胶质前体细胞，其表明可作为诱导神经干细胞定向分化的药物，但并未公开其可以定向分化为神经元样细胞。已有文献报道了中药可以诱导间充质干细胞可以分化为神经元样细胞，例如三七总皂苷、丹参酮、硫代甘油和丹参注射液等。这些报告都表明中药可以诱导间充质干细胞转分化为神经元样细胞，而分化效率和增殖传代能力并没有确定。综上，亟需一种操作简单、成本低、分化纯度高、增殖效率高且传代细胞性质稳定的安全的获得神经元样细胞的方法。
发明内容
本发明的目的通过中药高效地分化神经干细胞成神经元样细胞，并增殖不分化， 克服现有的获得和增殖神经元样细胞的方法操作繁复、成本高，分化得到的神经元样细胞纯度低、增殖效率低、容易分化变性，并且在分化和增殖过程使用的培养基中含有很多对人体有害的药物，使分化和增殖得到的神经元样细胞在制备成药物组合物时安全性差的缺点，提供一种神经元样细胞的分化培养基，使用该培养基的分化和增殖得到的神经元样细胞的方法操作简单、成本低、分化纯度高、增殖效率高且传代细胞性质稳定。本发明提供了一种神经干细胞分化为神经元样细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有l_500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20体积％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生长因子和5-200ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。本发明还提供了一种柴胡皂苷α分化神经干细胞成神经元样细胞及其增殖的方法，其中，所述方法使用本发明所述的分化培养基培养所述神经干细胞。本发明还提供了一种柴胡皂苷α分化神经干细胞成神经元样细胞及其增殖的试剂盒研制的方法，其中，所述的试剂盒包括1)基础培养基；2)柴胡皂苷α ；3)细胞因子(人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；4)消化细胞的酶以及；5)使用说明书；本发明还提供了一种用于治疗神经系统疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从神经干细胞分化成神经元样细胞及其增殖的方法获得的神经元样细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。使用本发明的选择培养基的本发明的从神经干细胞分化成神经元样细胞及其增殖的方法，能够高效分化和大量增殖神经元样细胞，并经传代增殖的神经元样细胞仍然保持与原有的性状。由于本发明的选择培养基选择性强，传代培养得到的神经元样细胞纯度可达到85%以上。因此，本发明的方法无需使用磁珠等高成本安全性差的药物就能达到更高纯度的分离效果，避免了繁复的操作，因而降低了成本，并且由该方法得到的神经元样细胞的安全性大大提高，可以制备成本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物。本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物不仅安全性好，而且能在体内修复神经系统疾病中损伤的神经元细胞，从而为治疗神经系统疾病提供了可能。
图1为实施例1和3获得的神经元样细胞表达蛋白的荧光免疫照片，其中，图IA 为鼠抗人微管联合蛋白_2IgG标记后二抗显色荧光免疫照片，图IB为鼠抗人巢蛋白IgG标记后二抗显色荧光免疫照片；图2为实施例1和3获得的神经元样细胞表达基因的PCR产物凝胶电泳检测图片；图3为使用实施例2和3获得的神经元样细胞移植治疗缺血性脑卒中大鼠模型， 移植后随着时间变化进行改良神经功能缺失评分改善曲线；图4为使用实施例2和3获得的神经元样细胞移植治疗缺血性脑卒中大鼠模型， 移植后随着时间变化进行脑损伤面积改善曲线；图5为使用实施例2和3获得的神经元样细胞移植治疗缺血性脑卒中大鼠模型， 移植后患侧纹状体内切片BrdU阳性染色NLC照片(免疫荧光显微镜放大倍数40倍)。
具体实施例方式本发明提供了一种神经干细胞分化为神经元样细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有l_500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20体积％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生长因子(印idermal growth factor, EGF)和5_200ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)。优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有5_300ug/ mL的柴胡皂苷α、5-15体积％的胎牛血清、lO-lOOng/mL的人表皮生长因子和lO-lOOng/mL 的碱性成纤维细胞生长因子。进一步优选地，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有50-200ug/mL的柴胡皂苷α ,5-10体积％的胎牛血清、20-50ng/mL的人表皮生长因子和20-50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。本发明的神经干细胞分化为神经元样细胞及其增殖的分化培养基可以包括本领域常用的各种基本培养基，例如，选自神经元细胞培养基、BME细胞培养基、杜尔贝可改良伊格尔(Dulbecco，s modified Eagle，s medium,DMEM)细胞培养基、DMEM/F12 细胞培养基、 Fischer' s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、FlO细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。优选包括的所述基本培养基为重量比1 1的F12细胞培养基和DMEM细胞培养基。所述基本培养基的成分为本领域公知，上述列举的基本培养基名称为它们的商品名，商业上可供。本发明还提供了一种从胡皂苷α分化神经干细胞为神经元样细胞及其增殖的方法，其中，所述方法使用本发明所述的分化培养基培养所述神经干细胞。本发明提供的从皂苷α分化神经干细胞为神经元样细胞及其增殖的方法可以适用于各种的神经干细胞。神经干细胞属于具有一定分化程度的成体多能干细胞。理论上讲，任何来源的神经干细胞都可以应用本发明的方法分化和增殖得到神经元样细胞，例如骨髓、脐带血、胎盘、脐带、流产胚胎(例如流产的12-14周的胚胎)和流产胎儿等来源的。 但考虑到可能有悖于伦理道德、社会风俗习惯甚至法律规定，因此一般不利用流产胚胎和流产胎儿，并且胚胎和流产胎儿的来源有限。优选所述离体组织选自骨髓、胎盘、脐带血和脐带中的一种或几种。其中，骨髓和脐带血可以来自公共脐带血库(例如，中国脐带血库等)和骨髓库(例如，中华骨髓库等)。从来源丰富程度考虑，优选所述离体组织是脐带，其一般作为医疗废弃物被处理掉。本发明所述神经元样细胞分化培养体系包括5X IO5至5Χ IO6个/ml、优选1 X IO6 个/ml神经元样细胞和lmL-100mL、优选5_10mL的神经元样细胞分化培养基，在37°C、5% CO2培养箱中培养，由神经干细胞分化得到神经元样细胞。使用本发明的分化培养基的本发明的方法，经传代增殖的神经元样细胞仍然保持与相同的性状。例如，无论是神经干细胞分化得到的神经元样细胞还是传代多次得到的神经元样细胞它们的神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(MAP-2)表达阳性，而胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)为阴性。 按照这个检测神经元样细胞是否分化变性的标准判断，本发明的方法得到的神经元样细胞可以保证在多次传代次数不发生分化变性。所述多次传代得到的神经元样细胞，可以用作制备本发明药物组合物的原料。此外，为了便于运输和保存，所述神经元样细胞也可以进行冷冻保存，在临近使用前复苏即可。本发明还提供了一种用于治疗神经系统疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括本发明所述从从胡皂苷α分化神经干细胞为神经元样细胞及其增殖的的方法获得的神经元样细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。所述药学上可接受的载体或赋形剂指无毒固态、半固态或液态填充剂、稀释剂、包囊材料或其他制剂辅料，例如，包括但不限于盐水、缓冲盐液、水、甘油、乙醇及其混合物。所述药物组合物适于静脉内、腰穿、椎管、介入、肌内、皮下、皮内注射和输注等给药。适于给药的药物组合物包括无菌水浴液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于在临近使用前在无菌可注射溶液或分散液中配制的粉末。适宜的水性或非水性载体、 稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、甘泊、丙二醇、聚乙二醇、竣甲基纤维素、植物油和可注射的有机酶如泊酸乙醋。这些组合物还可以含有防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂等佐剂。加入等渗剂如糖类、氯化钠等可能是有利的。优选所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体，以及以所述注射液体积为基准，1 XIO5至1 X IO8个/毫升的本发明所述的方法获得的神经元样细胞。 优选所述注射液包括以所述注射液体积为基准，5 X IO5至1 X IO7个/毫升的本发明所述的方法获得的神经元样细胞。优选所述药学上可接受的载体为生理盐水。这里所述的生理盐水，是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的溶液。优选地，用于哺乳类动物和人体时是0. 85-0. 9%的氯化钠溶液。更优选0. 9%的氯化钠溶液。本发明的发明人意外地发现，神经元样细胞可以对神经元损伤和丢失进行修复 (参见实施例5)。因此本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物中提及的神经系统疾病选自脑卒中、脑性瘫痪、脑损伤、脑出血、骨髓侧索硬化症和帕金森病等中的一种或几种。使用由本发明的方法获得的神经元样细胞，处于本发明的分化培养基中，因此在制备用于治疗神经系统疾病的药物组合物之前，可以通过除去本发明的分化培养基，用生理盐水洗涤并重悬所述神经元样细胞。所述生理盐水的洗涤次数可以通过测定洗出液中残留的培养基组分来决定。将本发明的用于治疗神经系统疾病的药物组合物在注射给患者时残留的培养基组分不会引起患者不适即可。所述组合物包括IXlO5到IXlO8个/mL本发明的新的神经元样细胞；优选为lX10llj5X107f/mL。本发明还提供了本发明的方法获得的神经元样细胞在制备治疗神经系统疾病药物中的应用，优选地，本发明提供了本发明的方法获得的神经元样细胞在制备治疗脑卒中药物中的应用。本发明还提供了一种治疗神经系统疾病的方法，其包括给患者施用本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物。施用本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物的方式可以选自介入注射、腰穿、静脉注射、皮下注射和皮内注射中的一种或几种；更优选所述施用的方式为脑部立体定向介入注射。本发明所述用于治疗神经系统疾病的药物组合物优选含有IX IO5到IXlO8 细胞/mL的神经元样细胞，其每次注射给药量为0. lmL-5mL/个体；更优选地，本发明所述用于治疗神经系统疾病的药物组合物包括1 X IO6到5 X IO7个/mL的神经元样细胞，其每次注射给药量为0. lmL-2mL/个体。以上个给出了本发明所述用于治疗神经系统疾病的药物组合物每一次注射的剂量，一个疗程三次注射，每两次注射间隔一周。本发明所述用于治疗神经系统疾病的药物组合物一般在注射完第二次后的第三天到第七天起效。所述有效的标准是改良神经功能缺失评分(modified Neurological Severity Scores，mNSS)逐渐降低，脑损伤面积得到改CN 善，以减少或停止脑损伤面积为目标。一个疗程结束后，可以马上连续进行第二个疗程的治疗，也可以间隔一到三个月后进行第二个疗程的治疗以巩固疗效，一般治疗两个至四个疗程可以消除神经系统疾病病症；间隔时间为六个月或一年，患者如认为有必要，还可进行巩固疗效的治疗。优选使用本发明的方法来分离神经系统疾病患者的离体组织(例如骨髓)，所得神经元样细胞制备成本发明的药物组合物给药神经系统疾病患者自体，这样可以最大限度地避免免疫排斥反应造成的副作用。以下，对本发明的具体实施例进行说明，但本发明的技术范围不限于这些示例。实施例1 本实施例用于说明使用本发明的分化培养基从人骨髓中分离的神经干细胞分化为神经元样细胞的方法。骨髓来自45岁捐献的脑出血患者，与该患者及医院方签署了知情同意书，在其手术时采集其骨髓。将骨髓用IXPBS等体积稀释，得到骨髓稀释液，以骨髓稀释液1. 077千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)的体积比为2 1加入到50ml离心管中， 在2000rpm、25度下进行密度梯度离心20分钟，离心后收集中间层细胞，并使用IXPBS IOOOrpm离心10分钟，洗涤所得细胞三次，加入完全培养基，含10 %胎牛血清、20ng/mL人表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(美国R&D公司)的DMEM/F12培养基 (1 1)。细胞计数后，按3X105细胞/cm2的密度接种于75cm2的培养瓶中，每瓶再加入上述培养基使终体积为10ml。在37°C、5% CO2的培养箱中培养第三天后，半量换液。换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的上述培养基，每瓶加入5ml，继续在37°C、5% CO2培养。当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85%时，将培养基倾去，并将细胞通过用胰酶消化， 800rpm离心5分钟收集后在含10%胎牛血清、20ng/mL人表皮生长因子和20ng/mL碱性成纤维细胞生长因子的DMEM/F12培养基(1 1)中传代培养。同样当细胞贴壁生长达到培养瓶底面的85%时，进行消化传代培养。1瓶原代培养物可以传代三瓶，每瓶起始培养的细胞密度为2X IO5细胞/mL。三瓶75cm2培养瓶在37°C、5% CO2培养箱中培养6天后，得到贴壁并且生长达到培养瓶底面的90%的细胞。获得的神经干细胞取1瓶进行免疫荧光检测 (下面详述方法)，使用鼠抗人巢蛋白(Iiestin)IgG和鼠抗人胶质原纤维酸性蛋白(DFAP) IgG进行染色，检测结果显示mestin和DFAP都为阳性，符合神经干细胞表型特征。取上述培养好的神经干细胞，倾去培养基，每瓶加入200ug/mL柴胡皂苷α、10% 胎牛血清、20ng/mL人表皮生长因子(EGF)和50ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的神经元细胞培养基IOml进行分化培养(分化培养基)，48小时后半量换液，换液时将旧培养基缓慢吸出5ml，加入新鲜的分化培养基，每瓶加入5ml，继续在37°C、5% CO2培养。第五天神经干细胞形态发生变化，并进行半量换液，继续培养到第7天间充质基本分化为神经元样细胞。取其中1瓶细胞进行免疫荧光检测，弃去培养基，按前述条件经胰酶消化，SOOrpm 离心5分钟后，收集细胞沉淀用ImL 1XPBS(PH 7. 4的磷酸缓冲液)重悬，计数。取6份 50 μ L(每份含IX IO6个细胞)上述的传代得到细胞悬液分别接种在六孔培养板的六个孔中贴壁生长4小时，吸出培养基后用IXPBS洗涤一次，加入2%甲醛固定3分钟，用0. 5%曲通100 (Triton-100) IXPBS洗涤三次，再向六孔板的六个孔中分别加入IXPBS以及用 IX PBS稀释的鼠抗人神经丝蛋白(NF-M) IgG、鼠抗人巢蛋白(nestin) IgG、兔抗人MAP_2IgG 和鼠抗人胶质原纤维酸性蛋白(DFAP) IgG。在4度冰箱过夜进行染色/结合，之后用0.5% Triton-1001 XPBS洗涤3次，向各孔中加入用IXPBS稀释的二抗IgG-PE或IgG-FITC，在 37度下孵育lh，孵育后用IXPBS轻轻洗涤3次，洗涤完之后用90%甘油封闭。荧光显微镜下观测，结果显示，85%以上的细胞呈现神经丝蛋白(NF-M)、巢蛋白(nestin)、微管联合蛋白-2(ΜΑΡ1)表达阳性，而胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)为阴性，符合神经元样细胞的特异性特征，因而证明使用本发明的分化培养基从人骨髓来源神经干细胞能分化出高纯度的神经元样细胞。表 1不同组别神经干细胞分化为NF-M染色阳性神经元样细胞百分率
权利要求
1.一种人神经干细胞分化成神经元样细胞及其增殖的分化培养基，所述分化培养基包括液体基础培养基，其特征在于，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有l-500ug/mL的柴胡皂苷α、1_20体积％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生长因子和 5-200ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。
2.根据权利要求1所述的分化培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述分化培养基还含有5-300ug/mL的柴胡皂苷α ,5-15体积％的胎牛血清、lO-lOOng/mL的人表皮生长因子和lO-lOOng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。
3.根据权利要求2所述的分化培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有50-200ug/mL的柴胡皂苷α ,5-10体积％的胎牛血清、20-50ng/mL的人表皮生长因子和20-50ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子。
4.根据权利要求1所述的分化培养基，其中，所述液体基础培养基选自神经元细胞培养基(Neuronal Medium，NM)、BME细胞培养基、杜尔贝可改良伊格尔细胞培养基、DMEM/F12 细胞培养基、Fischer' s细胞培养基、IMDM细胞培养基、199细胞培养基、MEM细胞培养基、 FlO细胞培养基、F12细胞培养基和1640细胞培养基中的一种或几种。
5.一种将神经干细胞分化成神经元样细胞的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1-5中任意一项所述的分化培养基培养所述的人神经干细胞。
6.由权利要求1-5所述的方法得到的神经元样细胞。
7.一种制备权利要求6所述的柴胡皂苷α分化试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括1)神经干细胞基础培养基；2)柴胡皂苷α；3)细胞因子(人表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子)；4)消化细胞的酶以及；5)使用说明书。
8.一种用于治疗神经系统疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求6-7中任意一项所述的方法获得的神经元样细胞，以及和药学上可接受的载体或赋形剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为注射液，所述注射液包括药学上可接受的载体，以及以所述注射液体积为基准，1 X IO5至1 X IO8个/毫升的权利要求6-7中任意一项所述的方法获得的神经元样细胞。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述注射液包括以所述注射液体积为基准，5 X IO5至1 X IO7个/毫升的权利要求6-7中任意一项所述的方法获得的神经元样细胞。
11.根据权利要求9所述的药物组合物，其中，所述药学上可接受的载体为生理盐水。
12.根据权利要求8所述的药物组合物，其中，所述神经系统疾病选自脑卒中、脑性瘫痪、脑损伤、脑出血、骨髓侧索硬化症和帕金森病等中的一种或几种。
全文摘要
本发明提供了一种柴胡皂苷α处理人神经干细胞得到神经元样细胞及其增殖的分化培养基，所述选择培养基包括液体基础培养基，其中，以所述液体基础培养基的体积为基准，所述选择培养基还含有1-500ug/mL的柴胡皂苷α、1-20体积％的胎牛血清、5-200ng/mL的人表皮生长因子和5-200ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子；还提供了使用前述分化培养基的制备该柴胡皂苷α分化试剂盒的方法；还提供了包括前述的方法获得的神经元样细胞的用于治疗神经系统疾病的药物组合物。使用本发明的选择培养基的本发明的方法能够高效分化神经干细胞，得到神经元样细胞。本发明用于治疗神经系统疾病的药物组合物能在体内修复损伤的神经细胞，并消除神经病变。
文档编号C12N5/0797GK102363767SQ20111030796
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者沈丽, 王振光, 郝丽敏, 黄启明 申请人:北京弘润天源生物技术有限公司