专利名称：鸡马立克氏病毒Meq基因缺失疫苗株，其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种由于基因缺失得到的弱毒疫苗株，尤其涉及鸡马立克氏病病毒 Meq基因缺失疫苗株，还涉及其在制备防治鸡马立克氏病药物中的应用，属于生物医药领域。
背景技术：
鸡马立克氏病(MD，Marek' s Disease)是由感染马立克病毒(MDV，Marek' s Disease virus)引起的，是一种严重危害养禽业发展的高度传染性、肿瘤性疾病。该病可引起鸡发生多发性淋巴瘤，导致鸡只衰竭、死亡。同时损伤鸡体的免疫器官，产生严重的免疫抑制，易并发其他疾病。该病病程较长，并且发生该病后常导致整个鸡群的淘汰，一旦发生该病，损失往往特别巨大。疫苗是控制该病的主要手段，在种鸡群、蛋鸡群中MD疫苗是必须使用的疫苗，肉鸡群中使用该疫苗可以较大幅度地提高养殖效率。MD的病原-马立克氏病毒(MDV)毒力呈不断演化的趋势。近些年，随着MDV更强毒力毒株的出现，尤其是特超强毒的出现，现有的疫苗毒株，包括广泛应用的HVT、CVI988疫苗株不能对其进行良好的保护。 在我国不同地区的养鸡场中，MD疫苗免疫鸡群常有MD的发生。最近的报道表明，即使应用最新型的MDV疫苗，一些MDV强毒株也能引起免疫鸡群发生接近50%的MD死亡率。我们研究组最近几年连续从现地MD免疫失败的养鸡场分离到20多株MDV强毒株，对其中部分毒株的免疫攻毒试验表明，有些毒株可以突破HVT疫苗、HVT+SB1双价疫苗以及血清1型的CVI988疫苗的免疫保护，证明我国流行的MDV野毒的毒力在逐步的提高， 现有的所有MD疫苗均不能提供有效保护。因此，迫切需要研制新的MD疫苗毒株，以便有效防控MDV。MDV缺失某一基因后致肿瘤性丧失，而它的复制能力没有被破坏，以这种病毒研制的MD疫苗，它的免疫保护能力将非常高。近几年MDV功能基因的研究进展很快，Jarosinski 等缺失MDV RBlB株细菌人工染色体(BAC)的RL0RF4基因，发现缺失后的RBIB株在体内外的毒力减弱；Silva等将Md5株的2拷贝132bp重复序列缺失，与亲本病毒以相同方式接种SPF鸡，也无毒力减弱趋势。Reddy课题组为了研究Meq基因功能，将Md5株的Meq基因去除，构建了一株Meq基因缺失株rMd5AMeq。缺失株在体外生长稳定，同时也证明了 Meq 基因在淋巴细胞感染期是非必需的。其免疫保护效果强于现用商业化疫苗株CVI988，无论是实验室人工攻毒试验还是模拟田间试验，都能诱发高水平的免疫反应，能够抵抗Md5 (vv) 和648A(w+)的攻击。针对不同增殖能力的野毒株缺失Meq基因有很高的研究价值。目前重组MDV的构建多采用BAC技术-是将BAC载体插入至病毒基因组非必需位点，构建病毒感染性克隆。该方法也存在一些缺点，一是在病毒基因组中插入了外源基因 (BAC成分)，存在潜在的不利因素。二是病毒基因组在操作过程中，需要在原核细胞中增殖和扩增。由于MDV病毒基因组很大，在原核系统中增殖更易导致基因突变。本研究是在分析近年来本实验室从现地分离到的多株MDV流行毒株的生物学特性的基础上，选择MDV MS株为亲本毒株，采用基因工程手段，通过两次同源重组的方法获得了重组病毒株-rMSAMeq。该构建重组病毒的方法避免了采用BAC技术带来的一些不利影响。该毒株对鸡具有良好的安全性；以该毒株免疫接种鸡，可以提供高效的抗MDV免疫保护作用。该疫苗株的另外一个重要特点是带有基因缺失的遗传标记，可以据此区分疫苗毒株和野生毒株，有利于鸡群的MDV感染检测和免疫监控。同时，该基因缺失疫苗株也具有制备以其为活病毒载体构建表达其他外源蛋白的重组病毒的用途。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有弱毒疫苗的不足，提供一种可以有效预防鸡马立克氏病，并具有分子标记，利于免疫鸡群的野毒感染和免疫监控的新的鸡马立克氏病基因缺失疫苗株。用该疫苗株所制备的疫苗对目前我国流行的鸡马立克氏病病毒可以提供良好的免疫保护效果。本发明所要解决的技术问题之一是提供了一种构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，本发明的方法其特征在于所述的Meq基因缺失疫苗株是在亲本毒株 MDV MS株的基础上经两次同源重组得到的，第一次同源重组是在亲本毒株MDV MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq基因的前半部分的468bp的碱基序列得到中间体病毒株；后经第二次同源重组去掉中间体病毒株中插入的报告基因，即得所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1 所示。在本发明的一个具体实施例中，构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，具体的包括以下步骤(1)转移载体的构建参照已发表的MDV强毒GA株相关基因序列，GeneBank登录号为No. AF147806，针对Meq基因两侧的片段A、B分别设计了引物对I^rimer A和I^rimer B，片段A、B作为构建转移载体质粒的同源序列；所述的引物对Primer A和Primer B序列如下所示Primer A 上游引物5 ‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT 3，下游引物5 ‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT 3，Primer B 上游引物5 ‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC 3，下游引物5 ‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT 3，以MDV MS株基因组DNA为模板，通过PCR方法获得Meq基因片段A，经Ml I和 Sph I酶切，与pUC19连接，得到质粒pUCA ；PCR扩增得到Meq基因片段B,经Sal I和Sac I酶切后，连接到PUCA中，得到质粒pUCAB ；经Mil酶切得到的LacZ表达基因盒，连接到 pUCAB质粒中，得到质粒pALadB ；(2)第一次同源重组MDV MS株基因组总DNA与转移载体质粒pALadB共转染鸡胚成纤维细胞，在亲本毒株MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的碱基序列得到鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示；(3)第二次同源重组采用经第一次同源重组得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株的基因组总DNA与转移载体质粒pUCAB共转染鸡胚成纤维细胞，筛选得到去掉中间体病毒株中插入的报告基因的Meq基因缺失疫苗株，即得所述的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。其中所述的亲本毒株MDV MS株(参见文献马立克氏病病毒miRNA缺失株的构建及其体外生长规律，杨文闯、刘长军等，中国兽医科学.2011,41 (03))由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存提供。)该毒株的特点是(1)对鸡具有较高致病性；( 在鸡体内、外的增殖能力强；C3)感染鸡只后，鸡只发病时间早。本发明所要解决的技术问题之二是提供了由所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。及由所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株。通过本发明的具体实施例得到了一株所述的基因缺失疫苗株，命名为rMSAMeq， 建议的分类命名为禽疱疹病毒2型(Gallid herpesvirus 2)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是CGMCCNo. 4612。地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，保藏日期为2011年2月M日。本发明所要解决的技术问题之三是提供了所述的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株在制备防治鸡马立克氏病药物中的用途。本发明所要解决的技术问题之四提供了是一种疫苗组合物，其特征在于由所述的 Meq基因缺失疫苗株及药学上接受的载体或佐剂组成。本发明所要解决的技术问题之五是提供了一种用于区分本发明所述的基因缺失疫苗株和马立克氏病毒野毒株的方法，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的序列作为模板序列，通过设计引物进行PCR扩增检测。优选的，所述的引物对序列如下所示5 iGGGAAATGACAGGTGAATTGTG 3’5 iGCAGGAAAATTTGTTACCCCAG 3’本发明中的鸡马立克氏病基因缺失疫苗株的构建策略及技术特点首先，本研究采用两次重组技术进行构建。构建策略是首先应用报告基因替换掉目标缺失序列，然后再缺失掉报告基因。这种方法的优点在于在病毒基因组缺失掉目的基因的操作过程中，没有引入任何其他的外源基因序列，避免了由于外源基因片段的插入带来的负面影响。同时整个操作过程都是在真核系统下进行的，可有效提高对病毒基因组的保真性。这两方面特点， 对构建MDV的基因缺失疫苗都是非常有利的。其次，对于缺失片段的选择上，选择对主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp的碱基序列进行重组缺失。这是因为Meq基因的开放阅读框架(ORF)与一个编码23KD蛋白的ORF具有部分反向重叠，为了不影响该23KD蛋白的表达，仅缺失了 Meq基因ORF的前半部分468bp的碱基序列，破坏其0RF，而又不影响其他的基因结构。本发明获得的鸡马立克基因缺失疫苗株，可稳定遗传、对鸡无致病性，并可作为疫苗对MDV超强毒的攻击提供有效的免疫保护作用。在制备防治鸡马立克氏病疫苗中有广泛的用途。另外，本发明中的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株以及表达LacZ基因的缺失Meq基因的鸡马立克氏病基因缺失中间体病毒株，可作为活疫苗病毒载体表达其他外源蛋白。由于LacZ基因己经完全插入到鸡马立克氏病基因缺失中间体病毒株的基因组中，并能够持续表达该蛋白，LacZ基因可以直接作为反向筛选的标记，采用同源重组、基因替换的方法，插入其他外源基因，表达其他病源的蛋白，对于研制其它禽病的疫苗有较大的应用价值。因此，本发明所要解决的再一个技术问题是提供了鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株或表达LacZ基因的缺失Meq基因的鸡马立克氏病基因缺失中间体病毒株在做为活病毒载体构建表达其他外源蛋白的重组病毒中的用途。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的本发明的缺失MDV Meq基因双拷贝的重组MDV方案由以下组分组成重组病毒转移质粒构建、磷酸钙转染法进行同源重组、重组病毒蚀斑筛选纯化、重组病毒鉴定及生物学特性分析。本发明中缺失MDV Meq基因双拷贝的疫苗株制备，包括以下步骤1、重组病毒转移载体质粒构建设计并合成用于扩增同源臂和重组病毒鉴定引物，通过PCR方法获得Meq基因缺失位置的上、下游同源臂A、B片段后，将A片段和B片段依次克隆至pUC19质粒中，得到质粒 pUC-AB,将LacZ表达盒连接至阳性质粒pUC_AB中，经PCR和酶切鉴定，得到质粒pALacZB。 由此构建得到了 2个转移载体质粒pUC-AB、pALacZB，用于构建重组病毒。2、磷酸钙转染法进行同源重组MDV MS株基因组总DNA与转移载体质粒DNA用磷酸钙沉淀法共转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。具体方法如下将长成单层的CEF，消化后传代至细胞培养皿。于无菌1. 5mL离心管中加入去离子水、MS株感染的CEF基因组总DNA、质粒pALacZB、TE缓冲液、2mol -L^1CaCl2 混勻后，再缓缓加入2XHEPES，孵育30min包装成细小颗粒后，重悬，加入到制备好的CEF次代细胞，培养池后，进行休克处理。培养至出现MDV典型蚀斑后，进行蚀斑克隆和纯化。3、重组病毒蚀斑筛选纯化用磷酸钙沉淀法共转染CEF，培养至出现MDV典型蚀斑后，加入X-Gal，进行蓝白斑筛选。选择蓝色蚀斑进行克隆纯化，经10轮蚀斑纯化，最终形成的蚀斑全部为蓝色。经测序鉴定正确病毒，纯化后命名为rMS-LaCZAMeq。在此基础上进行第二次重组去掉LacZ， 命名为rMSAMeq。4、重组病毒鉴定按常规方法提取rMS Δ Meq感染CEF总DNA，用引物LadB进行鉴定，MS株不能扩增出结果，rMSAMeq株扩增结果与预期相符，证明了 LacZ重组的位置正确。用引物ALB鉴定，亲本MS株扩增大小为656bp，重组rMS AMeq约4400bp，与预期相符。从而证明重组病毒rMS Δ Meq的两个Meq基因均已缺失。5、生物学特性分析5. 1遗传稳定性在相同的培养条件下，分别培养亲本病毒MS株和重组病毒rMS Δ Meq株，显微镜下观察2毒株体外生长特性，观察主要指标有蚀斑大小、折光性、形状和形态的变化情况。纯化后的重组毒在CEF上连续继传10代，每一代次均用X-Gal染色，观察蚀斑是否均为蓝色。 在病毒传代至5和10代时，用检测引物进行PCR检测，检测重组病毒rMS ΔMeq的两个Meq 基因是否已缺失。
5. 2增殖特性为分析病毒在体内外的增殖特性，将亲本病毒MS株和重组病毒rMSAMeq株分别接种SPF鸡及CEF，24孔细胞培养板每孔10PFU，SPF鸡2000PFU/只，，接种的细胞分别于接种后1、2、3、4、5和7d后收集细胞，SPF鸡于接种后1、2、3、4、6周，采集羽髓，提取羽髓，提取细胞及羽髓DNA，进行实时荧光定量PCR检测羽髓中的病毒含量，绘制病毒生长的动力学曲线，分析病毒的生长规律。5. 3对鸡的致病性将SPF鸡随机分成两组，第一组腹腔接种重组病毒rMS Δ Meq每只20000PFU，第二组接种等量0. 2mL PBS作为阴性对照。接种后每天观察鸡的精神状态和有无马立克氏病临床症状，15周龄后全部剖杀，观察实验鸡只有无MD症状皮肤、坐骨神经、腺胃、肝脏、肾脏、 脾、法式囊、胸腺等组织有无病变，并将分离组织进行病理学检测。5. 4抗马立克氏病病毒免疫原性分析分析该重组病毒的免疫原性，将其与国内疫苗株814株进行攻毒保护实验分析， 即将重组病毒rMS Δ Meq与814毒株接种1日龄SPF鸡，接种后7天接种超强毒Md5进行攻毒，每天观察并记录实验鸡只临床症状、死亡情况及实验期内鸡只的体重变化情况，并计算疫苗保护指数。
图1为本发明提供的载体质粒pALadB示意图；图2为本发明提供的质粒pALadB酶切鉴定结果；图3为本发明提供的重组病毒rMS-LacZ AMeq在CEF上的蚀斑染色结果；图4为本发明提供的重组病毒rMS-LacZ AMeq的Meq基因缺失的PCR鉴定结果；图5为本发明提供的重组病毒基因组Meq基因拷贝数PCR鉴定结果；图6为本发明提供的重组病毒rMS Δ Meq及亲本病毒的Meq基因PCR鉴定结果；图7为本发明提供的亲本毒MS与重组毒株rMS在CEF上生长曲线检测结果；图8为本发明提供的重组病毒在鸡羽髓中的复制能力的实时荧光定量PCR检测结果；图9为本发明提供的重组病毒免疫保护效率试验结果。
具体实施例方式以下通过实施例进一步阐明本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。实施例1重组病毒转移质粒构建1、试验材料MDV MS株(参见文献马立克氏病毒miRNA缺失株的构建及其体外生长规律，杨文闯、刘长军等，中国兽医科学.2011，41(03))、MDVMd5(参见文献马立克病毒超强毒株(Md5、RB1B)毒力试验，甘军纪刘秀梵吴长新，中国畜牧兽医学会禽病学分会第十一次学术研讨会论文集.2002)、鸡马立克病病毒814株(参见文献鸡马立克病病毒814 株gE、gI、gp82基因的克隆及序列分析.张艳萍，刘长军等.动物科学进展，2007 (3))由哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存，提供；无特定病原体(SPF)鸡胚、鸡由哈尔滨兽医研究所动物中心提供；大肠杆菌DH5 α为哈尔滨兽医研究所实验动物中心保存。PUC19购买自TaKaRa (大连)公司。2、试验方法1)引物的设计与合成参照已发表的MDV强毒GA株相关基因序列(No. AF147806)，分别设计了引物对I^rimer A和I^rimer B，针对Meq基因两侧的片段A、B作为构建转移载体质粒的同源序列。引物对LacZB的上游在LacZ基因上，下游在重组臂B上， 用于鉴定是否重组；引物对ALB的上游在重组臂A上，下游在重组臂B上，用于鉴定缺失位置与个数。若引物ALB扩增大小若为660bp，表明Meq基因没有缺失，若扩增大小为4288bp 表明LacZ插入预定位置；引物Meq的上游、下游分别位于Meq基因的两侧，用于重组载体 rMS-LacZAMeq的PCR鉴定，对于亲本病毒MS株的检测，由于meq基因完整，因此扩增片段大小约为1.4Kb，对于重组毒株rMSΔMeq其缺失了 468bp(SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列， 缺失的鸡马立克氏病毒Meq基因核苷酸序列，具体如下5 ‘CGGTACAGGTGTAAAGAGATGTCTCAG GAGCCAGAGCCGGGCGCTATGCCCTACAGTCCCGCTGACGATCCGTCCCCCCTCGATCTTTCTCTCGGGTCGACTTCG AGACGGAAAAAAAGGAAAAGTCACGACATCCCCAACAGCCCCTCCAAACACCCCTTCCCTGACGGCCTATCTGAGGA GGAGAAACAGAAGCTGGAAAGGAGGAGAAAAAGGAATCGTGACGCCGCTCGGAGAAGACGCAGGGAGCAGACGTACT ATGTAGACAAACTCCATGAAGCATGTGAAGAGCTGCAGAGGGCCAATGAACACCTACGTAAGGAAATTCGAGATCTA AGGACTGAGTGCACGTCCCTGCGTGCACAGTTGGCTTGTCATGAGCCAGTTTGCCCTATGGCGGTACCCCTAACGGT GACCCTTGGACTGCTTACCGCCCCGCACGATCCCGTTCCTGAACCTCCCATTTGC 3，)，扩增结果约为 Ikb。 引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物名称及序列如表1所示表1本发明提供的构建重组病毒的引物序列
权利要求
1.一种构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于所述的Meq 基因缺失疫苗株是在亲本毒株MDV MS株的基础上经两次同源重组得到的，第一次同源重组是在亲本毒株MDV MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq 基因的前半部分的468bp的碱基序列得到中间体病毒株；后经第二次同源重组去掉中间体病毒株中插入的报告基因，即得所述的Meq基因缺失疫苗株，所述的Meq基因的前半部分 468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.如权利要求1所述的构建鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株的方法，其特征在于具体的包括以下步骤(1)转移载体的构建参照已发表的MDV强毒GA株相关基因序列，GeneBank登录号为No. AF147806，针对Meq 基因两侧的片段A、B分别设计了引物对ft~imer A和ft~imer B，片段A、B作为构建转移载体质粒的同源序列；所述的引物对I^rimer A和I^rimer B序列如下所示 Primer A 上游引物5 ‘CCGGCATGCGCCCTCCGTATAATGTAAAT 3，下游引物5 ‘GTCGACTGCCCGCCTTCTCCCTGGTAT 3’ Primer B 上游引物5 ‘GTCGACACTCCTCCACCTCCCTCAC 3，下游引物5 ‘GCGAGCTCGAATGTCCATCCTGTTATCT 3’ 以MDV MS株基因组DNA为模板，通过PCR方法获得Meq基因片段A，经Mil和Sph I 酶切，与PUC19连接，得到质粒pUCA ；PCR扩增得到Meq基因片段B，经Ml I和I酶切后，连接到PUCA中，得到质粒pUCAB ；经Mil酶切得到的LacZ表达基因盒，连接到pUCAB质粒中，得到质粒PALacZB ；(2)第一次同源重组MDVMS株基因组总DNA与转移载体质粒pALadB共转染鸡胚成纤维细胞，在亲本毒株MS株的基础上通过插入报告基因IacZ并同时替换主要致瘤基因Meq 基因的前半部分468bp的碱基序列得到鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株，所述的Meq基因的前半部分468bp的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示；(3)第二次同源重组采用经第一次同源重组得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株的基因组总DNA与转移载体质粒pUCAB共转染鸡胚成纤维细胞，筛选得到去掉中间体病毒株中插入的报告基因的Meq基因缺失疫苗株，即得所述的鸡马立克氏病病毒 Meq基因缺失疫苗株。
3.由权利要求1或2所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株。
4.如权利要求3所述的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株，其特征在于所述的 Meq基因缺失疫苗株为rMSAMeq，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏编号是CGMCC No. 4612。
5.如权利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制备防治鸡马立克氏病药物中的用途。
6.如权利要求3或4所述的Meq基因缺失疫苗株在制备以其为活病毒载体构建表达其他外源蛋白的重组病毒中的用途。
7.由权利要求1或2所述的方法制备得到的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失中间体病毒株。
8.如权利要求7所述的Meq基因缺失中间体病毒株在制备以其为活病毒载体构建表达其他外源蛋白的重组病毒中的用途。
9.一种疫苗组合物，其特征在于由有效量的权利要求3或4所述的基因缺失疫苗株及药学上接受的载体或佐剂组成。
10.一种用于区分权利要求3或5所述的基因缺失疫苗株和马立克氏病毒野毒株的方法，其特征在于以SEQ ID NO. 1所示的序列作为模板序列，通过设计引物进行PCR扩增检测，优选的所述引物对序列如下所示 iGGGAAATGACAGGTGAATTGTG 3' 5 iGCAGGAAAATTTGTTACCCCAG 3’。
全文摘要
本发明公开了鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株、其构建方法及应用。本发明的鸡马立克氏病病毒Meq基因缺失疫苗株rMSΔMeq株，微生物保藏号是CGMCC No.4612，其是在亲本毒株MDV MS株的基础上，经两次同源重组缺失主要致瘤基因Meq基因的前半部分468bp碱基序列而得到。本发明还涉及该基因缺失疫苗株在制备防治鸡马立克氏病药物中的应用以及针对该基因缺失毒株的缺失基因序列研制的可用于区分疫苗毒株与鸡马立克氏病毒野毒株的检测及诊断方法。本发明基因缺失疫苗株安全性好，对于鸡马立克氏病具有良好的免疫保护效力，可应用于制备防控鸡马立克氏病病毒的单苗或联苗等。
文档编号C12Q1/70GK102363769SQ20111030783
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月12日 优先权日2011年10月12日
发明者刘长军, 张艳萍, 李志杰 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所